تقييم الحث علي الاكتئاب علي المدى الطويل في شرائح البالغين المخيخار

Summary

في بعض الكائنات التي تتلاعب بالجينات ، قد يفشل استخدام بروتوكول واحد للحث علي المحدودة في خلايا Purkinje المخيخ ، وقد يكون هناك اختلاف بين المحدودة والتعلم الحركي. بروتوكولات متعددة ضرورية لتقييم التعريفي المحدودة في الكائنات التي تتلاعب بالجينات. يتم عرض البروتوكولات القياسية.

Abstract

اللدونة متشابك يوفر اليه للتعلم والذاكرة. للتعلم المحرك المخيخ ، والاكتئاب علي المدى الطويل (المحدودة) من الإرسال متشابك من ألياف المتوازية (PF) إلى الخلايا Purkinje (PC) يعتبر أساسا للتعلم الحركي ، ولوحظت أوجه القصور في كل من المحدودة والتعلم الحركي في مختلف التلاعب بالجينات الحيوانية. واستخدمت مجموعات التعلم الحركي المشتركة ، مثل التكيف مع منعكس حركه اللااراديه (okr) ، منعكس الدهليزية العين (VOR) ، واختبار rotarod لتقييم قدره التعلم الحركي. ومع ذلك ، أظهرت النتائج التي تم الحصول عليها من محطه GluA2-كربوكسي المعدلة في الفئران التكيف الطبيعي لل VOR و OKR ، علي الرغم من نقص PF-المحدودة. وفي ذلك التقرير ، تمت محاولة الحث علي المحدودة فقط باستخدام نوع واحد من بروتوكول التحفيز في درجه حرارة الغرفة. وهكذا ، تم استكشاف الظروف التي تحفز المخيخ المحدودة في نفس الطرق في المسوخ باستخدام بروتوكولات مختلفه في درجه حرارة الفسيولوجية القريبة. وأخيرا ، وجدنا بروتوكولات التحفيز ، التي يمكن ان يسببها المحدودة في هذه الفئران التلاعب الجينات. في هذه الدراسة ، يتم اقتراح مجموعه من البروتوكولات لتقييم التعريفي المحدودة ، والتي سوف تسمح بشكل أكثر دقه فحص العلاقة السببية بين المحدودة والتعلم الحركي. في الختام ، الظروف التجريبية حاسمه عند تقييم المحدودة في الفئران التلاعب الجينات.

Introduction

وقد تم توضيح التنظيم متشابك من الشبكات العصبية المفصلة من القشرة المخيخ ، وتتالف من أجهزه الكمبيوتر ، والخلايا العصبية الطبقة الجزيئية (سله والخلايا النجميه) ، golgi الخلية ، PFs من الخلايا الحبيبية ، وألياف المطحلب وتسلق ألياف (CFs) ، من حيث الاثاره/تثبيط والتباعد/التقارب ، والمخطط الدوائر تنظيما جيدا وقد اقترح ان المخيخ هو "اله العصبية"¹، علي الرغم من انه لم يكن هناك في السابق اي فكره عن الغرض من هذا "اله". واقترح في وقت لاحق Marr ان المدخلات PFs لأجهزه الكمبيوتر تشكل طبقه ثلاثية شبكه التعلم النقابي². واقترح أيضا ان كل CF ينقل التعليمات الدماغية للحركة عنصري². وقال انه يفترض ان التنشيط في وقت واحد من PFs و CF من شانه ان يعزز النشاط المشبك PF-PC, ويسبب التقوية طويلة الأجل (LTP) من المشبك PF-PC. من ناحية أخرى ، افترض Albus ان تنشيط متزامن من PFs و CF أسفرت المحدودة في الاشتباكات العصبية PF-PC³. كل من الدراسات المذكورة أعلاه تفسر المخيخ كجهاز ذاكره فريدة من نوعها ، ودمج التي في الشبكة القشرية المخيخ يؤدي إلى تشكيل نموذج اله التعلم النموذج Marr-Albus.

