Sintesi ezimatica dei metaboliti epossidici degli acidi docosahexaenoici, eicosapentaenoici e aracidonici

Riepilogo

Presentiamo un metodo utile per la sintesi e purificazione e depurazione esulla scala di specifici enantiomeri e regioisori di epossido di acido aracidonico (AA), acido docosaesaenoico (DHA) e acido eicosapentaeno (EPA) con l'uso di un citocromo batterico P450 enzima (BM3).

Abstract

I metaboliti epossidizzati di vari acidi grassi polinsaturi (PUFA), rititi acidi grassi epossidici, hanno una vasta gamma di ruoli nella fisiologia umana. Questi metaboliti sono prodotti endogenamente dalla classe citocromatica P450 degli enzimi. A causa dei loro effetti biologici diversi e potenti, c'è un notevole interesse nello studio di questi metaboliti. Determinare i ruoli unici di questi metaboliti nel corpo è un compito difficile, in quanto gli acidi grassi epossidici devono prima essere ottenuti in quantità significative e con alta purezza. Ottenere composti da fonti naturali è spesso laborioso, e idrolasi epossido solubili (sEH) rapidamente idrolizzare i metaboliti. D'altra parte, ottenere questi metaboliti tramite reazioni chimiche è molto inefficiente, a causa della difficoltà di ottenere regioisomeri e enantiomeri puri, bassi rendimenti e vaste (e costose) purifiche. Qui, presentiamo un'efficiente sintesi enzimatica di 19(S), 20 (R)- e 16(S), 17(R)-epoxydocosatrapaenoiche acids (EDP) da DHA via epossidazione con BM3, un enzima batterico CYP450 isolato originariamente da Bacillus megaterium (che è prontamente espresso in Escherichia coli). La caratterizzazione e la determinazione della purezza vengono eseguite con spettroscopia a risonanza magnetica nucleare (NMR), cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) e spettrometria di massa (MS). Questa procedura illustra i benefici della sintesi enzimatica dei metaboliti PUFA epoxy ed è applicabile all'epossidazione di altri acidi grassi, tra cui l'acido aracidonico (AA) e l'acido eicosapentaenoico (EPA) per produrre l'analogo epoxyeicosanoico acidi (EET) e gli acidi epossidicosaetui (EEQ), rispettivamente.

Introduzione

Come interesse per il ruolo che gli acidi grassi polinsaturi (in particolare gli acidi grassi polinsaturi omega-3 e omega-6) è cresciuto negli ultimi anni, i ricercatori hanno preso atto della vasta gamma di vantaggi interessanti che i loro metaboliti mostra. In particolare, i metaboliti dell'acido grasso epossidico prodotti dalla classe citocromatica P450 degli enzimi sono stati un grande punto focale. Ad esempio, molti epossido di PUFA, tra cui gli acidi epossieicosachichi (EET), gli acidi epoxydocosatrapaenoici (EDP) e gli acidi epossirossitetraenoici (EEQ), svolgono un ruolo critico nella regolazione della pressione sanguigna e dell'infiammazione^{1,2 , 3} (COM del nome ^{, 4 DEL psu' , 5}. È interessante notare che gli enantiomeri specifici e i regioisomeri degli epossido di AA e EPA sono noti per avere effetti variabili sull'vasoconstriction^6,7. Mentre gli effetti fisiologici degli enantiomeri e dei regioisomeri degli EET e degli EEQ sono stati documentati, si sa poco sull'effetto degli analoghi acidi essidomiomiatori (EDP) formati dal DHA. L'uso diffuso dell'olio di pesce⁸, che è ricco sia di EPA che di DHA, ha suscitato interesse anche per gli EDP⁹. I benefici di questi integratori sono creduti per essere in parte a causa dei metaboliti DHA a valle (16,17-EDP e 19,20-EDP essendo il più abbondante) perché in vivo livelli di EDP si coordinano molto bene con la quantità di DHA nella dieta^{10, 11}.

