Synthèse enzymatique des métabolites époxidisés de Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic, et Arachidonic Acids

Résumé

Nous présentons une méthode utile pour la synthèse et la purification enzymatiques à grande échelle des enantiomers et des regioisomers spécifiques des époxydes de l'acide arachidonique (AA), de l'acide docosahexaénoïque (DHA), et de l'acide eicosapentaénoïque (EPA) avec l'utilisation d'un cytochrome bactérien P450 enzyme (BM3).

Résumé

Les métabolites époxidés de divers acides gras polyinsaturés (PUFAs), appelés acides gras époxy, ont un large éventail de rôles dans la physiologie humaine. Ces métabolites sont produits endogènement par la classe cytochrome P450 d'enzymes. En raison de leurs effets biologiques divers et puissants, il y a un intérêt considérable dans l'étude de ces métabolites. Déterminer les rôles uniques de ces métabolites dans le corps est une tâche difficile, car les acides gras époxy doivent d'abord être obtenus en quantités significatives et avec une grande pureté. L'obtention de composés à partir de sources naturelles est souvent laborieuse, et les hydrolases solubles d'époxyde (sEH) hydrolysent rapidement les métabolites. D'autre part, l'obtention de ces métabolites par des réactions chimiques est très inefficace, en raison de la difficulté d'obtenir des regioisomers purs et des enantiomères, de faibles rendements, et la purification étendue (et coûteuse). Ici, nous présentons une synthèse enzymatique efficace de 19(S), 20(R)- et 16(S), 17(R)-epoxydocosapentaenoic acids (EDP) from DHA via epoxidation with BM3, a bacterial CYP450 enzyme isolated originally from Bacillus mégaterium (qui s'exprime facilement dans Escherichia coli). La caractérisation et la détermination de la pureté sont effectuées avec la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN), la chromatographie liquide à haute performance (HPLC) et la spectrométrie de masse (MS). Cette procédure illustre les avantages de la synthèse enzymatique des métabolites époxy PUFA, et s'applique à l'époxidation d'autres acides gras, y compris l'acide arachidonique (AA) et l'acide eicosapentaenoic (EPA) pour produire l'époxyeicosatrienoic analogue acides époxyeicosatetraenoic (EEQ), respectivement.

Introduction

Comme l'intérêt pour le rôle que les acides gras polyinsaturés (en particulier les acides gras oméga-3 et oméga-6 gras polyinsaturés) jouent dans la biologie humaine a augmenté ces dernières années, les chercheurs ont pris connaissance de la large gamme d'avantages attrayants que leurs métabolites pièce. En particulier, les métabolites d'acide gras époxy produits par la classe cytochrome P450 d'enzymes ont été un grand point de discussion. Par exemple, de nombreux époxydes PUFA, y compris les acides époxyeicosatrienoic (EET), les acides époxydocosapentaenoic (EDP) et les acides époxyeicosatetraenoic (EEQ), jouent un rôle critique dans la régulation de la tension artérielle et de l'inflammation^{1,2 , 3 (en) , 4 ( en} plus) ^{, 5}. Fait intéressant, les enantiomères spécifiques et les regioisomers des époxydes AA et EPA sont connus pour avoir des effets variables sur la vasoconstriction^6,7. Tandis que les effets physiologiques des enantiomers et des regioisomers des EET et des EEQs ont été documentés, peu est connu au sujet de l'effet des acides éoxydocoentaénoïques analogues (EDP) formés à partir de DHA. L'utilisation généralisée de l'huile de poisson⁸, qui est riche en EPA et En DHA, a également suscité l'intérêt pour les PDE⁹. Les avantages de ces suppléments sont censés être en partie dus aux métabolites en aval de DHA (16,17-EDP et 19,20-EDP étant les plus abondants) parce que les niveaux in vivo des EDP coordonnent très bien avec la quantité de DHA dans le régime^{10,, 11}.

