Enzymatische Synthese von epoxidierten Metaboliten von Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic und Arachidonsäuren

Zusammenfassung

Wir präsentieren eine Methode, die für die großflächige enzymatische Synthese und Reinigung spezifischer Enantiomere und Regioisomere von Epoxiden von Arachidonsäure (AA), Docosahexaensäure (DHA) und Eicosapentaensäure (EPA) unter Verwendung eines bakteriellen Cytochroms nützlich ist. P450-Enzym (BM3).

Zusammenfassung

Die epoxidierten Metaboliten verschiedener mehrfach ungesättigter Fettsäuren (PUFAs), die als Epoxidfettsäuren bezeichnet werden, haben eine Vielzahl von Rollen in der menschlichen Physiologie. Diese Metaboliten werden endogen durch die Cytochrom-P450-Klasse von Enzymen hergestellt. Aufgrund ihrer vielfältigen und starken biologischen Wirkung besteht ein erhebliches Interesse an der Untersuchung dieser Metaboliten. Die Bestimmung der einzigartigen Rolle dieser Metaboliten im Körper ist eine schwierige Aufgabe, da die Epoxidfettsäuren zunächst in signifikanten Mengen und mit hoher Reinheit erhalten werden müssen. Die Gewinnung von Verbindungen aus natürlichen Quellen ist oft arbeitsintensiv, und lösliche Epoxidhydrolasen (sEH) hydrolysieren die Metaboliten schnell. Andererseits ist die Erlangung dieser Metaboliten über chemische Reaktionen sehr ineffizient, da es schwierig ist, reine Regioisomere und Enantiomere, niedrige Erträge und eine umfangreiche (und teure) Reinigung zu erhalten. Hier präsentieren wir eine effiziente enzymatische Synthese von 19(S), 20(R)- und 16(S),17(R)-epoxydocosapentaennoic acids (EDPs) aus DHA via Epoxidation mit BM3, einem bakteriellen CYP450-Enzym, das ursprünglich aus Bacillus isoliert wurde Megaterium (das leicht in Escherichia coliausgedrückt wird). Die Charakterisierung und Bestimmung der Reinheit erfolgt mit DerKernspinresonanzspektroskopie (NMR), der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) und der Massenspektrometrie (MS). Dieses Verfahren veranschaulicht die Vorteile der enzymatischen Synthese von PUFA-Epoxid-Metaboliten und ist auf die Epoxidation anderer Fettsäuren anwendbar, einschließlich Arachidonsäure (AA) und Eicosapentaensäure (EPA), um die analoge epoxyeicosatrienoische Säuren (EETs) bzw. Epoxyeicosatetraenosäuren (EEQs).

Einleitung

Da das Interesse an der Rolle, die mehrfach ungesättigte Fettsäuren (insbesondere Omega-3 und Omega-6 mehrfach ungesättigte Fettsäuren) in der menschlichen Biologie spielen, in den letzten Jahren zugenommen hat, haben Forscher die breite Palette attraktiver Vorteile, die ihre Metaboliten ausstellen. Insbesondere Epoxid-Fettsäure-Metaboliten, die von der Cytochrom-P450-Klasse von Enzymen produziert wurden, waren ein großer Schwerpunkt. Beispielsweise spielen viele PUFA-Epoxide, einschließlich Epoxyeicosatrienosäuren (EETs), Epoxydocosapentaensäuren (EDP) und Epoxyeicosatetraenosäuren (EEQs), eine entscheidende Rolle bei der Regulierung von Blutdruck und Entzündungen^{1,2 , 3 , 4 , 5}. Interessanterweise haben die spezifischen Enantiomere und Regioisomere von AA- und EPA-Epoxiden bekanntlich unterschiedliche Auswirkungen auf die Vasokonstriktion^6,7. Während die physiologischen Wirkungen der Enantiomere und Regioisomere von EETs und EEQs dokumentiert sind, ist wenig über die Wirkung der analogen Epoxidokanosäuren (EDP) aus DHA bekannt. Die weitverbreitete Verwendung von Fischöl⁸, das sowohl an EPA als auch an DHA reich ist, hat ebenfalls das Interesse an DEN EDP⁹geweckt. Die Vorteile dieser Ergänzungen werden geglaubt, um teilweise aufgrund der nachgelagerten DHA-Metaboliten (16,17-EDP und 19,20-EDP ist die am häufigsten vorkommende), weil in vivo Niveaus von EDP sehr gut mit der Menge an DHA in der Ernährung^{10 , 11}.