Lo studio dei meccanismi e degli obiettivi di questi acidi grassi epossidici mediante metabolomica, biologia chimica e altri metodi si è dimostrato impegnativo, in parte perché esistono come miscele di regio- e stereo-isomeri, e un metodo per ottenere quantità pure del anti-enantiomeri e regioisomers. I mezzi convenzionali per sintetizzare chimicamente questi composti si sono dimostrati inefficaci. L'uso di perossididi come l'acido meta-cloroperoxybenzoico per l'epossidica ha molti inconvenienti, in particolare la mancanza di selettività dell'epossidazione, che richiede una purificazione costosa e scrupolosa di singoli regiosori e enantiomeri. La sintesi totale dei metaboliti DHA ed EPA è possibile, ma soffre anche di inconvenienti che lo rendono poco pratico per la sintesi su larga scala come i costi elevati e le basse rese^12,13. Una produzione complessiva efficiente può essere realizzata con sintesi enzimatica, poiché le reazioni enzimatiche sono regio- e stereoselettive¹⁴. Gli studi dimostrano che l'epossidizzazione epossimatica epossimatica di AA ed EPA (con BM3) è sia regiosesesese che enantiosese^15,16,17,18, ma questa procedura non è stata testata con DHA, o su un grande scala. L'obiettivo generale del nostro metodo era quello di scalare e ottimizzare questa epossidazione chemiozimatica per produrre rapidamente quantità significative di acidi grassi epossidici puri come loro antiantiomeri individuali. Utilizzando il metodo qui presentato, i ricercatori hanno accesso a una strategia semplice ed economica per la sintesi di EDP e altri metaboliti epossidici PUFA.

Protocollo

AVVISO: Consultare tutte le schede tecniche di sicurezza dei materiali pertinenti (MSDS) prima di utilizzare le sostanze chimiche elencate.

1. Espressione di tipo selvaggio BM3

1. Inoculare pBS-BM3 trasinfezione DH5 E. coli (una generosa donazione dal Dr. F. Ann Walker) in 5 mL di brodo LB sterile con 0,5 mg di ampicillina aggiunto in un tubo di coltura 20 mL.
2. Incubare la coltura cellulare in uno shaker a 37 gradi centigradi per 24 h a 200 giri/min. Aggiungere la coltura di avviamento notturno (5 mL) e 100 mg di ampicillina a 1 L di brodo Sterile LB in un pallone Fernbach o Erlenmeyer. Agitare a 37 gradi centigradi per 6 h a 200 giri/min, quindi a 30 gradi centigradi per 18 h a 200 giri/min.
3. Raccogliere e centrifugare la coltura cellulare a 4 gradi centigradi per 10 min a 1.000 x g. Scartare il supernatante e conservare il pellet cellulare a -78 gradi centigradi fino alla purificazione degli enzimi.
   NOTA: Il supernatante può essere sterilizzato chimicamente con il trattamento con candeggina o sterilizzato utilizzando un autoclave e poi versato nello scarico.

2. Purificazione di BM3.

1. Lisi cellulare
   1. Sbattere il pellet cellulare sul ghiaccio e risospendere in 40 mL di buffer di solubilizzazione a freddo ghiaccio (1m) (10 mM Tris, 0,01 mM fenilmetilmethylsulfonyl fluoride (PMSF;), 0,01 mM EDTA; pH 7,8).
      AVVISO: il PMSF è tossico per contatto.
   2. Mentre sul ghiaccio, sonicare le cellule per 1 min con un omogeneizzatore ad ultrasuoni (impostazione di potenza di uscita 10, dovere 100%), seguita da una rottura di 1 min sul ghiaccio al fine di lisizzare le cellule. Ripetere questa procedura 6 volte. Centrifugare la lisata cellulare a 4 gradi centigradi per 30 min a 11.000 x g per pellet detriti cellulari.
2. Cromatografia affinità
   1. Preparare una forte colonna di cromatografia di scambio di anioni (vedi Tabella dei materiali; diametro: 2,8 cm x 6 cm, volume della colonna: 37 mL) lavando con 5 volumi di colonne (CV) del buffer A (10 mM Tris, pH 7,8) a 4 gradi centigradi.
   2. Aggiungere le linguetta delle cellule alla colonna equilibrata e lavare la colonna con 3 CV di tampone freddo A. Elute il BM3 lavando la colonna con tampone freddo B (10 mM Tris, 600 mM NaCl, 6 CV).
   3. Raccogliere la frazione eluente bruno-rossastro. Se la proteina non viene utilizzata immediatamente, mescolarla con un volume uguale di glicerolo e congelare il flash con azoto liquido. Conservare la soluzione congelata a -78 gradi centigradi.

