Síntesis enzimática de metabolitos epepoxiizados de ácidos docosahexaenoico, eicosapentaenoico y aracidonico

Resumen

Presentamos un método útil para la síntesis enzimática a gran escala y la purificación de enantiómeros y regioiómeros específicos de epóxidos de ácido araquidónico (AA), ácido docosahexaenoico (DHA) y ácido eicosapentaenoico (EPA) con el uso de un citocromo bacteriano (AH), ácido docosahexaenoico (DHA), y ácido eicosapentaenoico (EPA) con el uso de un citocromo bacteriano (AA), ácido docosahexaenoico (DHA), y ácido eicosapentaenoico (EPA) con el uso de un citocromo bacteriano Enzima P450 (BM3).

Resumen

Los metabolitos epepoxiizados de varios ácidos grasos poliinsaturados (PUF), llamados ácidos grasos epoxi, tienen una amplia gama de funciones en la fisiología humana. Estos metabolitos son producidos endógenamente por la clase de enzimas del citocromo P450. Debido a sus diversos y potentes efectos biológicos, hay un interés considerable en el estudio de estos metabolitos. Determinar las funciones únicas de estos metabolitos en el cuerpo es una tarea difícil, ya que los ácidos grasos epoxi primero deben obtenerse en cantidades significativas y con alta pureza. La obtención de compuestos de fuentes naturales es a menudo intensiva en mano de obra, y las hidrolasas de epóxido soluble (sEH) hidrolizan rápidamente los metabolitos. Por otro lado, la obtención de estos metabolitos a través de reacciones químicas es muy ineficiente, debido a la dificultad de obtener regioisomers y enantiómeros puros, bajos rendimientos y purificación extensa (y costosa). Aquí, presentamos una síntesis enzimática eficiente de 19(S),20(R)- y 16(S),17(R)-ácidos epoxidocosapentaenoicos (EDP) de DHA a través de epoxidación con BM3, una enzima bacteriana CYP450 aislada originalmente de Bacillus megaterium (que se expresa fácilmente en Escherichia coli). La caracterización y determinación de la pureza se realiza con espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN), cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) y espectrometría de masas (MS). Este procedimiento ilustra los beneficios de la síntesis enzimática de metabolitos epoxi PUFA, y es aplicable a la epoxidación de otros ácidos grasos, incluyendo ácido araquidónico (AA) y ácido eicosapentaenoico (EPA) para producir el epoxieicosatrienoico análogo ácidos (EAT) y ácidos epoxiicosatetraenoicos (EEQ), respectivamente.

Introducción

Como el interés en el papel que juegan los ácidos grasos poliinsaturados (particularmente los ácidos grasos poliinsaturados omega-3 y omega-6) en la biología humana ha crecido en los últimos años, los investigadores han tomado nota de la amplia gama de beneficios atractivos que sus metabolitos Exhiben. En particular, los metabolitos de ácidos grasos epoxi producidos por la clase de enzimas del citocromo P450 han sido un gran punto de enfoque. Por ejemplo, muchos epóxidos de PUFA, incluidos los ácidos epoxiicosatrienoicos (EET), los ácidos epoxidocosapentaenoico (EDP) y los ácidos epoxiicosatetraenoicos (EEQ), desempeñan un papel crítico en la regulación de la presión arterial y la inflamación^{1,2 , 3 , 4 , 5}. Curiosamente, los enantiómeros específicos y regioisomers de aA y EPóxidos EPA son conocidos por tener efectos variables sobre vasoconstricción^6,7. Si bien se han documentado los efectos fisiológicos de los enantiómeros y regioisomemeros de los EET y los EEQ, poco se sabe sobre el efecto de los ácidos epoxicosapentaenoicos análogos (EDP) formados a partir de DHA. El uso generalizado del aceite de pescado⁸, que es rico tanto en EPA como en DHA, también ha despertado interés en los EDP^9. Los beneficios de estos suplementos se cree que son en parte debido a los metabolitos DHA aguas abajo (16,17-EDP y 19,20-EDP siendo los más abundantes) porque los niveles in vivo de EDPs se coordinan muy bien con la cantidad de DHA en la dieta^{10, 11}.