Die Untersuchung der Mechanismen und Ziele dieser Epoxidfettsäuren durch Metabolomik, chemische Biologie und andere Methoden hat sich als herausforderunglich erwiesen, zum Teil, weil sie als Mischungen von Regio- und Stereo-Isomeren existieren, und eine Methode zur Gewinnung reiner Mengen der Enantiomere und Regioisomer erforderlich sind. Herkömmliche Mittel zur chemischen Synthese dieser Verbindungen haben sich als unwirksam erwiesen. Die Verwendung von Peroxysäuren wie Meta-Chloroperoxybenzoesäure für die Epoxidation hat viele Nachteile, insbesondere den Mangel an Epoxidationsselektivität, der eine teure und sorgfältige Reinigung einzelner Regioisomere und Enantiomere erfordert. Die Gesamtsynthese von DHA- und EPA-Metaboliten ist möglich, leidet aber auch unter Nachteilen, die es für großflächige Syntheseen wie hohe Kosten und niedrige Erträge^12,13machen. Effiziente Gesamtproduktion kann mit enzymatischer Synthese erreicht werden, da enzymatische Reaktionen regio- und stereoselektiv sind¹⁴. Studien zeigen, dass die enzymatische Epoxidation von AA und EPA (mit BM3) sowohl regioselektiv als auch enantioselektiv^{ist 15,16,17,18}, aber dieses Verfahren wurde nicht mit DHA oder an einem großen skala. Das übergeordnete Ziel unserer Methode war es, diese chemoenzymatische Epoxidation zu skalieren und zu optimieren, um schnell signifikante Mengen an reinen Epoxidfettsäuren als ihre individuellen Enantiomere zu produzieren. Mit der hier vorgestellten Methode haben Forscher Zugang zu einer einfachen und kostengünstigen Strategie für die Synthese von EDV und anderen PUFA-Epoxidmetaboliten.

Protokoll

VORSICHT: Bitte konsultieren Sie alle relevanten Materialsicherheitsdatenblätter (MSDS), bevor Sie die aufgeführten Chemikalien verwenden.

1. Ausdruck des Wildtyps BM3

1. Inokulat pBS-BM3 transfizierte DH5- E. coli (eine großzügige Spende von Dr. F. Ann Walker) in 5 ml steriler LB-Brühe mit 0,5 mg Ampicillin in einem 20 ml Kulturrohr.
2. Die Zellkultur in einem Shaker bei 37 °C für 24 h bei 200 Umdrehungen pro Minute inkubieren. Fügen Sie die Nachtstarterkultur (5 ml) und 100 mg Ampicillin zu 1 L steriler LB-Brühe in einem Fernbach- oder Erlenmeyerkolben hinzu. Bei 37 °C bei 200 Umdrehungen von 200 Umdrehungen/ minute schütteln, dann bei 30 °C für 18 h bei 200 Rpm.
3. Sammeln und zentrifugieren Sie die Zellkultur bei 4 °C für 10 min bei 1.000 x g. Entsorgen Sie den Überstand und lagern Sie das Zellpellet bei -78 °C bis zur Enzymreinigung.
   HINWEIS: Der Überstand kann entweder durch Behandlung mit Bleichmittel chemisch sterilisiert oder mit einem Autoklaven sterilisiert und dann in den Abfluss gegossen werden.