بعد هذه التوقعات النظرية ، واثنين من خطوط الادله تشير إلى وجود اللدونة متشابك في المخيخ. واقترح السطر الأول من الادله من قبل التنظيم التشريحي لل التلبد ؛ هنا مسارات MF من أصل الجهاز الدهليزي ومسارات CF من أصل الشبكية تتلاقي علي أجهزه الكمبيوتر⁴. هذا النمط الفريد من التقارب يوحي بان اللدونة المتشابكة التي تحدث في التلبد تؤدي إلى التكيف الملحوظ لمنعكس العين. ثانيا ، ان تسجيل استجابه أجهزه الكمبيوتر الشخصية في التلبد والسخرية من التلبد أيضا دعم الفرضية المذكورة أعلاه^5،6،7. وعلاوة علي ذلك ، فان نمط التفريغ PC خلال التكيف مع حركه اليد القردة⁸ دعمت فرضيه اللدونة متشابك ، وخاصه albus ' المحدودة-فرضيه³.

لتحديد طبيعة اللدونة متشابك مباشره ، والتحفيز الملتحمة المتكررة (Cjs) من حزمه من PFs و CF ان العصبي علي وجه التحديد في جهاز الكمبيوتر في الجسم الطبيعي وأظهرت للحث علي المحدودة لفعالية انتقال PF-PC الاشتباكات العصبية^{9، 10,11}. في الاستكشافات اللاحقة في المختبر باستخدام شريحة المخيخ¹² وأجهزه الكمبيوتر المثقفة ، والجمع بين التحفيز المشترك للخلايا الحبيبية وتحفيز خلايا الزيتون¹³ أو الاقتران من الغلوتامات التطبيقية ايوتوهوريكالي والجسدية الاستقطاب^14،15 المحدودة. كما تم التحقيق بشكل مكثف في اليه محول الإشارات الكامنة وراء الحث المحدود باستخدام المستحضرات الانبوبيه^16،17.

وغالبا ما تستخدم التعديلات من VOR و OKR للتقييم الكمي للآثار التلاعب الجينات علي التعلم الحركي المخيخ ، لأنه ثبت القشرة الدهليز-المخيخ ان تكون الأصل الأساسي في التعلم التكيفيه من VOR^{18 ,19,20} و okr^19,21 وقد اتخذت العلاقة بين فشل التعريفي المحدودة وضعف التعلم الحركي السلوكي كدليل علي ان المحدودة تلعب دورا أساسيا في المحركات أليات التعلم²². ويشار إلى هذه الآراء بشكل جماعي باسم فرضيه المحدودة للتعلم الحركي ، أو الفرضية المار-albus-ايتو^{23،24،25،26}.

تم قياس التعلم التكيفيه لحركه العين باستخدام بروتوكولات مماثله ، في حين استخدمت الظروف التجريبية المختلفة للحث علي المحدودة في اعداد شريحة^{27،28،29،30،31} . وفي الاونه الاخيره ، ذكرت شونفيل وآخرون²⁶ ان بعض الفئران التلاعب الجينات أظهرت التعلم الحركي العادي ، ولكن لم تظهر شرائح المخيخ المحدودة ، التالي استنتجت ان المحدودة ليست ضرورية للتعلم الحركي. ومع ذلك ، تمت محاولة الحث المحدودة فقط باستخدام نوع واحد من البروتوكول في درجه حرارة الغرفة. التالي ، استخدمنا عده أنواع من البروتوكولات التي تحفز المحدودة تحت شروط التسجيل في حوالي 30 درجه مئوية ، وأكدنا ان المحدودة كانت مستحثه بشكل موثوق في الفئران التلاعب الجينات باستخدام هذه البروتوكولات في درجات الحرارة الفسيولوجية القريبة³².

ومع ذلك ، لا تزال هناك بعض الاسئله بشان الخصائص الاساسيه للتحفيز الملتحمة. الأول هو العلاقة بين شكل سبايك المعقدة والسعه المحدودة. ثانيا ، بالاقتران مع تحفيز الجبهة الذاتية والاستقطاب الجسدي ، ما إذا كان عدد المحفزات المستخدمة ضروريا ام لا كان بعيد المنال. في هذه الدراسة ، تم التحقيق في هذه الاسئله باستخدام فئران النوع البري (WT).

Protocol

وقد وافقت لجنه ريكين علي جميع الإجراءات التجريبية المتعلقة برعاية الماشية واستخدامها في التجارب. تم الاحتفاظ الفئران في مرفق الحيوانية من مركز ريكين لعلوم المخ تحت درجه حرارة تسيطر عليها جيدا (23-25 °C) والرطوبة (45 ٪-65 ٪) الظروف. واستخدمت كل من الذكور والإناث الفئران WT (C57BL/6 ، 3-6 أشهر).

