Dokosahexaenoic, eicosapentaenoic ve Arachidonik asitlerin Epoxilenmiş metabolitlerinin enzimatik sentezini

Özet

Biz bir yöntem büyük ölçekli enzimatik sentez ve spesifik enantiomerler ve arachidonik asit (AA), dokosahexaenoik asit (DHA) ve eicosapentaenoik asit (EPA) epoksitler regioisomers arıtma için yararlı bir bakteriyel sitokrom kullanımı ile P450 enzim (BM3).

Özet

Çeşitli çoklu doymamış yağ asitleri (PUFAs), epoksi yağ asitleri olarak adlandırılan, epifon metabolitleri, insan fizyolojisinde rolleri geniş bir yelpazede vardır. Bu metabolitler enzimlerin sitokrom P450 sınıfı ile Endogenously üretilmektedir. Onların farklı ve güçlü biyolojik etkileri nedeniyle, bu metabolitleri okumaya önemli ilgi vardır. Epoksi yağ asitleri ilk olarak önemli miktarlarda elde edilmelidir ve yüksek saflık ile vücutta bu metabolitlerin benzersiz rolleri belirlenmesi, zor bir iştir. Doğal kaynaklardan bileşikler elde genellikle emek yoğun, ve çözünür epokid Hidrolazlar (sEH) hızla metabolitleri hidrolize. Öte yandan, bu metabolitleri kimyasal reaksiyonlar yoluyla elde etmek, saf regioisomers ve enantiomers, düşük verim ve geniş (ve pahalı) arıtma alma zorluk nedeniyle çok verimsizdir. Burada, bir verimli enzimatik sentezi mevcut 19 (s), 20 (r)-ve 16 (s), 17 (r)-epoxydocosapentaenoic asitler (EDPS) DHA ile epizidasyon yoluyla bm3, bir bakteriyel CYP450 enzim orijinal Bacillus gelen izole megateryum (Bu kolayca Escherichia coliifade edilir). Karakteristik ve saflık belirlenmesi nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (NMR), yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) ve kütle spektrometresi (MS) ile gerçekleştirilir. Bu prosedür, PUFA epoksi metabolitlerinin enzimatik sentezi yararları gösterir ve diğer yağ asitleri, arachidonik asit (AA) ve eicosapentaenoik asit (EPA) dahil olmak üzere, epoksitizi için uygulanabilir asitler (EETs) ve epoxyeicosatetraenoic asitler (EEQs), sırasıyla.

Giriş

İnsan biyolojisinde çok doymamış yağ asitleri (özellikle Omega-3 ve Omega-6 çoklu doymamış yağ asitleri) oynamak rol ilgi son yıllarda büyüdü, araştırmacılar çekici faydaları geniş haber aldı ki onların metabolitleri Sergi. Özellikle, sitokrom P450 enzimlerin sınıfı tarafından üretilen epoksi yağ asidi metabolitleri odak büyük bir noktası olmuştur. Örneğin, birçok PUFA epoxides, epoxyeicosatrienoic asitler (Eets) dahil olmak üzere, epoxydocosapentaenoic asitler (EDPS) ve epoxyeicosatetraenoic asitler (eeqs), kan basıncı ve inflamasyon düzenlenmesi kritik bir rol oynar^{1,2 , 3} ' ü ^{, 4 , 5}. ilginçtir, AA ve EPA epoksitler spesifik enantiomerler ve regioisomers vazokonstriksiyon üzerinde değişen etkileri olduğu bilinmektedir^6,7. Enantiomerler ve EETs ve EEQs regioisomers fizyolojik etkileri belgelenmiş iken, az benzer epoxydocosapentaenoic asitler (EDPs) etki DHA oluşan etkisi hakkında bilinmektedir. Balık yağı yaygın kullanımı⁸, EPA ve DHA hem de zengin olan, ayrıca EDPS ilgi karıştırmıştır⁹. Bu takviyeleri faydaları kısmen aşağı DHA metabolitleri nedeniyle olduğuna inanılmaktadır (16, 17-EDP ve 19, 20-EDP en bol olmak) çünkü EDPs in vivo seviyeleri diyet DHA miktarı ile çok iyi koordine^{10, 11}' den itibaren.