El estudio de los mecanismos y objetivos de estos ácidos grasos epoxi por metabolómica, biología química y otros métodos ha resultado desafiante, en parte porque existen como mezclas de isómeros regio y estéreo, y un método para obtener cantidades puras de la enantiómeros y regioisomers. Los medios convencionales para sintetizar químicamente estos compuestos han demostrado ser ineficaces. El uso de peroxyacids como el ácido meta-cloroperoxybenzoic para la epoxidación tiene muchos inconvenientes, en particular la falta de selectividad de la emiratoje, que requiere una purificación costosa y meticulosa de los regioiómeros y enantiómeros individuales. La síntesis total de los metabolitos DHA y EPA es posible, pero también sufre de inconvenientes que lo hacen poco práctico para la síntesis a gran escala como altos costos y bajos rendimientos^12,13. La producción global eficiente se puede lograr con síntesis enzimática, ya que las reacciones enzimáticas son regio- y estereoselectiva¹⁴. Los estudios demuestran que la epoxidación enzimática de AA y EPA (con BM3) es a la vez regioselectiva y enantioselectiva^15,16,17,18, pero este procedimiento no ha sido probado con DHA, o en un gran Escala. El objetivo general de nuestro método era escalar y optimizar esta epoxidación quimioenzimática para producir rápidamente cantidades significativas de ácidos grasos epoxi puros como sus enantiómeros individuales. Utilizando el método presentado aquí, los investigadores tienen acceso a una estrategia simple y rentable para la síntesis de EDPs y otros metabolitos epoxi PUFA.

Protocolo

ADVERTENCIA: Consulte todas las fichas de datos de seguridad de materiales (MSDS) pertinentes antes de utilizar los productos químicos enumerados.

1. Expresión de bm3 de tipo salvaje

1. Inoculación pBS-BM3 transfectó DH5 e. coli (una generosa donación del Dr. F. Ann Walker) en 5 ml de caldo lb estéril con 0,5 mg de ampicilina añadida en un tubo de cultivo de 20 ml.
2. Incubar el cultivo celular en una coctelera a 37oC durante 24 h a 200 rpm. Añadir el cultivo de arranque durante la noche (5 ml) y 100 mg de ampicilina a 1 L de caldo estéril LB en un matraz Fernbach o Erlenmeyer. Agitar a 37oC durante 6 h a 200 rpm, luego a 30oC durante 18 h a 200 rpm.
3. Recoger y centrifugar el cultivo celular a 4 oC durante 10 min a 1.000 x g. Deseche el sobrenadante y almacene el pellet celular a -78 oC hasta la purificación de enzimas.
   NOTA: El sobrenadante puede ser esterilizado químicamente por el tratamiento con lejía o esterilizado usando un autoclave y luego vertido por el drenaje.

2. Purificación de BM3.

1. Lisis celular
   1. Descongelar el pellet celular sobre hielo y resuspender en 40 ml de tampón de solubilización helada (4oC) (10 mM Tris, 0,01 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonil (PMSF;), 0,01 mM EDTA; pH 7,8).
      ADVERTENCIA: PMSF es tóxico por contacto.
   2. Mientras que en el hielo, sonicar las células durante 1 min con un homogeneizador ultrasónico (ajuste de potencia de salida 10, deber 100%), seguido de una rotura de 1 min en el hielo con el fin de atisiar las células. Repita este procedimiento 6 veces. Centrifugar el lisado celular a 4 oC durante 30 minutos a 11.000 x g a los desechos de células de pellets.
2. Cromatografía de afinidad
   1. Preparar una columna de cromatografía de intercambio de aniones fuerte (ver Tabla de Materiales;diámetro: 2,8 cm x 6 cm, volumen de columna: 37 mL) lavando con 5 volúmenes de columna (CV) del tampón A (10 mM Tris, pH 7,8) a 4 oC.
   2. Agregue los lysates de celda a la columna equilibrada y lave la columna con 3 CV de búfer frío A. Elute el BM3 lavando la columna con tampón frío B (10 mM Tris, 600 mM NaCl, 6 CV).
   3. Recoger la fracción eluyente de color marrón rojizo. Si la proteína no se utiliza inmediatamente, mezcle con un volumen igual de glicerol y congelación de flash con nitrógeno líquido. Almacene la solución congelada a -78 oC.

3. Epoxidación de DHA por BM3

1. Preparar la reacción añadiendo 0.308 g (0.940 mmol) de DHA en 18,8 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) a 2 Lde tampón de reacción de agitación (0,12 M de fosfato de potasio, 5 mM MgCl 2, pH 7.4) junto con 20 nM de la enzima desmoldeada BM3. La concentración enzimática puede determinarse por el método de ensayo espectral de monóxido/ditonita de carbono¹⁹.
2. Mientras la solución se agita, comience la reacción añadiendo 1 equivalente de NADPH (nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducido, sal de tetrasodio, 0.808 g, 0.940 mmol) disuelto en tampón de reacción. Revuelva la reacción durante 30 minutos mientras burbujean el aire a través de la mezcla de reacción con un globo lleno de aire unido a una jeringa y una aguja.
3. Utilizando un espectrofotómetro (ver Tabla de Materiales),compruebe la absorbancia de la mezcla de reacción a 340 nm para determinar si NADPH está agotada. Si no queda ninguna absorbancia que indique el consumo de NADPH, la reacción se ha completado.
   NOTA: Por lo general, la reacción se completa después de 30 min.
4. Quena la mezcla de reacción añadiendo lentamente 1 M de ácido oxálico, en sentido de gota, hasta que el pH de la solución alcance 4.