3. Epossidazione del DHA da parte di BM3

1. Preparare la reazione aggiungendo 0,308 g (0,940 mmol) di DHA in 18,8 mL di dimeilfossido (DMSO) a 2 L di buffer di reazione di agitazione (0,12 fosfato di potassio, 5 mM MgCl₂, pH 7.4) insieme a 20 nM dell'enzima BM3 scongelato. La concentrazione di enzimi può essere determinata dal metodo di analisi spettrale monossido di carbonio/dithionite¹⁹.
2. Mentre la soluzione si sta agitando, iniziare la reazione aggiungendo 1 equivalente di NADPH (nicotinamide adenina dinucleotide fosfato ridotto, sale tetrasodio, 0.808 g, 0.940 mmol) disciolto nel buffer di reazione. Mescolare la reazione per 30 min mentre l'aria bollente attraverso la miscela di reazione con un palloncino pieno d'aria attaccato a una siringa e ago.
3. Utilizzando uno spettrofotometro (vedere Tabella deimateriali), controllare l'assorbimento della miscela di reazione a 340 nm per determinare se NADPH è esaurito. Se non vi è alcuna assorbimento rimanente che indica il consumo di NADPH, la reazione è completa.
   NOTA: In genere, la reazione è completa dopo 30 min.
4. Spegnire la miscela di reazione aggiungendo lentamente 1 M di acido osalico, dropwise, fino a quando il pH della soluzione raggiunge 4.

4. Estrazione di EDP

1. Estrarre la soluzione tampone spento con 2 L di etere dietillo (anidroso, privo di perossido) 3 volte. Raccogliere lo strato di etere (6 L) e asciugare con solfato di magnesio idroelettrico (MgSO₄).
2. Filtrare l'MgSO₄ dalla soluzione e concentrare lo strato di etere essiccato su un evaporatore rotante per produrre il residuo EDP grezzo.
3. Purificare il residuo mediante cromatografia a colonna flash (una cartuccia di silice da 40 g è sufficiente). Iniziare al 10% di acetato di etilico (EtOAc) in esagoni e rampa fino al 60% EtOAc in esagoni oltre 22 min.
   NOTA: Tre picchi principali sono ottenuti e raccolti, eluindo nell'ordine di 1. DHA non reagito; 2. miscela di isomeri EDP; e 3. (normali prodotti di sovraossidazione (cfr. figura 1)).
4. Unire le frazioni e concentrarle sull'evaporatore rotativo. Da questo esempio, 0,074 g, (24%) DHA non reagito, 0,151 g (47%) di isomeri EDP, e 0,076 g, (22%) di-epossido sono stati ottenuti.

5. Esterificazione degli EDP, separazione di 16(S),17(R)- e 19(S),20(R)-EDP e saponificazione degli esteri

AGGIORNAMENTO: Il trimethylsilyldiazometathane (TMS-diazometae) è molto tossico sia per il contatto che per l'inalazione. Utilizzare solo in un cofano di fume con l'attrezzatura protettiva personale adeguata.