L'étude des mécanismes et des cibles de ces acides gras époxy par la métabolomique, la biologie chimique, et d'autres méthodes s'est avérée provocante, en partie parce qu'elles existent en tant que mélanges de regio- et de stéréo-isomers, et une méthode d'obtenir des quantités pures de la enantiomers et regioisomers est nécessaire. Les moyens conventionnels pour synthétiser chimiquement ces composés se sont avérés inefficaces. L'utilisation de peroxyacids comme l'acide méta-chloroperoxybenzoïque pour l'époxidation présente de nombreux inconvénients, notamment le manque de sélectivité de l'époxidation, qui nécessite une purification coûteuse et minutieuse des regioisomers et des enantiomères individuels. La synthèse totale des métabolites de DHA et d'EPA est possible, mais souffre également des inconvénients qui le rendent peu pratique pour la synthèse à grande échelle telle que les coûts élevés et les rendements bas^12,13. Une production globale efficace peut être réalisée avec la synthèse enzymatique, car les réactions enzymatiques sont regio- et stéréosélective¹⁴. Les études montrent que l'époxidation enzymatique de l'AA et de l'EPA (avec BM3) est à la fois regioselective et enantioselective^15,16,17,18, mais cette procédure n'a pas été testée avec DHA, ou sur un grand échelle. L'objectif global de notre méthode était d'augmenter et d'optimiser cette époxidation chimioenzymatique pour produire rapidement des quantités significatives d'acides gras époxy purs comme leurs enantiomères individuels. En utilisant la méthode présentée ici, les chercheurs ont accès à une stratégie simple et rentable pour la synthèse des PDE et d'autres métabolites époxy PUFA.

Protocole

CAUTION : Veuillez consulter toutes les fiches de données pertinentes sur la sécurité des matériaux (MSDS) avant d'utiliser les produits chimiques énumérés.

1. Expression de type sauvage BM3

1. Inoculer le pBS-BM3 transfecté DH5MD E. coli (un don généreux du Dr F. Ann Walker) dans 5 ml de bouillon lb stérile avec 0,5 mg d'ampicilline ajouté dans un tube de culture de 20 ml.
2. Incuber la culture cellulaire dans un shaker à 37 oC pour 24 h à 200 tr/min. Ajouter la culture de démarrage de nuit (5 ml) et 100 mg d'ampicilline à 1 L de bouillon stérile DE LB dans un flacon Fernbach ou Erlenmeyer. Secouer à 37 oC pendant 6 h à 200 tr/min, puis à 30 oC pour 18 h à 200 tr/min.
3. Recueillir et centrifuger la culture cellulaire à 4 oC pendant 10 min à 1 000 xg. Jeter le supernatant et stocker le granule de cellules à -78 oC jusqu'à ce que la purification enzymatique.
   REMARQUE : Le supernatant peut être soit chimiquement stérilisé par traitement à l'eau de Javel ou stérilisé à l'aide d'un autoclave, puis versé dans le drain.

2. Purification de BM3.

1. Lyse cellulaire
   1. Décongeler le granule de cellules sur la glace et le resuspendre dans 40 ml de tampon de solubilisation glacé (4 oC) (10 mM Tris, 0,01 mM de fluorure de phénylmethylsulfonyle (PMSF;), 0,01 mM EDTA; pH 7,8).
      CAUTION: PMSF est toxique par contact.
   2. Sur la glace, sonicate les cellules pendant 1 min avec un homogénéisateur à ultrasons (réglage de puissance de sortie 10, service 100%), suivi d'une pause de 1 min sur la glace afin de lyser les cellules. Répétez cette procédure 6 fois. Centrifuger la cellule lysais à 4 oC pendant 30 min à 11 000 x g de débris de cellules à granulés.
2. Chromatographie d'affinité
   1. Préparer une forte colonne de chromatographie d'échange d'anion (voir Tableau des matériaux; diamètre : 2,8 cm x 6 cm, volume de colonne : 37 ml) en lavant avec 5 volumes de colonnes (CV) de tampon A (10 mM Tris, pH 7,8) à 4 oC.
   2. Ajouter les lysates cellulaires à la colonne libéetée et laver la colonne avec 3 CV de tampon froid A. Elute le BM3 en lavant la colonne avec tampon froid B (10 mM Tris, 600 mM NaCl, 6 CV).
   3. Recueillir la fraction d'élude brun-rougeâtre. Si la protéine n'est pas utilisée immédiatement, mélangez-la avec un volume égal de glycérol et de gel éclair avec de l'azote liquide. Conserver la solution congelée à -78 oC.