2. Reinigung von BM3.

1. Zelllyse
   1. Das Zellpellet auf Eis auftauen und in 40 ml eiskaltem (4 °C) Löslichkeitspuffer (10 mM Tris, 0,01 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF;), 0,01 mM EDTA; pH 7,8) wieder aufhängen.
      VORSICHT: PMSF ist durch Kontakt toxisch.
   2. Während auf dem Eis, beschallen Sie die Zellen für 1 min mit einem Ultraschall-Homogenisator (Ausgangsleistungseinstellung 10, Zoll 100%), gefolgt von einem 1 min Bruch auf Eis, um die Zellen zu lysieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang 6 Mal. Zentrifugieren Sie die Zelle bei 4 °C für 30 min bei 11.000 x g zu Pelletzellablagerungen.
2. Affinitätschromatographie
   1. Bereiten Sie eine starke Anionenaustauschchromatographie-Säule (siehe Materialtabelle;Durchmesser: 2,8 cm x 6 cm, Säulenvolumen: 37 ml) durch Waschen mit 5 Säulenvolumen (CV) Puffer A (10 mM Tris, pH 7,8) bei 4 °C vor.
   2. Fügen Sie die Zelle lysiert zu ausgeglichenen Spalte und waschen Sie die Säule mit 3 CV Kaltpuffer A. Elute die BM3 durch Waschen der Säule mit Kaltpuffer B (10 mM Tris, 600 mM NaCl, 6 CV).
   3. Sammeln Sie die rötlich-braune Eluentenfraktion. Wenn das Protein nicht sofort verwendet wird, mischen Sie es mit einem gleichen Volumen von Glycerin und Blitz einfrieren mit flüssigem Stickstoff. Bewahren Sie die tiefgefrorene Lösung bei -78 °C auf.

3. Epoxidation von DHA durch BM3

1. Bereiten Sie die Reaktion vor, indem Sie 0,308 g (0,940 mmol) DHA in 18,8 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) zu 2 L Rührreaktionspuffer (0,12 m Kaliumphosphat, 5 mM MgCl₂, pH 7,4) zusammen mit 20 nM des aufgetauten BM3-Enzyms hinzufügen. Die Enzymkonzentration kann durch die Kohlenmonoxid/Dithionit-Spektral-Assay-Methode¹⁹bestimmt werden.
2. Während die Lösung rührt, beginnen Sie die Reaktion, indem Sie 1 Äquivalent von NADPH (Nicotinamid Adenin-Dinukleotid-Phosphat reduziert, Tetranatriumsalz, 0,808 g, 0,940 mmol) im Reaktionspuffer gelöst. Rühren Sie die Reaktion für 30 min, während Luft durch das Reaktionsgemisch mit einem luftgefüllten Ballon an einer Spritze und Nadel befestigt.
3. Mit Einem Spektralphotometer (siehe Materialtabelle)wird die Absorption des Reaktionsgemisches bei 340 nm überprüft, um festzustellen, ob NADPH erschöpft ist. Wenn keine Restabsorption vorhanden ist, die den Verbrauch von NADPH anzeigt, ist die Reaktion vollständig.
   HINWEIS: In der Regel ist die Reaktion nach 30 min abgeschlossen.
4. Das Reaktionsgemisch durch langsames Hinzufügen von 1 M Oxalsäure tropfenweise ablöschen, bis der pH-Wert der Lösung 4 erreicht.

4. Extraktion von EDP

1. Extrahieren Sie die abgeschreckte Pufferlösung mit 2 L Diethylether (wasserfrei, peroxidfrei) 3 mal. Die Ätherschicht (6 l) sammeln und mit wasserfreiem Magnesiumsulfat (MgSO₄₎trocknen.
2. Filtern Sie das MgSO₄ aus der Lösung und konzentrieren Sie die getrocknete Ätherschicht auf einen Rotationsverdampfer, um den rohen EDP-Rückstand zu erhalten.
3. Reinigen Sie den Rückstand durch Blitzsäulenchromatographie (eine 40 g Kieselsäurepatrone ist ausreichend). Beginnen Sie bei 10% Ethylacetat (EtOAc) in Hexanen und fahren Sie bis zu 60% EtOAc in Hexanen über 22 min.
   HINWEIS: Drei hauptgipfel werden erhalten und gesammelt, Eluing in der Reihenfolge 1. unreagierte DHA; 2. Mischung von EDP-Isomeren; und 3. Diepoxid (normale Überoxidationsprodukte (siehe Abbildung 1)).
4. Kombinieren Sie die Fraktionen und konzentrieren Sie sie auf den Rotationsverdampfer. Aus diesem Beispiel 0,074 g, (24%) von unreagiertem DHA, 0,151 g (47%) von EDP-Isomen und 0,076 g( 22%) Diepoxid erhalten wurden.

5. Veresterung von EDP, Trennung von 16(S), 17(R)- und 19(S),20(R)-EDP und Verseifung von Estern

VORSICHT: Trimethylsilyldiazomethan (TMS-Diazomethan) ist sowohl durch Kontakt als auch durch Einatmen sehr giftig. Nur in einer Dunstabzugshaube mit der richtigen persönlichen Schutzausrüstung verwenden.