4. Extracción de EDPs

1. Extraiga la solución tampón apamié con 2 L de éter dietílico (anhidro, libre de peróxido) 3 veces. Recoger la capa de éter (6 L) y secar con sulfato de magnesio anhidro (MgSO₄).
2. Filtre el MgSO₄ de la solución y concentre la capa de éter seco en un evaporador rotativo para producir el residuo de EDP crudo.
3. Purificar el residuo mediante cromatografía de columna flash (un cartucho de sílice de 40 g es suficiente). Comience con 10% de acetato de etilo (EtOAc) en hexanos y rampa de hasta 60% EtOAc en hexanos de más de 22 min.
   NOTA: Se obtienen y recogen tres picos principales, eluyéndose en el orden de 1. DHA no reaccionado; 2. mezcla de isómeros EDP; y 3. diepoxido (productos normales de sobreoxidación (ver Figura 1)).
4. Combine las fracciones y concéntrelas en el evaporador rotatorio. A partir de este ejemplo, 0,074 g, (24%) de DHA no reaccionado, 0,151 g (47%) isómeros EDP, y 0,076 g, (22%) de di-epoxide.

5. Esterificación de los EDP, separación de 16(S),17(R)- y 19(S),20(R)-EDP, y saponificación de ésteres

ADVERTENCIA: El trimetilsilyldiazometano (TMS-diazometano) es muy tóxico tanto por contacto como por inhalación. Utilícelo únicamente en una campana de humos con el equipo de protección personal adecuado.

1. Diluir los epóxidos (0,151 g, 0,435 mmol) en un matraz de fondo redondo o vial pequeño con 2 ml de metanol anhidro (MeOH) y 3 ml de tolueno anhidro, añadir una barra de agitación, y añadir TMS-diazometano (1,2 equivalentes molares, o 0,26 ml de una solución de 2 M en hexánicos) bajo argón.
2. Espere 10 min y agregue TMS-diazometano adicional (0.050 mL) hasta que permanezca un color amarillo pálido.
3. Después de 30 min, concentre cuidadosamente la mezcla utilizando el evaporador rotativo y purifique el residuo mediante cromatografía de columna flash. Eluir con 4% EtOAc en hexanos (usando una columna o cartucho de gel de sílice de 40 g) durante 22 min. En este ejemplo, 19,20-EDP éster metílico (0,116 g, 74%) y 16,17-EDP éster metílico (0,029 g, 19%), se obtuvieron como aceites claros (rendimiento total, 93%).
4. Recoger las fracciones que contienen los regioisomemeros de éster metílico EDP purificado. 19(S),20(R)-EDP metil éster elutes primero, seguido por 16(S),17(R)-EDP éster metílico.
5. Si quedan fracciones mixtas (que contienen ambos isómeros; se pueden evaluar mediante cromatografía de capa delgada (TLC) en 8:1 hexano/EtOAc y se tiñen con permanganato de potasio (KMnO₄)), recromatógrafo con el mismo sistema de disolvente que antes.
6. Concentrar las fracciones que contienen los regioisomers individuales.
   NOTA: En este punto, la RMN puede evaluar la identidad y la pureza (utilizando CDCl₃ como disolvente; véase la leyenda de la Figura2).
7. Para convertir regioisomers de éster metílico EDP individuales a sus formas ácidas, diluir el éster EDP en THF:agua (aproximadamente 0,7 mL/0,1 mmol de éster). Añadir 2 M liOH acuoso (3 equivalentes molares) y remover durante la noche.
   NOTA: La integridad de la reacción puede ser evaluada por TLC, usando 3:1 hexanos/EtOAc, manchando con KMnO₄; el producto tiene un factor de retención de 0,3.
8. Atemple la reacción lentamente con ácido fórmico, hasta que el pH de la mezcla alcance 3-4. Añadir agua y acetato de etilo (1-2 mL/0.100 mmol de éster) y separar las capas. Extraiga la capa de agua con EtOAc (3 x 5 ml), lave con solución de salmuera saturada (NaCl) y seque la capa EtOAc sobre sulfato sódico anhidro (Na₂SO_4).
9. Concentrar la solución de acetato de etilo con un evaporador rotativo, añadir hexanos (10 ml) y concentrar de nuevo. Repita dos veces para eliminar azeotropicalmente el ácido fórmico residual. Purificar el residuo mediante cromatografía de columna flash, eluyente con 10-30% EtOAc durante 15 min.
10. Concentrar las fracciones deseadas y secar en vacuo para permitir el ácido purificado.
    NOTA: En esta etapa, se puede evaluar la pureza enantiomérica (por HPLC quiral, vea las leyendas de la Figura 3 - Figura 4 para la columna y las condiciones). La pureza química puede ser evaluada por C18 (achiral) HPLC (ver Tabla de Materiales y referencia 14).

