多克沙六烯、环氧体和阿拉奇酮酸的环氧代谢物酶合成

摘要

我们提出了一种有用的方法,用于使用细菌细胞色素,对阿氏酸(AA)、多沙六烯酸(DHA)和乙二苯甲酸(EPA)的特异性环氧乙烷和环氧乙烷酶的环氧乙烷和环氧乙烷的再三氧化二氮进行纯化。P450 酶 (BM3)。

摘要

各种多不饱和脂肪酸(PUFAs)的环氧树脂代谢物,称为环氧脂肪酸,在人体生理学中有着广泛的作用。这些代谢物是由细胞色素P450类酶内分泌产生的。由于其多样化和强大的生物效应,人们对研究这些代谢物产生了浓厚的兴趣。确定这些代谢物在体内的独特作用是一项艰巨的任务,因为环氧脂肪酸必须首先获得大量且纯度高。从天然来源获得化合物通常是劳动密集型的,可溶性环氧乙烷(sEH)会迅速水解代谢物。另一方面,通过化学反应获得这些代谢物的效率非常低,因为很难获得纯反热敏体和抗性剂,产量低,并且广泛(和昂贵的)纯化。在这里,我们提出一个有效的酶合成19(S),20 (R) - 和16 (S),17 (R)-环氧乙烷酸 (EDPs) 从DHA通过环氧化与BM3, 一种细菌CYP450酶从杆菌分离梅盖特(在大肠杆菌中很容易表达)。使用核磁共振光谱 (NMR)、高性能液相色谱 (HPLC) 和质谱 (MS) 进行纯度的特性和测定。本程序说明了PUFA环氧代谢物酶合成的好处,并适用于其他脂肪酸的环氧化,包括甲氧乙酸(AA)和乙酸苯甲酸(EPA),以生产类似的环氧乙烷酸酸(EETs)和四烯酸(EEQs)。

引言

近年来,随着人们对多不饱和脂肪酸(特别是欧米茄-3和欧米茄-6多不饱和脂肪酸)在人类生物学中的作用的兴趣与日俱增,研究人员已经注意到其代谢物具有广泛的吸引力。展览。特别是环氧脂肪酸代谢物产生的细胞色素P450类酶一直是人们关注的焦点。例如,许多PUFA环氧乙烷,包括环氧乙烷酸(EETs)、环氧二甲酸(EDPs)和环氧乙烷四甲酸(EEQs),在调节血压和炎症方面起着关键作用1^,2,3,4,5.有趣的是,已知AA和EPA环氧树脂的特定异构体对血管收缩6、7具有不同影响。虽然EET和EEQ的内窥剂和再血管异构体的生理影响已经记录在案,但人们对DHA形成的类似环氧二苯丙酸(EDPs)的影响知之甚少。鱼^油8的广泛使用,富含EPA和DHA,也激起了对EDPs⁹的兴趣。这些补充剂的好处被认为是部分由于下游DHA代谢物(16,17-EDP和19,20-EDP是最丰富的),因为在体内的EDP水平与膳^食10中的DHA量协调^{得很好, 11}.

通过代谢组学、化学生物学和其他方法研究这些环氧脂肪酸的机制和目标已被证明具有挑战性,部分原因在于它们作为再血管和立体异构体的混合物存在,以及一种获得纯量的需要反古体和再血管等位。事实证明,用化学合成这些化合物的传统方法是无效的。使用环氧树脂等环氧树脂有许多缺点,特别是缺乏环氧化选择性,这需要昂贵和费力地纯化单个再血管体和抗氧化剂。DHA和EPA代谢物的完全合成是可能的,但也存在缺点,使得大规模合成不切实际,如高成本和低产量12,13。有效的整体生产可以通过酶合成来实现,因为酶反应是regio-和立体^{选择性14。}研究表明,AA和EPA的酶环氧化(与BM3)同时具有反选择性和内选选择性15,16,17,18,但这个程序没有测试与DHA,或在大型规模。我们该方法的总体目标是扩大和优化这种化学环氧化,以迅速产生大量的纯环氧脂肪酸作为各自的抗氧化剂。使用这里介绍的方法,研究人员可以获得一种简单且经济高效的策略来合成EDPs和其他PUFA环氧代谢物。