1. Die Epoxide (0,151 g, 0,435 mmol) in einem rundgrundkolben oder kleinen Durchstechflasche mit 2 ml wasserfreiem Methanol (MeOH) und 3 ml wasserfreiem Toluen verdünnen, einen Rührstab hinzufügen und TMS-Diazomethan (1,2 Moläquivalente oder 0,26 ml einer 2-M-Lösung in Hexanes) unter
2. Warten Sie 10 min und fügen Sie zusätzliche TMS-Diazomethan (0,050 ml) hinzu, bis eine blassgelbe Farbe verbleibt.
3. Nach 30 min die Mischung mit dem Rotationsverdampfer sorgfältig konzentrieren und den Rückstand durch Blitzsäulenchromatographie reinigen. Elute mit 4% EtOAc in Hexanen (mit einer 40 g Kieselgelsäule oder Kartusche) für 22 min. In diesem Beispiel wurde 19,20-EDP-Methylester (0,116 g, 74%) und 16,17-EDP-Methylester (0,029 g, 19 %) wurden als Klare Öle (Gesamtertrag, 93 %) gewonnen.
4. Sammeln Sie die Fraktionen, die die gereinigten EDP-Methylester-Regioisomere enthalten. 19(S),20(R)-EDP Methylester eluiert zuerst, gefolgt von 16(S),17(R)-EDP Methylester.
5. Bleiben gemischte Fraktionen (die beide Isomere enthalten; können durch Dünnschichtchromatographie (TLC) in 8:1 Hexan/EtOAc beurteilt und mit Kaliumpermanganat (KMnO₄) gefärbt), rechromatographieren Sie sie mit dem gleichen Lösungsmittelsystem wie zuvor.
6. Konzentrieren Sie die Fraktionen, die die einzelnen Regioisomere enthalten.
   HINWEIS: An dieser Stelle können Identität und Reinheit durch NMR bewertet werden (mit CDCl₃ als Lösungsmittel; siehe die Legende für Abbildung 2).
7. Um einzelne EDV-Methylester-Regioisomen in ihre Säureformen umzuwandeln, verdünnen Sie den EDV-Ester in THF:Wasser (ca. 0,7 ml/0,1 mmol Ester). 2 M wässrige LiOH (3 Moläquivalente) hinzufügen und über Nacht umrühren.
   HINWEIS: Die Vollständigkeit der Reaktion kann durch TLC mit 3:1 Hexanen/EtOAc, Färbung mit KMnO₄bewertet werden; das Produkt hat einen Retentionsfaktor von 0,3 €.
8. Die Reaktion langsam mit Ameisensäure ablöschen, bis der pH-Wert der Mischung 3-4 erreicht. Wasser und Ethylacetat (1-2 ml/0,100 mmol Ester) hinzufügen und die Schichten trennen. Die Wasserschicht mit EtOAc (3 x 5 ml) abziehen, mit gesättigter Sole (NaCl)-Lösung waschen und die EtOAc-Schicht über wasserfreies Natriumsulfat trocknen (Na₂SO₄).
9. Die Ethylacetatlösung mit einem Rotationsverdampfer konzentrieren, Hexane (10 ml) hinzufügen und wieder konzentrieren. Zweimal wiederholen, um azeotropisch Restameisensäure zu entfernen. Reinigen Sie den Rückstand durch Blitzsäulenchromatographie, Eluing mit 10-30% EtOAc über 15 min.
10. Die gewünschten Fraktionen konzentrieren und im Vakuum trocknen, um sich die gereinigte Säure leisten zu können.
    HINWEIS: In diesem Stadium kann die enantiomere Reinheit beurteilt werden (durch chirale HPLC siehe die Legenden für Abbildung 3 - Abbildung 4 für Spalte und Bedingungen). Die chemische Reinheit kann mit C18 (achiral) HPLC beurteilt werden (siehe Materialtabelle und Referenz 14).