3. Epoxidation de DHA par BM3

1. Préparer la réaction en ajoutant 0,308 g (0,940 mmol) de DHA en 18,8 ml de diméthylsulfoxide (DMSO) à 2 L de tampon de réaction en remuant (0,12 M de phosphate de potassium, 5 mM MgCl₂, pH 7,4) avec 20 nM de l'enzyme BM3 décongelée. La concentration enzymatique peut être déterminée par la méthode d'analyse spectrale du monoxyde de carbone/dithionite¹⁹.
2. Pendant que la solution est en remuant, commencer la réaction en ajoutant 1 équivalent de NADPH (nicotinamide adénine dinuccléotide phosphate réduit, sel tétrasodium, 0,808 g, 0,940 mmol) dissous dans le tampon de réaction. Remuer la réaction pendant 30 min tout en bouillonnant l'air à travers le mélange de réaction avec un ballon rempli d'air attaché à une seringue et une aiguille.
3. À l'aide d'un spectrophotomètre (voir Tableau des matériaux),vérifiez l'absorption du mélange de réaction à 340 nm pour déterminer si le NADPH est épuisé. S'il n'y a pas d'absorption restante indiquant la consommation de NADPH, la réaction est complète.
   REMARQUE: Typiquement, la réaction est complète après 30 min.
4. Étancher le mélange de réaction en ajoutant lentement 1 M d'acide oxalique, goutte à goutte, jusqu'à ce que le pH de la solution atteigne 4.

4. Extraction de PDE

1. Extraire la solution tampon étanchée avec 2 L d'éther diéthyle (anhyde, sans peroxyde) 3 fois. Recueillir la couche d'éther (6 L) et sécher avec du sulfate de magnésium anhydre (MgSO₄).
2. Filtrer le MgSO₄ de la solution et concentrer la couche d'éther séchée sur un évaporateur rotatif pour produire les résidus bruts edP.
3. Purifier les résidus par chromatographie à colonne flash (une cartouche de silice de 40 g suffit). Commencez à 10% d'acétate d'éthyle (EtOAc) en hexanes et rampe jusqu'à 60% EtOAc en hexanes de plus de 22 min.
   REMARQUE : Trois pics majeurs sont obtenus et collectés, élichant de l'ordre de 1. DHA non réagis; 2. mélange d'isores EDP; et 3. di-époxyde (produits normaux de suroxydation (voir figure 1)).
4. Mélanger les fractions et les concentrer sur l'évaporateur rotatif. De cet exemple, 0,074 g, (24 %) de DHA non réagi, 0,151 g (47%) des isoreurs EDP, et 0,076 g, (22%) de di-époxide ont été obtenus.

5. Estérification des PDE, séparation de 16(S), 17(R)- et 19(S), 20(R)-EDP, et saponification des esters

CAUTION : Le trimethylsilyldiazométhane (TMS-diazométhane) est très toxique par contact et par inhalation. Utilisez seulement dans une hotte de fumée avec l'équipement de protection individuelle approprié.