1. اعداد الحلول المستخدمة في التجارب

ملاحظه: وينبغي اجراء جميع الحلول في المياه الفائقة خاليه من المعادن (المقاومة > 18.2 MΩ) وغيرها من الشوائب (الكربون العضوي الكلي (TOC) < 5.0 ppb). يتم العمل السائل النخاعي الاصطناعي (ACSF) لقطع شريحة وتسجيل الطازجة في يوم التجربة من 10 مرات (x10) الأسهم من ACSF. فقاعه الحلول مع 5 ٪ CO₂/95 ٪ O₂ خليط الغاز قبل الاستخدام. يتم تعديل درجه الحموضة من acsf إلى 7.4 ± 0.1 ، ويتم تعديل الاسموليه 315 ± 5 mosm/kg عن طريق أضافه المياه نقاء.

1. اعداد المخزون 10x من ACSF التي تحتوي علي 1250 mM كلوريد الصوديوم ، 30 ملم KCl ، 12.5 mM الجناح₂PO₄، و 260 mm نهكو₃. يمكن تخزين هذا الحل في 4 درجه مئوية.
2. اعداد العمل ACSF التي تحتوي علي 125 mM كلوريد الصوديوم ، 3 ملم KCl ، 2 مم CaCl₂، 1 ملم ملغ₂حتى₄، 1.25 mm الجناح₂PO₄، 26 ملم ناسكو₃ و 20 ملم الجلوكوز.
   1. أولا ، أضافه 1 مل من 2 m cacl محلول₂ تليها 1 مل من 1 م ملغ₂حتى₄ الحل إلى حوالي 800 مل من الماء نقاء ، لتجنب هطول الامطار. ثم أضافه 100 مل من 10x ACSF والجلوكوز. وأخيرا ، جعل ما يصل إلى حجم الإجمالي من 1,000 مل عن طريق أضافه المياه نقاء.
3. اعداد أجار 3.3 ٪ للتعامل مع الدماغ. تذوب 1 غرام من أجار في 30 مل من 0.9 ٪ محلول كلوريد الصوديوم ، والحرارة في الميكروويف حتى يغلي فقط. يحرك المزيج ، ثم يسكب في صندوق من البلاستيك المعقم بطول 4 سم × 10 سم ويسمح بترسيخه. تخزين لوحه أجار (~سمك 8 ملم) في الثلاجة.
4. اعداد الحل الداخلي.
   1. اعداد الحل الداخلي القائم علي^{k +}التي تحتوي علي 60 Mm kcl ، 60 mm k-غلوكونات ، 0.3 MM egta ، 4 مم mgcl₂، 4 مم ATP ، 0.4 mm GTP و 30 مم hepes (pH 7.2).
      ملاحظه: تركيز منخفض (0.3 mM) من EGTA ، وهو Ca بطيئه^{2 +}-chelator ، يضاف إلى مخلب ربما الملوثة ca^{2 +} في المياه النقية ، ولكن هذا التركيز المنخفض من egta في الحل الداخلي أبدا يمنع التعريفي المحدودة (الشكل 3، الشكل 4، الشكل 5) اثناء التسجيل بالخلايا الكاملة. قياس الضغط الاسموزي هو 285 mOsm/kg.
   2. اعداد^{Cs +}-القائم الحل الداخلي الذي يحتوي علي 60 Mm cscl ، 46 mm D-غلوكونات ، 27 ملم كلوريد رباعي ايثيل الأمونيوم (الشاي-Cl) ، 0.3 MM egta ، 4 مم mgcl₂، 4 مم ATP ، 0.4 mm GTP و 30 مم hepes (pH 7.2 ، تعديلها باستخدام csoh).
      ملاحظه: ^{Cs +} كتل الجهد التي تعتمد علي قنوات K ، ويحسن الظروف المشبك الفضاء في تشعبات عن طريق زيادة طول ثابت. قياس الضغط الاسموزي هو 285 mOsm/kg.
   3. اعداد 200 μl القسامات من الحلول وتخزين في-30 درجه مئوية.

