成人脑切片长期抑郁症诱导评估

摘要

在一些基因操纵的动物中，使用单一协议可能无法诱导小脑Purkinje细胞中的LTD，并且LTD和运动学习之间可能存在差异。在基因操纵的动物中，需要多种协议来评估LTD诱导。显示了标准协议。

摘要

突触可塑性为学习和记忆提供了一种机制。对于小脑运动学习，从平行纤维（PF）到Purkinje细胞（PC）的突触透射的长期凹陷（LTD）被认为是运动学习的基础，并且观察到各种基因操纵的动物。常用的运动学习集，如光动反射（OKR）、前庭-眼反射（VOR）和轮状测试等，用于评估运动学习能力。然而，从GluA2-Carboxy终点体改进的撞鼠获得的结果显示，尽管缺乏PF-LTD，但VOR和OKR的正常适应。在该报告中，LTD的诱导只尝试在室温下使用一种刺激方案。因此，在接近生理温度下使用各种方案在同一敲锥突变体中探索了诱导小脑LTD的条件。最后，我们发现了刺激方案，通过这种刺激方案，可以在这些基因操纵的小鼠中诱导LTD。在这项研究中，提出了一套对LTD归纳进行评估的协议，这将更准确地用于检查LTD与电机学习之间的因果关系。总之，在评价基因操纵小鼠的LTD时，实验条件至关重要。

引言

小脑皮层的精心设计的神经元网络的突触组织，由PC、分子层内神经元（篮子和硬质细胞）、Golgi细胞、颗粒细胞的PF、青苔纤维和攀爬纤维（CFs）组成，已经得到阐明。在激发/抑制和发散/收敛方面，组织良好的电路图表明小脑是一个"神经^机"1，尽管以前不知道这个"机器"的目的。后来Marr提出，PC的PC输入构成一个三层关联学习^网络2。他还建议，每个CF传达一个大脑指令的元素^运动2。他假设同时激活 PF 和 CF 将增强 PF-PC 突触活动，并导致 PF-PC 突触的长期强权 （LTP）。另一方面，Albus 假设 PF 和 CF 的同步激活导致 PF-PC 突触³的 LTD。上述两项研究均将小脑解释为一种独特的记忆装置，将小脑并入小脑皮质网络导致Marr_Albus模型学习机模型的形成。

根据这些理论预测，两条证据线表明小脑中存在突触可塑性。第一线的证据是由絮凝器的解剖组织建议的;这里前庭器官起源的MF通路和视网膜起源的CF通路收敛^在PC4上。这种独特的收敛模式表明，在絮凝中发生的突触可塑性导致前视反射的显著适应性。第二，记录花团的PC反应和絮状物的病变也支持了上述假设5，6，7。此外，在猴子手部^运动8的适应过程中，PC放电模式支持了突触可塑性假说，尤其是阿不思的LTD-假^说3。

为了直接确定突触可塑性的性质，一束PF的重复结合刺激（Cjs）和CF，专门在体内对PC进行内联作用，被证明诱导LTD对PF_PC突触^{的传输功效9， 10，11}.在随后使用小脑切片¹²和培养 PC 的体外探索中，共培养的颗粒细胞刺激和橄榄细胞刺激¹³或电磷基质和体细胞结合去极化^14，15引起 LTD.使用体外^{制剂16、17，}对LTD诱导背后的信号转导机制也进行了深入的研究。

VOR 和 OKR 的适应通常用于定量评估基因操作对小脑运动学习的影响，因为前庭-小脑皮层被证明是 VOR¹⁸适应性学习的基本来源^，19、20和 OKR^19、21 LTD 诱导失败与行为运动学习障碍之间的相关性已被视为 LTD 在电机中起着重要作用的证据学习^机制22.这些观点统称为运动学习的LTD假说，或马尔-阿布斯-伊托假说23，24，25，26。

使用类似的方案测量了眼动的自适应学习，同时利用各种实验条件诱导在切片^{制备27、28、29、30、31}中诱导LTD.最近，Schonewille^等人26日报告说，一些基因操纵的小鼠表现出正常的运动学习，但小脑切片没有表现出LTD，因此得出结论，LTD对运动学习来说并非必要。然而，在室温下只尝试使用一种类型的协议来诱导LTD。因此，我们在30°C左右的记录条件下使用几种LTD诱导协议，并证实在接近生理^温度32的温度下使用这些协议在基因操纵的小鼠中可靠地诱导了LTD。

然而，关于结合刺激的基本特性，仍然存在一些问题。第一个是复杂尖峰的形状和LTD的振幅之间的关系。其次，结合PF刺激和躯体去极化，是否有必要使用刺激的数量是难以捉摸的。在本研究中，用野生型（WT）小鼠调查了这些问题。