Bu epoksi yağ asitlerinin metabolomics, kimyasal biyoloji ve diğer yöntemlerin mekanizmalarını ve hedeflerini incelemek, kısmen, çünkü Regio-ve stereo-izomerlerin karışımları olarak var oldukları ve saf miktarlarda elde etmenin bir yöntemi olan zorlu kanıtlanmıştır enantiomerler ve regioisomers gereklidir. Bu bileşikler kimyasal sentezleme için konvansiyonel araçlar etkisiz olduğunu kanıtladı. Epasetatasyon için meta-chloroperoxybenzoic asit gibi perokasitlerin kullanımı birçok dezavantajları vardır, özellikle de bireysel regioisomers ve enantiomers pahalı ve titizlikle arıtılması gerektiren epidrasyon seçicilik, eksikliği. DHA ve EPA metabolitleri toplam sentezi mümkündür, ama aynı zamanda yüksek maliyetler ve düşük verim gibi büyük ölçekli sentez için pratik yapmak dezavantajları muzdarip^12,13. Enzim reaksiyonu Regio-ve stereoseçici¹⁴olduğu için, enzimatik sentezle verimli genel üretim elde edilebilir. Çalışmalar, AA ve EPA enzimatik epizemasyon (bm3 ile) hem regioseçici ve enantioseçici^15,16,17,18, ama bu prosedür DHA ile test edilmedi, ya da büyük bir gösterir Ölçek. Yöntemimizin genel hedefi, bireysel enantiomerler olarak hızla önemli miktarlarda saf epoksi yağ asitleri üretmek için bu kemoenzimatik epizatasyonu ölçeklendirmek ve optimize etmek oldu. Burada sunulan yöntemi kullanarak, araştırmacılar EDPs ve diğer PUFA epoksi metabolitleri sentezi için basit ve uygun maliyetli bir stratejiye erişebilir.

Protokol

DIKKAT: listelenen kimyasalları kullanmadan önce lütfen tüm ilgili malzeme güvenlik veri sayfalarına (MSDS) danışın.

1. vahşi tip BM3 ifadesi

1. PBS-bm3 transfekte DH5α E. coli (Dr. F. Ann Walker 'dan cömert bir bağış) içinde 5 ml steril lb suyu ile 0,5 mg ampisilin 20 ml kültür tüpüne eklendi.
2. 200 rpm 'de 24 saat için 37 °C ' de bir shaker içinde hücre kültürünü inkük. Gece marş kültürü (5 mL) ekleyin ve 100 bir FERNBACH veya Erlenmeyer Flask steril LB suyu 1 L ampisilin mg. 37 °C ' de 200 rpm 'de 6 saat, sonra da 30 °C ' de, 200 rpm 'de 18 saat sallayın.
3. 1.000 x g'de 10 dakika boyunca 4 °c ' de hücre kültürünü toplayın ve santrifüjün. Süpernatant atın ve hücre Pelet at-78 °c enzim arıtma kadar saklayın.
   Not: süpernatant ya kimyasal olarak çamaşır suyu ile tedavi ile sterilize veya bir otoklav kullanarak sterilize ve sonra drenaj aşağı dökmüş olabilir.

2. BM3 arıtma.

1. Hücre liziz
   1. Ice-Cold (4 °c) çözünme tampon (10 mm Tris, 0,01 mm phenylmethylsulfonyl fluorid (PMSF;), 0,01 mm EDTA; pH 7,8) 40 ml içinde buz ve pelletini üzerinde hücre Pelet çözüyor.
      DIKKAT: PMSF temas ederek zehirlidir.
   2. Buzda ise, hücreleri 1 dakika boyunca ultrasonik Homogenizer (çıkış güç ayarı 10, Duty 100%) ile sonikat, sonra da hücreleri Lyse için buzda 1 dakika mola. Bu prosedürü 6 kez tekrarlayın. Hücre lysate 4 °c ' de 30 dakika 11.000 x g 'de Pelet hücre kalıntısıiçin Santrifüjü.
2. Benzeşim Kromatografi
   1. 4 °C ' de yüksek tampon A (10 mM Tris, pH 7,8) 5 sütun hacmi (CV) ile yıkayarak güçlü bir aniyon değişimi Kromatografi sütunu (bkz. malzeme tablosu; çap: 2,8 cm x 6 cm, sütun hacmi: 37 ml) hazırlayın.
   2. Hücre endoglikozidazları dengelenmiş sütuna ekleyin ve soğuk tampon 3 CV ile sütun yıkayın A. soğuk tampon B (10 mm Tris, 600 mm NaCl, 6 CV) ile sütunu yıkayarak bm3 elute.
   3. Kırmızımsı-kahverengi akıtıcı fraksiyonu toplayın. Protein hemen kullanılırsa, sıvı nitrojen ile gliserol ve flaş dondurulması eşit hacimli ile karıştırın. Dondurulmuş solüsyonu-78 °C ' de saklayın.