2. تشريح الدماغ والتشذيب

1. البرد والأوكسجين 2 50 mL أكواب من ACSF علي الجليد حتى درجه الحرارة اقل من 4 درجه مئوية. أضافه 50 μL من tetrodتوكسين (TTX ، 1 ملم) في واحده من الأكواب الجليد الباردة من ACSF والاحتفاظ بها لقطع شرائح. للحصول علي الماوس شريحة المخيخ المتحفظة القدرة علي الحث المحدودة ، أضافه TTX إلى ACSF العادية ضروري.
2. تهدئه صينية عينه معدنيه من خلال ملء منطقه الجليد حمام من غرفه تشريح مع الجليد.
3. صب 1 مل من ايزوفلوان في جره تخدير (~1000 mL) ثم وضع الماوس في ذلك ل 30-45 s. تاكد من ان الماوس هو تخدير عميق عن طريق تاكيد عدم قدرته علي الاستجابة للتحفيز الميكانيكي.
4. قطع راس الماوس باستخدام مقص الجراحية. امسك الراس واقطع الجلد السطحي علي طول الخط الأوسط باستخدام مقص العيون. سحب الجلد عن طريق عقد مع الأصابع لفضح علي نطاق واسع سطح الجمجمة.
5. اقطع الجمجمة أفقيا علي طول خط من الفتحة الرئيسية الراسية فوق الاذن والعين باستخدام مقص للعيون. قطع الجمجمة علي طول خط فوق كلا العينين وأزاله لعزل الجمجمة.
6. قطع الدماغ في منتصف مخ باستخدام مشرط ، ثم عزل الجزء الذيليه من الدماغ بما في ذلك المخيخ من الجمجمة. تزج به في كاس الجليد الباردة من ACSF. عاده ، ينبغي ان يكون الوقت الإجمالي من قطع الراس إلى غمر كتله الدماغ في الكاس قبل المبردة من ACSF اقل من 60 s.
7. وينبغي تعديل موقف الأنابيب محتدما حتى لا يحرك كتله الدماغ في الكاس. قد يسبب التلف الميكانيكي تورم الشريحة اثناء التسجيل. اتركه لمده لا تقل عن 7 دقائق والسماح للدماغ لتهدئه.
8. لتقليم كتله الدماغ ، وقطع قطعه أجار مستطيله (2 سم × 2 سم) من لوحه أجار كبيره (4 سم × 10 سم ، وتخزينها في 4 درجه مئوية) ووضعها علي ورقه فلتر لامتصاص السائل الزائد.
9. تحويل قطعه أجار راسا علي عقب علي ورقه فلتر ، ثم وضع قطعه أجار علي ورقه فلتر علي صينية عينه معدنيه قبل المبردة (16 سم × 20 سم). التقاط كتله الدماغ باستخدام ملعقة وامتصاص السائل المفرط حوله مع قطعه من ورق الترشيح.
10. جبل كتله الدماغ علي كتله أجار باستخدام الغراء (الطبية اللاصقة الفورية cyanoوكريلات). تاكد من إرفاق الجزء السفلي (الجانب البطني) من كتله الدماغ إلى أجار.
11. اقطع نصف الكره الأيمن بشفره تاكد من ان الجانب من الطائرة القطع موازيه قدر الإمكان للطائرة شجيري من جهاز الكمبيوتر لان هذا الجانب هو تعلق علي سطح درج العينة. قطع وأزاله الجانب الآخر من نصف الكره الارضيه. ثم ، وقطع الدماغ بين العليا والسفلي كولولي ، وقطع الحبل الشوكي.
12. ألصق الجانب الأيمن من المخيخ المشذب بكتله أجار علي صينية العينات المبردة مسبقا. انشر الغراء الزائد حول المخيخ مع الجزء المسطح من الملعقة ، لمنع الغراء الزائد من التصاق بسطح المخيخ. أماله صينية معدنيه وتصب ACSF من أجل إصلاح الغراء ويغسل الغراء الزائد.

3. تشريح المخ

1. توجيه العينة بحيث يكون الجانب الظهري من المخيخ علي الجانب الامامي. صب قطع الجليد الباردة ACSF ، التي تحتوي علي 1 μM TTX ، كافيه لتزج المخيخ تماما. وضع أنبوب الغاز في ACSF وبدء محتدما مع O₂/CO₂ خليط الغاز.
2. أزاله الام العنكبوتية باستخدام ملقط غرامه تحت مناظير. قطع العم المخيخ مع شفره ، وأزاله جذع الدماغ وأجار كتله. تدوير الدرج 180 درجه ، بحيث يواجه السطح الظهري للمخيخ شفره razorblade.
3. اضبط الشفرة ، واضبط موقع القطع الأول. تعيين المعلمات تقطيع الذبذبات إلى ما يلي: السعه إلى 5.5 ، والتردد إلى 85 هرتز ، والسرعة إلى 3 – 4 ، وسمك شريحة إلى 300 μm.
4. نقل شريحة المخيخ علي شبكه من النايلون إلى حاضنه الأكريليك وتزج شريحة تماما في ACSF الأوكسيجين. يجب وضع الحاضنة في حمام مائي يحافظ علي درجه حرارة 26 درجه مئوية.
5. يخزن الشرائح لمده 1 ساعة علي الأقل للسماح بالاسترداد من التلف اثناء التقطيع.