Resultados

El cromatograma de la columna flash (realizado utilizando un sistema automatizado de purificación de flash como se describe a continuación) obtenido tras la purificación de la mezcla bruta a partir de la epoxidación enzimática se muestra en la Figura1. Tras la esterificación y separación de los regioisomers, se obtuvieron ésteres metílicos puros de 16( S),17(R)-EDP y 19(S),20(R)-EDP. Típicamente, están presentes ...

Discusión

Presentamos aquí un método operativo simple y rentable para preparar los dos metabolitos epoxi más abundantes de DHA - 19,20 y 16,17-EDP. Estos ácidos grasos epoxi se pueden preparar en forma altamente enantiopure (como sus isómeros S,R)utilizando enzima BM3 de tipo salvaje. A continuación se describen varios puntos críticos que se pueden utilizar para la solución de problemas y la extensión de nuestro método para preparar metabolitos epoxi enantiopuros de AA y EPA.

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ammonium Bicarbonate	Sigma	9830	NA
Ampicillin	GoldBio	A30125	NA
Anhydrous magnesium sulfate	Fisher Scientific	M65-3	NA
Anhydrous methanol	Sigma-Aldrich	322515	NA
Anhydrous sodium sulfate	Fisher Scientific	S421-500	NA
Anhydrous toluene	Sigma-Aldrich	244511	NA
Arachidonic Acid (AA)	Nu-Chek Prep	U-71A	Air-sensitive.
Diethyl Ether	Sigma	296082	NA
DMSO (molecular biology grade)	Sigma-Aldrich	D8418	NA
Docosahexaenoic Acid (DHA)	Nu-Chek Prep	U-84A	Air-sensitive.
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	Invitrogen	15576028	NA
Eicosapentaenoic Acid (EPA)	Nu-Chek Prep	U-99A	Air-sensitive.
Ethyl acetate	Sigma	34858	NA
Flash column cartridges 25, 40, 4, 12 g sizes	Fisher Scientific	145170203, 145154064, 5170200	Alternatively, conventional column chromatography can be used
Formic acid (HPLC Grade)	J.T. Baker	0128-01	NA
Glycerol	Sigma	G7757	NA
Hexanes	VWR	BDH24575	NA
LB Broth	Sigma	L3022	NA
Lithium hydroxide	Sigma-Aldrich	442410	NA
Magnesium chloride	Fisher Scientific	2444-01	NA
Methanol (HPLC grade)	Sigma-Aldrich	34860-41-R	NA
NADPH Tetrasodium Salt	Sigma-Aldrich	481973	Air-sensitive.
Oxalic acid	Sigma-Aldrich	194131	NA
pBS-BM3 transfected DH5α E. coli	NA	NA	NA
PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride)	Sigma	P7626	Toxic!
Potassium Permanganate	Sigma-Aldrich	223468	For TLC staining.
Potassium phosphate dibasic	Sigma	795496	NA
Potassium phosphate monobasic	Sigma	795488	NA
Q Sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare life sciences)	Fisher Scientific	17-0515-01	For anion exchange purification of enzyme
Sodium Chloride	Sigma	71376	NA
Tetrahydrofuran, anhydrous	Sigma-Aldrich	186562	NA
TMS-Diazomethane (2.0 M in hexanes)	Sigma-Aldrich	362832	Very toxic.
Tris-HCl	GoldBio	T-400	NA
Also necessary:
Automatic flash purification system (we used a Buchi Reveleris X2)	Buchi
C18 HPLC column (Zorbax Eclipse XDB-C18)	Agilent
Centrifuge capable of 10,000 x g
Chiral HPLC Column (Lux cellulose-3), 250 x 4.6 mm, 5 µM, 1000 Å)	Phenomenex
General chemistry supplies: a 2 L separatory funnel, beakers and Erlenmeyer flasks with 1000-2000 L capacity, 20 mL vials, HPLC vials, small round-bottomed flasks and stir-bars.
HPLC (we use a Shimadzu Prominence LC-20AT analytical pump and SPD-20A UV-vis detector	Shimadzu
Nanodrop 2000 Spectrophotometer	Thermo-Fisher Scientific
NMR	NMR: Agilent DD2 spectrometer (500 MHz)
Rotary evaporator	Buchi
Sonic dismembrator or ultrasonic homogenizer	Cole-Parmer