研究方案

注意:在使用所列化学品之前,请查阅所有相关的材料安全数据表 (MSDS)。

1. 野生型BM3的表达

1. 接种pBS-BM3转染DH5+大肠杆菌(由F.Ann Walker博士慷慨捐赠)在5 mL无菌LB汤中加入0.5毫克氨基青霉素加入20 mL培养管。
2. 在37°C下在摇床中孵育细胞培养,在200rpm下孵育24小时。在Fernbach或Erlenmeyer烧瓶中加入隔夜开胃剂培养基(5 mL)和100毫克的阿霉素,加入1L无菌LB汤。在 37°C 下在 200 rpm 下摇动 6 小时,然后在 30°C 下在 200 rpm 下摇动 18 小时。
3. 在4°C下收集并离心机细胞培养基10分钟,在1,000 x g下。丢弃上清液,将细胞颗粒储存在-78°C,直到酶纯化。
   注:上清液可以通过漂白剂进行化学灭菌,也可以使用高压灭菌器消毒,然后倒入下水道。

2. BM3的净化。

1. 细胞莱沙
   1. 在冰上解冻细胞颗粒,重新悬浮在40 mL的冷冰 (4 °C) 溶解缓冲液(10 mM Tris, 0.01 mM 苯基甲基硫磷基氟化物 (PMSF;), 0.01 mM EDTA; pH 7.8).
      注意:PMSF 因接触而有毒。
   2. 在冰上时,用超声波均质器对细胞进行1分钟的声波处理(输出功率设置10,占100%),然后冰上休息1分钟,以对细胞进行分解。重复此过程 6 次。在 4°C 下将细胞分管 30 分钟,在 11,000 x g下与颗粒细胞碎片分离。
2. 亲缘色谱
   1. 通过在 4°C 下用缓冲器 A 的 5 列体积 (CV) 洗涤,制备强的海网交换色谱柱(参见材料表;直径:2.8 厘米 x 6 厘米,柱体积:37 mL)。
   2. 将细胞分片添加到平衡柱中,用3 CV冷缓冲液A洗涤柱,用冷缓冲液B(10 mM Tris,600 mM NaCl,6 CV)清洗柱。
   3. 收集红褐色洗脱分数。如果不立即使用蛋白质,将其与同等体积的甘油混合,并与液氮一起闪冻。将冷冻溶液储存在-78°C。

3. BM3对DHA的抗氧化

1. 在18.8 mL二甲基硫酸盐(DMSO)中加入0.308克(0.940毫摩尔)至2L的搅拌反应缓冲液(0.12M磷酸钾,5 mM MgCl 2,pH 7.4)以及20 nM的解冻BM3酶,制备反应。酶浓度可以通过一氧化碳/二聚苯醚光谱测定^方法19确定。
2. 当溶液搅拌时,在反应缓冲液中加入1个等效的NADPH(烟酰胺腺苷二核苷酸磷酸盐减少,四钠盐,0.808克,0.940 mmol)开始反应。将反应搅拌30分钟,同时通过反应混合物冒泡空气,用充气气球连接到注射器和针头。
3. 使用分光光度计(见材料表),检查反应混合物在340nm处的吸光度,以确定NADPH是否耗尽。如果没有剩余吸收电指示 NADPH 的消耗,则反应已完成。
   注:通常,反应在30分钟后完成。
4. 通过缓慢加入1M草酸,滴落,直到溶液的pH率达到4,使反应混合物淬火。