1. Diluire gli epossido (0,151 g, 0,435 mmol) in una fiaschetta a fondo rotondo o piccola fiala con 2 mL di metanolo idrosotro (MeOH) e 3 mL di toluene anidride, aggiungere una barra di stir, e aggiungere TMS-diazometatano (1,2 semilari equivalenti, o 0,26 mL di una soluzione di 2 M in hexanes) sotto argon.
2. Attendere 10 min e aggiungere ulteriore TMS-diazometano (0.050 mL) fino a quando non rimane un colore giallo pallido.
3. Dopo 30 min, concentrare con cura la miscela utilizzando l'evaporatore rotante e purificare il residuo dalla cromatografia a colonna flash. Elute con 4% EtOAc in esagoni (utilizzando una colonna di gel di silice o cartuccia 40 g) per 22 min. In questo esempio, 19,20-EDP ester metil (0,116 g, 74%) e 16,17-EDP ester metile (0,029 g, 19%), sono stati ottenuti come oli chiari (rendimento totale, 93%).
4. Raccogliere le frazioni contenenti i regioisomers edthyl ester purificati. 19(S), 20(R)-EDP metil ester eluise per prime, seguite da 16(S),17(R)-EDP ester metile.
5. Se rimangono frazioni miste (contenenti entrambi gli isomeri; possono essere valutate mediante cromatografia a strato sottile (TLC) in 8:1 hexane/EtOAc e macchiate con permanganato di potassio (KMnO₄)), ri-cromatografate con lo stesso sistema solvente di prima.
6. Concentrare le frazioni contenenti i singoli regioisomers.
   NOTA: a questo punto, l'identità e la purezza possono essere valutate da NMR (utilizzando CDCl₃ come solvente; vedere la legenda per la figura 2).
7. Per convertire i singoli regioisomers di ester metile EDP alle loro forme acide, diluire l'ester EDP in THF:water (circa 0,7 mL/0,1 mmol di ester). Aggiungere 2 M aqueous LiOH (3 equivalenti molare) e mescolare durante la notte.
   NOTA: la completezza della reazione può essere valutata da TLC, utilizzando 3:1 exanes/EtOAc, colorazione con KMnO₄; il prodotto ha un fattore di ritenzione di 0,3 USD.
8. Spegnire lentamente la reazione con l'acido formico, fino a quando il pH della miscela raggiunge 3-4. Aggiungere acqua ed acetato etilico (1-2 mL/0,100 mmol di ester) e separare gli strati. Estrarre lo strato d'acqua con EtOAc (3 x 5 mL), lavare con soluzione salamoia satura (NaCl) e asciugare lo strato EtOAc sopra anhydrous solfato di sodio (Na₂SO₄).
9. Concentrare la soluzione di acetato etiliato utilizzando un evaporatore rotante, aggiungere esanei (10 mL) e concentrarsi di nuovo. Ripetere due volte per azeotropicale rimuovere l'acido formica residuo. Purificare il residuo dalla cromatografia a colonna flash, eluindo con 10-30% EtOAc oltre 15 min.
10. Concentrare le frazioni desiderate e asciugare in vacuo per permettersi l'acido purificato.
    NOTA: In questa fase, la purezza enantiomerica può essere valutata (da HPLC chirale, vedere le leggende per Figura 3 - Figura 4 per colonna e condizioni). La purezza chimica può essere valutata da C18 (achiral) HPLC (vedi Tabella dei materiali e riferimento 14).

Risultati

Il cromatogramma della colonna flash (eseguito utilizzando un sistema di purificazione flash automatizzato come descritto di seguito) ottenuto dopo la purificazione della miscela grezza dall'epossidiva esossimatica ezimatica è mostrato nella Figura 1. Dopo l'esterificazione e la separazione dei regioisori, sono stati ottenuti i puri 16(S),17(R)-EDP e 19(S),20(R)-EDP esters metil. In genere, sono presenti in un rapporto app...