3. BM3 tarafından DHA epoxidation

1. 0,308 g (0,940 mmol) DHA ' nın 18,8 mL 'de dimethylsulfoxıde (DMSO) ile 2 L 'ye tepki tamponunu (0,12 M potasyum fosfat, 5 mM MgCl₂, pH 7,4) ile birlikte, çözülmüş bm3 enziminin 20 Nm 'sini ekleyerek reaksiyonu hazırlayın. Enzim konsantrasyonu karbon monoksit/dithionite spektral assay yöntemi¹⁹tarafından belirlenebilir.
2. Çözelti karıştırırken, tepki arabelleğinde çözülmüş NADPH 1 eşdeğeri (Nikotinamid adenin dinükleotid fosfat azaltılmış, tetrasodyum tuz, 0,808 g, 0,940 mmol) ekleyerek reaksiyona başlayın. Bir şırınga ve iğne bağlı bir hava dolu balon ile reaksiyon karışımı aracılığıyla hava kabarcıklanma iken 30 dakika için reaksiyon karıştırın.
3. Bir spektrofotometre kullanarak ( malzeme tablosunabakın), NADPH tükenirse belirlemek için 340 Nm de reaksiyon karışımı emici kontrol edin. NADPH tüketimini gösteren kalan emici yoksa, reaksiyon tamamlanır.
   Not: genellikle, reaksiyon 30 dakika sonra tamamlanır.
4. Çözüm pH 'Sı 4 ' e ulaşıncaya kadar, 1 M oksulik asit, dropwise ile yavaşça reaksiyon karışımından giderin.

4. EDPs ekstraksiyonu

1. 3 kez dietil eter (susuz, peroksit içermeyen) 2 L ile sönüklenmiş tampon çözeltisi ayıklayın. Eter tabakasını (6 L) toplayın ve susuz magnezyum sülfat (MgSO₄) ile kuru.
2. MgSO₄ ' ü çözümden filtreleyin ve ham EDP kalıntılarını vermek için bir döner buharlaştırıcı üzerinde kurutulmuş eter katmanını konsantre olun.
3. Kalıntıyı flaş sütun Kromatografi ile arındırın (40 g silika kartuşu yeterlidir). Hekzanlar içinde% 10 etil asetat (EtOAc) başlayın ve 22 dk üzerinde hekzanlar% 60 EtOAc kadar rampa.
   Not: üç büyük zirveler elde edilir ve toplanan, 1 sırasına göre el. tepki vermez DHA; 2. EDP isomers karışımı; ve 3. di-Epoxide (normal aşırı oksidasyon ürünleri (bkz. Şekil 1)).
4. Kesirleri birleştirin ve döner buharlaştırıcı üzerine konsantre olun. Bu örnekteki 0,074 g, (% 24) tepki vermez DHA, 0,151 g (47%) EDP ısomers ve 0,076 g, (% 22) di-Epoxide elde edildi.

5. EDPS esterleşme, 16 (s), 17 (r)-ve 19 (s), 20 (r)-EDP, ve esterlerin sabunlaşma ayrılması

DIKKAT: Trimethylsilyldiazomethane (TMS-diazomethane) hem temas hem de inhalasyon ile çok zehirlidir. Uygun kişisel koruyucu ekipmanlarla sadece bir duman kaputu içinde kullanın.