4. 提取 EDP

1. 用2L二乙醚(无氢、过氧化物)提取淬火缓冲液溶液3次。收集醚层(6L),用无水硫酸镁(MgSO₄)干燥。
2. 从溶液中过滤MgSO_4,将干燥的醚层浓缩在旋转蒸发器上,产生粗EDP残留物。
3. 通过闪光柱色谱法净化残留物(40 克硅盒就足够了)。在己带中从 10% 乙酸乙酯 (EtOAc) 开始,在 22 分钟内在己带中增加高达 60% 的 EtOAc。
   注: 获取和收集三个主要峰,按 1 的顺序进行。未反应的DHA;2. EDP等体混合物;和3。二氧化二氮(正常过氧化产物(见图1)。
4. 将分数合并,并集中到旋转蒸发器上。从本例中,0.074 克 (24%)未反应的DHA,0.151 g (47%)EDP 等构体和 0.076 g,(22%)二环二氧化硫。

5. EDP的酯化,16(S),17(R)-和19(S),20(R)-EDP,和酯的皂化

注意:三甲基硅二氮甲烷(TMS-二甲烷)在接触和吸入中毒性极强。只能在带适当个人防护设备的烟气罩中使用。

1. 在圆底烧瓶或小瓶中稀释环氧化物(0.151克,0.435毫摩尔),在阿根下面加2mL无水甲醇(MeOH)和3 mL无水甲苯,加入搅拌棒,并加入TMS-二甲烷(1.2摩尔当量,或0.26 mL的2M溶液)。
2. 等待 10 分钟,并添加额外的 TMS-二甲烷 (0.050 mL),直到保持淡黄色。
3. 30分钟后,使用旋转蒸发器小心地浓缩混合物,并通过闪光柱色谱法净化残留物。在己带中加入 4% EtOAc(使用 40 g 硅胶柱或墨盒)22 分钟。在此示例中,19,20-EDP 甲基酯(0.116 g, 74%)16,17-EDP甲基酯(0.029克,19%)作为透明油获得(总产量,93%)。
4. 收集含有纯化EDP甲基酯再焦散剂的馏分。19 (S)(R) -EDP 甲基酯首先洗脱,然后是 16 (S), 17 (R)-EDP 甲基酯.
5. 如果任何混合馏分仍然存在(包含两种异构体;可以通过薄层色谱法(TLC)在8:1己烷/EtOAc中评估,并沾染高锰酸钾(KMnO 4),则用与以前相同的溶剂系统重新进行色谱。
6. 集中包含单个血管等位器的分数。
   注:此时,身份和纯度可能由 NMR 评估(使用 CDCl₃作为溶剂;参见图2的图例)。
7. 要将单个 EDP 甲基酯再焦油酯转化为其酸形式,在 THF:水(约 0.7 mL/0.1 mmol 的酯)中稀释 EDP 酯。加入2M水李OH(3摩尔当量),搅拌过夜。
   注:反应的完成性可以通过TLC评估,使用3:1己安/EtOAc,与KMnO₄染色;产品的保留系数为 ±0.3。
8. 用甲酸缓慢地淬火反应,直到混合物的pH达到3-4。加入水和乙酸乙酯(1-2 mL/0.100 mmol酯),并分离层。用EtOAc(3 x 5 mL)萃取水层,用饱和盐水(NaCl)溶液清洗,并在无水硫酸钠(Na₂SO₄)上干燥EtOAc层。
9. 使用旋转蒸发器浓缩乙酸乙酯溶液,加入己酸素(10 mL),然后再次浓缩。重复两次,以亚子化去除残留的甲酸。通过闪光柱色谱法净化残留物,在 15 分钟内用 10-30% EtOAc 进行稀释。
10. 浓缩所需的馏分,在真空中干燥,以承受纯化的酸。
    注: 在此阶段,可以评估异质纯度(通过手性 HPLC,参见图 3的图例 -图 4列和条件)。化学纯度可以通过C18(化学)HPLC评估(见材料表和参考文献14)。

结果

从酶性酶氧化中纯化原油混合物时获得的闪光柱色谱图(使用下述自动闪光纯化系统执行)如图1所示。继对再血管等量体进行酯化和分离后,获得纯16(S)、17(R)-EDP和19(S)、20(R)-EDP甲基酯。通常,它们以大约 1:4 到 1:5 的比例存在,主要产品为 19(S),20 (R) -EDP。未获得其他EDP反血管体(例如,13,14-或10,11-EDP)。1 H-NMR 光?...