1. Diluer les époxydes (0,151 g, 0,435 mmol) dans un flacon à fond rond ou une petite fiole avec 2 ml de méthanol anhydre (MeOH) et 3 ml de toluène anhydre, ajouter une barre à remous, et ajouter TMS-diazométhane (1,2 équivalent molaire, ou 0,26 ml d'une solution de 2 Ml en hexanes) sous l'argon.
2. Attendez 10 min et ajoutez du TMS-diazométhane supplémentaire (0,050 ml) jusqu'à ce qu'il reste une couleur jaune pâle.
3. Après 30 min, concentrer soigneusement le mélange à l'aide de l'évaporateur rotatif et purifier les résidus par chromatographie à colonne flash. Elute avec 4% EtOAc en hexanes (à l'aide d'une colonne ou d'une cartouche de gel de silice de 40 g) pendant 22 min. Dans cet exemple, 19,20-EDP ester méthyle (0,116 g, 74%) et 16,17-EDP ester méthyle (0,029 g, 19%), ont été obtenus comme huiles claires (rendement total, 93%).
4. Recueillir les fractions contenant les regioisomers purifiés EDP ester ester. 19(S), 20(R)-EDP ester elutes first, followed by 16(S),17(R)-EDP methyl ester.
5. S'il reste des fractions mixtes (contenant les deux isomères; peuvent être évaluées par chromatographie à couches minces (TLC) en 8:1 hexane/EtOAc et tachées de permanganate de potassium (KMnO 4)), les re-chromatographe avec le même système de solvants qu'auparavant.
6. Concentrez les fractions contenant les regioisomers individuels.
   REMARQUE : À ce stade, l'identité et la pureté peuvent être évaluées par la RMN (en utilisant cDCl₃ comme solvant; voir la légende de la figure 2).
7. Pour convertir les regioisomers d'ester de méthyle d'EDP individuels à leurs formes acides, diluer l'ester d'EDP dans THF:water (approximativement 0.7 mL/0.1 mmol d'ester). Ajouter 2 M liOH aqueux (3 équivalents molaires) et remuer toute la nuit.
   REMARQUE: L'exhaustivité de la réaction peut être évaluée par TLC, en utilisant 3:1 hexanes/EtOAc, coloration avec KMnO_4; le produit a un facteur de rétention de 0,3.
8. Étancher la réaction lentement avec de l'acide formique, jusqu'à ce que le pH du mélange atteigne 3-4. Ajouter l'eau et l'acétate d'éthyle (1-2 mL/0,100 mmol d'ester) et séparer les couches. Extraire la couche d'eau avec EtOAc (3 x 5 ml), laver avec la solution de saumure saturée (NaCl) et sécher la couche EtOAc sur le sulfate de sodium anhydre (Na₂SO₄).
9. Concentrer la solution d'acétate d'éthyle à l'aide d'un évaporateur rotatif, ajouter les hexanes (10 ml) et se concentrer à nouveau. Répéter deux fois pour enlever l'acide formique résiduel. Purifie le résidu par chromatographie de colonne flash, eluting avec 10-30% EtOAc plus de 15 min.
10. Concentrez les fractions désirées et séchez dans le vacuo pour se permettre l'acide purifié.
    REMARQUE : À ce stade, la pureté enantiomérique peut être évaluée (par Chiraquien HPLC, voir les légendes de la figure 3 - Figure 4 pour les colonnes et les conditions). La pureté chimique peut être évaluée par C18 (achiral) HPLC (voir Tableau des matériaux et référence 14).

Résultats

Le chromatogramme de colonne flash (exécuté à l'aide d'un système automatisé de purification flash tel que décrit ci-dessous) obtenu lors de la purification du mélange brut de l'époxidation enzymatique est montré dans la figure 1. Après l'estérification et la séparation des regioisomers, des esters purs 16(S), 17(R)-EDP et 19(S), 20(R)-EDP esters méthylaux ont été obtenus. Typiquement, ils sont présents dans...