1. Epoksitler seyreltmeli (0,151 g, 0,435 mmol) argon altında 2 ml susuz metanol (MeOH) ve 3 ml susuz Toluen ile yuvarlak dipli bir Flask veya küçük şişede, bir karıştırın-Bar ekleyin ve TMS-diazomethane (1,2 molar eşdeğerleri veya 0,26 ml, hexanes içinde 2 M çözeltisi) ekleyin.
2. 10 dakika bekleyin ve soluk sarı renk kalana kadar ek TMS-diazomethane (0,050 mL) ekleyin.
3. 30 dakika sonra, dikkatle döner buharlaştırıcı kullanarak karışımı konsantre ve flaş sütun Kromatografi ile kalıntı arındırmak. Elute ile 4% EtOAc hekzanlar (kullanarak bir 40 g silika jel sütun veya kartuş) için 22 dakika. Bu örnekte, 19, 20-EDP metil ester (0,116 g, 74%) ve 16, 17-EDP metil ester (0,029 g,% 19), net yağlar (toplam verim, 93%) olarak elde edildi.
4. Saflaştırılmış EDP metil ester regioisomers içeren kesirler toplayın. 19 (lar), 20 (r)-EDP ilk metil ester elutes, ardından 16 (s), 17 (r)-EDP metil ester.
5. Herhangi bir karışık fraksiyonları kalırsa (her iki izomerleri içeren; ince katmanlı Kromatografi (TLC) 8:1 hexane/EtOAc tarafından değerlendirilebilir ve potasyum permanganat (KMnO₄) ile lekelenmiş), daha önce olduğu gibi aynı solvent sistemi ile yeniden Kromatograf.
6. Bireysel regioisomers içeren kesirler konsantre.
   Not: Bu noktada, kimlik ve saflık NMR (solvent olarak CDCl₃ kullanarak; Şekil 2için göstergeye bakın) tarafından değerlendirilebilir.
7. Bireysel EDP metil ester regioisomers kendi asit formları dönüştürmek için, THF içinde EDP Ester seyreltilebilir: su (yaklaşık 0,7 mL/0.1 mmol ester). 2 M sulu LiOH (3 molar eşdeğerleri) ekleyin ve gece karıştırın.
   Not: reaksiyon bütünlüğü TLC tarafından, 3:1 hexanes/EtOAc, KMnO₄ile boyama kullanılarak değerlendirilebilir; ürün bir bekletme faktörü ~ 0,3 vardır.
8. Karışım pH 3-4 ulaştığında kadar, formik asit ile yavaşça reaksiyon Quench. Su ve etil asetat ekleyin (1-2 mL/0.100 mmol ester) ve katmanları ayırın. EtOAc (3 x 5 mL) ile su katmanını ayıklayın, doymuş salamura (NaCl) çözeltisi ile yıkayın ve EtOAc tabakasını susuz sodyum sülfat üzerine kurutun (na₂so₄).
9. Bir döner evaporatör kullanarak etil asetat çözeltisi konsantre, hekzanlar ekleyin (10 ml) ve tekrar konsantre. İki kez azeotropically kalan formik asit kaldırmak için tekrarlayın. Kalıntıyı flaş sütun Kromatografi ile temizler, 15 dakika üzerinde 10-30% EtOAc ile salınımlı.
10. Konsantre istenilen kesirler ve kuru vakum içinde arıtılmış asit göze.
    Not: Bu aşamada, enantiomerik saflık (kiral HPLC tarafından, sütun ve koşullar için Şekil 3 - Şekil 4 için efsanelere bakın) değerlendirilebilir. Kimyasal saflık C18 (achiral) HPLC (bkz. malzeme tablosu ve referans 14) ile değerlendirilebilir.