Discussione

Vi presentiamo qui un metodo operativamente semplice ed economico per preparare i due metaboliti epossidici più abbondanti del DHA - 19,20 e 16,17-EDP. Questi acidi grassi epossidici possono essere preparati in forma altamente enantiopure (come il loro S,R-isomers) utilizzando l'enzima BM3 di tipo selvatico. Diversi punti critici che possono essere utilizzati per la risoluzione dei problemi, e l'estensione del nostro metodo per la preparazione di metaboliti epossidi enantiopure di AA ed EPA, sono descritti di s...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ammonium Bicarbonate	Sigma	9830	NA
Ampicillin	GoldBio	A30125	NA
Anhydrous magnesium sulfate	Fisher Scientific	M65-3	NA
Anhydrous methanol	Sigma-Aldrich	322515	NA
Anhydrous sodium sulfate	Fisher Scientific	S421-500	NA
Anhydrous toluene	Sigma-Aldrich	244511	NA
Arachidonic Acid (AA)	Nu-Chek Prep	U-71A	Air-sensitive.
Diethyl Ether	Sigma	296082	NA
DMSO (molecular biology grade)	Sigma-Aldrich	D8418	NA
Docosahexaenoic Acid (DHA)	Nu-Chek Prep	U-84A	Air-sensitive.
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	Invitrogen	15576028	NA
Eicosapentaenoic Acid (EPA)	Nu-Chek Prep	U-99A	Air-sensitive.
Ethyl acetate	Sigma	34858	NA
Flash column cartridges 25, 40, 4, 12 g sizes	Fisher Scientific	145170203, 145154064, 5170200	Alternatively, conventional column chromatography can be used
Formic acid (HPLC Grade)	J.T. Baker	0128-01	NA
Glycerol	Sigma	G7757	NA
Hexanes	VWR	BDH24575	NA
LB Broth	Sigma	L3022	NA
Lithium hydroxide	Sigma-Aldrich	442410	NA
Magnesium chloride	Fisher Scientific	2444-01	NA
Methanol (HPLC grade)	Sigma-Aldrich	34860-41-R	NA
NADPH Tetrasodium Salt	Sigma-Aldrich	481973	Air-sensitive.
Oxalic acid	Sigma-Aldrich	194131	NA
pBS-BM3 transfected DH5α E. coli	NA	NA	NA
PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride)	Sigma	P7626	Toxic!
Potassium Permanganate	Sigma-Aldrich	223468	For TLC staining.
Potassium phosphate dibasic	Sigma	795496	NA
Potassium phosphate monobasic	Sigma	795488	NA
Q Sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare life sciences)	Fisher Scientific	17-0515-01	For anion exchange purification of enzyme
Sodium Chloride	Sigma	71376	NA
Tetrahydrofuran, anhydrous	Sigma-Aldrich	186562	NA
TMS-Diazomethane (2.0 M in hexanes)	Sigma-Aldrich	362832	Very toxic.
Tris-HCl	GoldBio	T-400	NA
Also necessary:
Automatic flash purification system (we used a Buchi Reveleris X2)	Buchi
C18 HPLC column (Zorbax Eclipse XDB-C18)	Agilent
Centrifuge capable of 10,000 x g
Chiral HPLC Column (Lux cellulose-3), 250 x 4.6 mm, 5 µM, 1000 Å)	Phenomenex
General chemistry supplies: a 2 L separatory funnel, beakers and Erlenmeyer flasks with 1000-2000 L capacity, 20 mL vials, HPLC vials, small round-bottomed flasks and stir-bars.
HPLC (we use a Shimadzu Prominence LC-20AT analytical pump and SPD-20A UV-vis detector	Shimadzu
Nanodrop 2000 Spectrophotometer	Thermo-Fisher Scientific
NMR	NMR: Agilent DD2 spectrometer (500 MHz)
Rotary evaporator	Buchi
Sonic dismembrator or ultrasonic homogenizer	Cole-Parmer