Ergebnisse

Das Blitzsäulenchromatogramm (durchgeführt mit einem automatisierten Blitzreinigungssystem, wie unten beschrieben), das bei der Reinigung des Rohgemischs aus enzymatischer Epoxidation erhalten wurde, ist in Abbildung 1dargestellt. Nach Veresterung und Trennung der Regioisomerewurden reine 16( S), 17(R)-EDP und 19(S),20(R)-EDP Methylester erhalten. In der Regel sind sie in einem ungefähren Verhältnis von 1:4bis ...

Diskussion

Wir präsentieren hier eine operativ einfache und kostengünstige Methode zur Vorbereitung der beiden am häufigsten vorkommenden Epoxidmetaboliten von DHA - 19,20 und 16,17-EDP. Diese Epoxidfettsäuren können in hochenantiopurer (als S,R-Isomere) Form mit Wildtyp-BM3-Enzym hergestellt werden. Im Folgenden werden mehrere kritische Punkte beschrieben, die zur Fehlerbehebung verwendet werden können, und die Erweiterung unserer Methode zur Herstellung von enantiopuren Epoxidmetaboliten von AA und EPA.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ammonium Bicarbonate	Sigma	9830	NA
Ampicillin	GoldBio	A30125	NA
Anhydrous magnesium sulfate	Fisher Scientific	M65-3	NA
Anhydrous methanol	Sigma-Aldrich	322515	NA
Anhydrous sodium sulfate	Fisher Scientific	S421-500	NA
Anhydrous toluene	Sigma-Aldrich	244511	NA
Arachidonic Acid (AA)	Nu-Chek Prep	U-71A	Air-sensitive.
Diethyl Ether	Sigma	296082	NA
DMSO (molecular biology grade)	Sigma-Aldrich	D8418	NA
Docosahexaenoic Acid (DHA)	Nu-Chek Prep	U-84A	Air-sensitive.
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	Invitrogen	15576028	NA
Eicosapentaenoic Acid (EPA)	Nu-Chek Prep	U-99A	Air-sensitive.
Ethyl acetate	Sigma	34858	NA
Flash column cartridges 25, 40, 4, 12 g sizes	Fisher Scientific	145170203, 145154064, 5170200	Alternatively, conventional column chromatography can be used
Formic acid (HPLC Grade)	J.T. Baker	0128-01	NA
Glycerol	Sigma	G7757	NA
Hexanes	VWR	BDH24575	NA
LB Broth	Sigma	L3022	NA
Lithium hydroxide	Sigma-Aldrich	442410	NA
Magnesium chloride	Fisher Scientific	2444-01	NA
Methanol (HPLC grade)	Sigma-Aldrich	34860-41-R	NA
NADPH Tetrasodium Salt	Sigma-Aldrich	481973	Air-sensitive.
Oxalic acid	Sigma-Aldrich	194131	NA
pBS-BM3 transfected DH5α E. coli	NA	NA	NA
PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride)	Sigma	P7626	Toxic!
Potassium Permanganate	Sigma-Aldrich	223468	For TLC staining.
Potassium phosphate dibasic	Sigma	795496	NA
Potassium phosphate monobasic	Sigma	795488	NA
Q Sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare life sciences)	Fisher Scientific	17-0515-01	For anion exchange purification of enzyme
Sodium Chloride	Sigma	71376	NA
Tetrahydrofuran, anhydrous	Sigma-Aldrich	186562	NA
TMS-Diazomethane (2.0 M in hexanes)	Sigma-Aldrich	362832	Very toxic.
Tris-HCl	GoldBio	T-400	NA
Also necessary:
Automatic flash purification system (we used a Buchi Reveleris X2)	Buchi
C18 HPLC column (Zorbax Eclipse XDB-C18)	Agilent
Centrifuge capable of 10,000 x g
Chiral HPLC Column (Lux cellulose-3), 250 x 4.6 mm, 5 µM, 1000 Å)	Phenomenex
General chemistry supplies: a 2 L separatory funnel, beakers and Erlenmeyer flasks with 1000-2000 L capacity, 20 mL vials, HPLC vials, small round-bottomed flasks and stir-bars.
HPLC (we use a Shimadzu Prominence LC-20AT analytical pump and SPD-20A UV-vis detector	Shimadzu
Nanodrop 2000 Spectrophotometer	Thermo-Fisher Scientific
NMR	NMR: Agilent DD2 spectrometer (500 MHz)
Rotary evaporator	Buchi
Sonic dismembrator or ultrasonic homogenizer	Cole-Parmer