Sonuçlar

Flaşlı kolon kromatogram (aşağıda açıklandığı gibi otomatik bir flaş arıtma sistemi kullanılarak gerçekleştirilir) enzimatik epoksifiden ham karışımın arıtılması üzerine elde edilen Şekil 1' de gösterilir. Esterleşme ve regioisomerlerin ayrılması sonrasında, Pure 16 (s), 17 (r)-EDP ve 19 (s), 20 (r)-EDP metil esterleri elde edildi. Genellikle, bunlar yaklaşık 1:4 için 1:5 oranı, 19 (S

Tartışmalar

Burada DHA-19, 20 ve 16, 17-EDP iki en bol epoksi metabolitleri hazırlamak için operasyonel olarak basit ve maliyet-etkili bir yöntem sunuyoruz. Bu epoksi yağ asitleri, vahşi tip bm3 enzim kullanarak yüksek enantiomer ( S, R-isomers gibi) şeklinde hazırlanabilir. Sorun giderme için kullanılan çeşitli kritik noktaları ve AA ve EPA enantiomer epoksi metabolitleri hazırlamak için bizim yöntemin uzantısı, aşağıda açıklanmıştır.

BM3 depolama yönergeleri

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ammonium Bicarbonate	Sigma	9830	NA
Ampicillin	GoldBio	A30125	NA
Anhydrous magnesium sulfate	Fisher Scientific	M65-3	NA
Anhydrous methanol	Sigma-Aldrich	322515	NA
Anhydrous sodium sulfate	Fisher Scientific	S421-500	NA
Anhydrous toluene	Sigma-Aldrich	244511	NA
Arachidonic Acid (AA)	Nu-Chek Prep	U-71A	Air-sensitive.
Diethyl Ether	Sigma	296082	NA
DMSO (molecular biology grade)	Sigma-Aldrich	D8418	NA
Docosahexaenoic Acid (DHA)	Nu-Chek Prep	U-84A	Air-sensitive.
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	Invitrogen	15576028	NA
Eicosapentaenoic Acid (EPA)	Nu-Chek Prep	U-99A	Air-sensitive.
Ethyl acetate	Sigma	34858	NA
Flash column cartridges 25, 40, 4, 12 g sizes	Fisher Scientific	145170203, 145154064, 5170200	Alternatively, conventional column chromatography can be used
Formic acid (HPLC Grade)	J.T. Baker	0128-01	NA
Glycerol	Sigma	G7757	NA
Hexanes	VWR	BDH24575	NA
LB Broth	Sigma	L3022	NA
Lithium hydroxide	Sigma-Aldrich	442410	NA
Magnesium chloride	Fisher Scientific	2444-01	NA
Methanol (HPLC grade)	Sigma-Aldrich	34860-41-R	NA
NADPH Tetrasodium Salt	Sigma-Aldrich	481973	Air-sensitive.
Oxalic acid	Sigma-Aldrich	194131	NA
pBS-BM3 transfected DH5α E. coli	NA	NA	NA
PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride)	Sigma	P7626	Toxic!
Potassium Permanganate	Sigma-Aldrich	223468	For TLC staining.
Potassium phosphate dibasic	Sigma	795496	NA
Potassium phosphate monobasic	Sigma	795488	NA
Q Sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare life sciences)	Fisher Scientific	17-0515-01	For anion exchange purification of enzyme
Sodium Chloride	Sigma	71376	NA
Tetrahydrofuran, anhydrous	Sigma-Aldrich	186562	NA
TMS-Diazomethane (2.0 M in hexanes)	Sigma-Aldrich	362832	Very toxic.
Tris-HCl	GoldBio	T-400	NA
Also necessary:
Automatic flash purification system (we used a Buchi Reveleris X2)	Buchi
C18 HPLC column (Zorbax Eclipse XDB-C18)	Agilent
Centrifuge capable of 10,000 x g
Chiral HPLC Column (Lux cellulose-3), 250 x 4.6 mm, 5 µM, 1000 Å)	Phenomenex
General chemistry supplies: a 2 L separatory funnel, beakers and Erlenmeyer flasks with 1000-2000 L capacity, 20 mL vials, HPLC vials, small round-bottomed flasks and stir-bars.
HPLC (we use a Shimadzu Prominence LC-20AT analytical pump and SPD-20A UV-vis detector	Shimadzu
Nanodrop 2000 Spectrophotometer	Thermo-Fisher Scientific
NMR	NMR: Agilent DD2 spectrometer (500 MHz)
Rotary evaporator	Buchi
Sonic dismembrator or ultrasonic homogenizer	Cole-Parmer