4. الخلية الكاملة التصحيح-تسجيل المشبك

ملاحظه: تسجيل التصحيح المشبك يتطلب المعدات التالية: المجهر تستقيم مع الاشعه تحت الحمراء التباين التداخل التفاضلية (IR-DIC) البصريات ، ومكبر للصوت التصحيح المشبك ، التحويل الرقمي للبيانات ، ومحفز الكترونيه ، المعزل ، والكمبيوتر ، والبرمجيات للحصول علي البيانات والتحليل ، والمناور الميكانيكية ، ومنصة المجهر ، والاهتزاز الجدول العزلة ، قفص فاراداي ، نظام التدفئة الحل ، ومضخات التمعجيه وساحبه القطب.

1. أضافه بيكروتوكسين (0.1 mM) إلى acsf وحلها باستخدام سونيكيشن الترا لمده 3 دقائق.
2. Perfuse غرفه تسجيل مع التي تحتوي علي picrotoxin ، O₂-CO₂-المشبعة Acsf بمعدل 2 مل/دقيقه. الحفاظ علي درجه حرارة غرفه التسجيل في حوالي 30 درجه مئوية.
3. جعل القطب تسجيل عن طريق سحب الشعرية الزجاج بوروسيليكات مع خيوط (القطر الخارجي = 1.5 مم) باستخدام ساحبه مع 4 خطوات. يجب ان يكون قطر غيض حوالي 1 μm.
4. جعل القطب تحفيز عن طريق سحب نفس الشعرية باستخدام ساحبه مع 2 الخطوات ، ثم كسر لإنتاج غيض غرامه عن طريق ضرب غيض ضد كتله الحديد تحت مجهر منظار. يجب ان يكون القطر النهائي 3 – 5 ميكرومتر.
5. نقل شريحة المخيخ إلى غرفه التسجيل وإصلاحه مع Pt-الوزن مع خيوط النايلون. ملء القطب تحفيز مع ACSF.
6. لتحفيز PFs ، ضع القطب الكهربائي المحفز علي سطح الطبقة الجزيئية ، حوالي 50 ميكرومتر بعيدا عن طبقه الخلايا Purkinje.
7. لتحفيز CF ، وضع القطب تحفيز في الجزء السفلي من طبقه الخلية Purkinje (الخطوات 5.3 ، 5.4).
8. تصفيه^{K +}-القائم أو^{Cs +}-القائم الحل الداخلي مع فلتر 0.45 μm. استخدام محمل صغير لملء القطب تسجيل مع 8 μL من الحل الداخلي.
9. تطبيق ضغط إيجابي ضعيف علي القطب التسجيل قبل غمرها في ACSF. يجب ان تكون مقاومته 2 – 4 MΩ ويجب تصحيح الإمكانيات السائلة.
10. الاقتراب من جسم الخلية الصحية والمشرقة للكمبيوتر مع قطب التسجيل. دفع سطح الخلية Purkinje قليلا ، والتوقف عن تطبيق الضغط الإيجابي ، المقبل تطبيق الضغط السلبي حتى تشكيل ختم جيجا أوم. ثم إنشاء تكوين الخلية بأكملها باستخدام الضغط السلبي.
11. عقد المحتملة غشاء في-70 mV ، وتطبيق-2 نبض mV (المدة ، 100 مللي ثانيه) في 0.1 هرتز لرصد مقاومه المدخلات ، سلسله المقاومة والسعه المدخلة ، بشكل مستمر. لا تستخدم تعويض مقاومه السلسلة. تجاهل البيانات عندما تختلف مقاومه السلسلة بنسبه تزيد عن 15%.