讨论

我们在这里提出了一种操作简单且经济高效的方法,用于制备DHA的两种最丰富的环氧代谢物 - 19,20 和 16,17-EDP。这些环氧脂肪酸可以使用野生型BM3酶以高抗纯(作为S,R-等体)形式制备。下面将介绍可用于故障排除的几个关键点,以及我们制备 AA 和 EPA 的环氧树脂代谢物的方法的扩展。

BM3 存储指南

在-78°C冷冻室储存之前,将蛋白质溶液与同等?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ammonium Bicarbonate	Sigma	9830	NA
Ampicillin	GoldBio	A30125	NA
Anhydrous magnesium sulfate	Fisher Scientific	M65-3	NA
Anhydrous methanol	Sigma-Aldrich	322515	NA
Anhydrous sodium sulfate	Fisher Scientific	S421-500	NA
Anhydrous toluene	Sigma-Aldrich	244511	NA
Arachidonic Acid (AA)	Nu-Chek Prep	U-71A	Air-sensitive.
Diethyl Ether	Sigma	296082	NA
DMSO (molecular biology grade)	Sigma-Aldrich	D8418	NA
Docosahexaenoic Acid (DHA)	Nu-Chek Prep	U-84A	Air-sensitive.
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	Invitrogen	15576028	NA
Eicosapentaenoic Acid (EPA)	Nu-Chek Prep	U-99A	Air-sensitive.
Ethyl acetate	Sigma	34858	NA
Flash column cartridges 25, 40, 4, 12 g sizes	Fisher Scientific	145170203, 145154064, 5170200	Alternatively, conventional column chromatography can be used
Formic acid (HPLC Grade)	J.T. Baker	0128-01	NA
Glycerol	Sigma	G7757	NA
Hexanes	VWR	BDH24575	NA
LB Broth	Sigma	L3022	NA
Lithium hydroxide	Sigma-Aldrich	442410	NA
Magnesium chloride	Fisher Scientific	2444-01	NA
Methanol (HPLC grade)	Sigma-Aldrich	34860-41-R	NA
NADPH Tetrasodium Salt	Sigma-Aldrich	481973	Air-sensitive.
Oxalic acid	Sigma-Aldrich	194131	NA
pBS-BM3 transfected DH5α E. coli	NA	NA	NA
PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride)	Sigma	P7626	Toxic!
Potassium Permanganate	Sigma-Aldrich	223468	For TLC staining.
Potassium phosphate dibasic	Sigma	795496	NA
Potassium phosphate monobasic	Sigma	795488	NA
Q Sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare life sciences)	Fisher Scientific	17-0515-01	For anion exchange purification of enzyme
Sodium Chloride	Sigma	71376	NA
Tetrahydrofuran, anhydrous	Sigma-Aldrich	186562	NA
TMS-Diazomethane (2.0 M in hexanes)	Sigma-Aldrich	362832	Very toxic.
Tris-HCl	GoldBio	T-400	NA
Also necessary:
Automatic flash purification system (we used a Buchi Reveleris X2)	Buchi
C18 HPLC column (Zorbax Eclipse XDB-C18)	Agilent
Centrifuge capable of 10,000 x g
Chiral HPLC Column (Lux cellulose-3), 250 x 4.6 mm, 5 µM, 1000 Å)	Phenomenex
General chemistry supplies: a 2 L separatory funnel, beakers and Erlenmeyer flasks with 1000-2000 L capacity, 20 mL vials, HPLC vials, small round-bottomed flasks and stir-bars.
HPLC (we use a Shimadzu Prominence LC-20AT analytical pump and SPD-20A UV-vis detector	Shimadzu
Nanodrop 2000 Spectrophotometer	Thermo-Fisher Scientific
NMR	NMR: Agilent DD2 spectrometer (500 MHz)
Rotary evaporator	Buchi
Sonic dismembrator or ultrasonic homogenizer	Cole-Parmer