Discussion

Nous présentons ici une méthode opérationnellement simple et rentable pour préparer les deux métabolites époxy les plus abondants de DHA - 19,20 et 16,17-EDP. Ces acides gras époxy peuvent être préparés en très enantiopure (comme leur S,R-isomers) forme en utilisant l'enzyme de type sauvage BM3. Plusieurs points critiques qui peuvent être utilisés pour le dépannage, et l'extension de notre méthode à la préparation des métabolites époxy éantiopure de AA et EPA, sont décrits ci-dessous.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ammonium Bicarbonate	Sigma	9830	NA
Ampicillin	GoldBio	A30125	NA
Anhydrous magnesium sulfate	Fisher Scientific	M65-3	NA
Anhydrous methanol	Sigma-Aldrich	322515	NA
Anhydrous sodium sulfate	Fisher Scientific	S421-500	NA
Anhydrous toluene	Sigma-Aldrich	244511	NA
Arachidonic Acid (AA)	Nu-Chek Prep	U-71A	Air-sensitive.
Diethyl Ether	Sigma	296082	NA
DMSO (molecular biology grade)	Sigma-Aldrich	D8418	NA
Docosahexaenoic Acid (DHA)	Nu-Chek Prep	U-84A	Air-sensitive.
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	Invitrogen	15576028	NA
Eicosapentaenoic Acid (EPA)	Nu-Chek Prep	U-99A	Air-sensitive.
Ethyl acetate	Sigma	34858	NA
Flash column cartridges 25, 40, 4, 12 g sizes	Fisher Scientific	145170203, 145154064, 5170200	Alternatively, conventional column chromatography can be used
Formic acid (HPLC Grade)	J.T. Baker	0128-01	NA
Glycerol	Sigma	G7757	NA
Hexanes	VWR	BDH24575	NA
LB Broth	Sigma	L3022	NA
Lithium hydroxide	Sigma-Aldrich	442410	NA
Magnesium chloride	Fisher Scientific	2444-01	NA
Methanol (HPLC grade)	Sigma-Aldrich	34860-41-R	NA
NADPH Tetrasodium Salt	Sigma-Aldrich	481973	Air-sensitive.
Oxalic acid	Sigma-Aldrich	194131	NA
pBS-BM3 transfected DH5α E. coli	NA	NA	NA
PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride)	Sigma	P7626	Toxic!
Potassium Permanganate	Sigma-Aldrich	223468	For TLC staining.
Potassium phosphate dibasic	Sigma	795496	NA
Potassium phosphate monobasic	Sigma	795488	NA
Q Sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare life sciences)	Fisher Scientific	17-0515-01	For anion exchange purification of enzyme
Sodium Chloride	Sigma	71376	NA
Tetrahydrofuran, anhydrous	Sigma-Aldrich	186562	NA
TMS-Diazomethane (2.0 M in hexanes)	Sigma-Aldrich	362832	Very toxic.
Tris-HCl	GoldBio	T-400	NA
Also necessary:
Automatic flash purification system (we used a Buchi Reveleris X2)	Buchi
C18 HPLC column (Zorbax Eclipse XDB-C18)	Agilent
Centrifuge capable of 10,000 x g
Chiral HPLC Column (Lux cellulose-3), 250 x 4.6 mm, 5 µM, 1000 Å)	Phenomenex
General chemistry supplies: a 2 L separatory funnel, beakers and Erlenmeyer flasks with 1000-2000 L capacity, 20 mL vials, HPLC vials, small round-bottomed flasks and stir-bars.
HPLC (we use a Shimadzu Prominence LC-20AT analytical pump and SPD-20A UV-vis detector	Shimadzu
Nanodrop 2000 Spectrophotometer	Thermo-Fisher Scientific
NMR	NMR: Agilent DD2 spectrometer (500 MHz)
Rotary evaporator	Buchi
Sonic dismembrator or ultrasonic homogenizer	Cole-Parmer