5. التعريفي المحدودة

1. تحفيز الطبقة الجزيئية مع نبض (المدة ، 0.1 مللي ثانيه). تحديد التيارات بعد متشابك PF-مثير (EPSC) عن طريق تطبيق التحفيز نبض مزدوج (الفاصل الزمني البيني (ISI) من 50 ms). وينبغي ان تظهر الجبهة الخاصة بالقوات الخاصة تيسير النبض المزدوج والزيادة التدريجية في السعه بالنسبة للزيادة في كثافة التحفيز.
2. تسجيل استجابه اختبار PF-EPSC عن طريق تطبيق نبضه واحده في 0.1 هرتز. ضبط كثافة التحفيز بحيث السعه EPSC اثار حوالي 200 pA السلطة الفلسطينية. تجنب تلوث التيار من خلال القناة الايونيه التي تعتمد علي الجهد.
3. تحفيز CF في الجزء السفلي من طبقه الخلية Purkinje ، وتحديد EPSC التي اثارها تنشيط CF (عن طريق تطبيق التحفيز نبض مزدوج). يجب ان تظهر CF-EPSC الاكتئاب المزدوج النبض وبطريقه كل أو لا شيء وفقا للزيادة في كثافة التحفيز. لحث المحدودة ، وينبغي استخدام حافز واحد.
4. المحدودة--حث البروتوكول 1
   1. باستخدام القطب الذي يحتوي علي الحل الداخلي القائم علي^{K +}تحت ظروف المشبك الحالية ، وتطبيق واحد PF التحفيز والتحفيز CF واحد في وقت واحد في 1 هرتز لمده 5 دقائق (300 البقول) (الشكل 1a).
5. المحدودة--تحريض البروتوكول 2
   1. باستخدام القطب الذي يحتوي علي الحل الداخلي القائم علي^{K +}تحت ظروف المشبك الحالية ، وتطبيق مزدوج pf-المحفزات (ISI من 50 مللي ثانيه) وواحده cf-التحفيز كما الثاني pf-التحفيز هو تتزامن مع cf-المحفزات في 1 هرتز لمده 5 دقيقه (الشكل 1b).
6. المحدودة تحريض بروتوكول 3
   1. باستخدام القطب الذي يحتوي علي^{Cs +}-القائم علي حل داخلي تحت ظروف الجهد والمشبك ، وتطبيق مزدوج PF-التحفيز (ISI من 50 ms) والجهد الاستقطاب واحده-خطوه (-70 إلى 0 mV ، 50 ms) إلى سوما في 1 هرتز لمده 3 دقائق ، بحيث الثاني PF-التحفيز هو مكافئه لبداية الجهد الذي يتم في الاستقطاب (الشكل 1C).
7. المحدودة--حث بروتوكول--4
   1. باستخدام القطب الذي يحتوي علي^{Cs +}-القائم علي الحل الداخلي تحت ظروف الجهد المشبك ، وتطبيق المحفزات PF (5x في 100 هرتز) والجهد الاستقطاب واحده-خطوه (-70 إلى 0 mV ، 50 ms) إلى سوما في 0.5 هرتز لمده 3 دقائق ، في وقت واحد (الشكل 1d ).

النتائج

وقد استخدمت أربعه بروتوكولات في هذه الدراسة للحث علي المخيخ المحدودة. وفي البروتوكولين الأول والثاني (البروتوكولان 1 و 2) ، تم تطبيق الاقتران بين التحفيز وتحفيز التيار الكهربي في ظل ظروف المشبك الحالية. في البروتوكولين الآخرين (البروتوكول 3 و 4) ، تم استبدال الاستقطاب الجسدي لتحفيز CF تحت ظرو...

Discussion

الاختلافات بين البروتوكولات الاربعه

في البروتوكولات التي تحفز المحدودة 1 و 2 ، Cjs 300 مرات في 1 هرتز يكفي للحث علي المخيخ المحدودة. تردد التحفيز من CF يبدو ان تكون في نطاق الفسيولوجية ، لان ارتفاع معدل إطلاق النار في حاله تاهب الفئران الكبار (P60) وأفيد ان 1.25 هرتز³⁶. ومع ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amplifier	Molecular Devices-Axon	Multiclamp 700B
Borosilicate glass capillary	Sutter	BF150-110-10
Digitizer	Molecular Devices-Axon	Digidata1322A
Electrode puller	Sutter	Model P-97
Isoflurane	FUJIFILM Wako Pure Chemical	26675-46-7
Isolator	A.M.P.I.	ISOflex
Linear slicer	Dosaka EM	PRO7N
Microscope	NIKON	Eclipse E600FN
Peristaltic pump	Gilson	MP1 Single Channel Pump
Picrotoxin	Sigma-Aldrich	P1675
Pure water maker	Merck-Millipore	MilliQ 7000
Software for experiment	Molecular probe-Axon	pClamp 10
Software for statistics	KyensLab	KyPlot 5.0
Stimulator	WPI	DS8000
Temperature controller	Warner	TC-324B
Tetrodotoxin	Tocris	1078