研究方案

所有实验程序都通过了RIKEN在实验中照顾和使用动物委员会。老鼠被关在RIKEN脑科学中心的动物设施中，温度（23-25°C）和湿度（45%~65%）良好控制。条件。使用雄性小鼠和雌性WT小鼠（C57BL/6，3~6个月）。

1. 实验中使用的解决方案的制备

注:所有溶液均应在不含金属（电阻率 > 18.2 MΩ）和其他杂质（总有机碳 （TOC） < 5.0 ppb）的超纯水中制成。工作人工脑脊液 （ACSF） 切片和记录是在实验当天从 ACSF 的 10 倍 （x10） 库存新鲜。使用前，用 5% CO₂/ 95% O₂气体混合物将溶液泡在一起。ACSF的pH被调整为7.4±0.1，渗透度通过添加超纯水调整315~5 mOsm/kg。

1. 准备 10 倍库存的 ACSF，包含 1250 mM NaCl、30 mM KCl、12.5 mM NaH₂PO₄和 260 mM NaHCO₃。此溶液可储存在 4°C。
2. 准备工作ACSF含有125 mM NaCl， 3 mM KCl， 2 mM CaCl_2，1 mM Mg₂SO_4，1.25 mM NaH₂PO_4，26 mM NaHCO₃和 20 mM 葡萄糖.
   1. 首先，加入1 mL的2M CaCl₂溶液，然后加入1 mL的1M Mg₂SO₄溶液，加入约800 mL的超纯水，避免降水。然后加入100 mL的10x ACSF和葡萄糖。最后，通过添加超纯水，使总体积达到1，000 mL。
3. 准备3.3%的琼脂用于大脑处理。将1克琼脂溶解在30 mL的0.9%NaCl溶液中，并在微波炉中加热，直到沸腾。搅拌混合，然后倒入无菌 4 厘米 x 10 厘米塑料盒，并允许凝固。将琼脂板（+8毫米厚度）存放在冰箱中。
4. 准备内部解决方案。
   1. 准备基于 K⁺的内部解决方案，包含 60 mM KCl、60 mM K-葡萄糖酸、0.3 mM EGTA、4 mM MgCl_2、4mM ATP、0.4 mM GTP 和 30 mM HEPES （pH 7.2）。
      注:低浓度（0.3 mM）的EGTA，一种缓慢的Ca^2+-夹层，被添加到可能受污染的Ca²⁺在纯净水中，但这种低浓度的EGTA在内部溶液中永远不会阻止LTD的感应（图3，图4，图5）在全单元记录期间。测量的渗透压力为 285 mOsm/kg。
   2. 制备含有 60 mM CsCl、46 mM D-葡萄糖酸、27 mM 四乙酸铵 （TEA-Cl）、0.3 mM EGTA、4 mM MgCl_2、4mM ATP、0.4 mM GTP 和 30 mM HEPES（pH 7.2，使用 CsOH 调整）的基于 Cs⁺的内部溶液。
      注:Cs⁼可阻止电压依赖的 K 通道，并通过增加长度常数来改善远程树突的空间夹紧条件。测量的渗透压力为 285 mOsm/kg。
   3. 制备200μL等分溶液，并储存在-30°C。

2. 脑解剖和修剪

1. 在冰上冷却和氧化两个 50 mL ACSF 烧杯，直到温度低于 4°C。在ACSF的冰冷烧杯中加入50μL的四恶其分毒素（TTX，1 mM），并保留用于切片切割。为了获得小鼠小脑切片保留LTD诱导能力，需要将TTX添加到正常的ACSF中。
2. 将切片室的冰浴区域填充冰块，冷却金属试样托盘。
3. 将1 mL的亚福兰倒入一个麻醉罐（=1000 mL），然后将鼠标放入其中30-45s。通过确认小鼠对机械刺激无反应，确保小鼠被深度麻醉。
4. 用手术剪刀把老鼠斩首。用眼科剪刀按住头部，沿中线切开表面皮肤。用手指握住皮肤，广泛暴露头骨表面。
5. 使用眼科剪刀，沿着主要脊柱球菌孔水平切割头骨。沿着两只眼睛上方的一条线切割头骨，取出来隔离头骨。
6. 使用手术刀在大脑中间切开大脑，然后从头骨中分离出大脑的胆囊部分，包括小脑。浸入 ACSF 的冰冷的烧杯中。通常，从斩首到将脑块浸入ACSF预冷却烧杯的总时间应小于60s。
7. 应调整冒泡管的位置，以免在烧杯中搅动脑块。在记录过程中，机械损坏可能导致切片肿胀。保持至少7分钟，让大脑冷却。
8. 要修剪脑块，从大琼脂板（4 厘米 x 10 厘米，储存在 4°C） 上切出一块矩形琼脂片（2 厘米 x 2 厘米），并将其放在滤纸上以吸收多余的液体。
9. 将琼脂片倒置在滤纸上，然后将琼脂片放在预冷却的金属试样托盘上（16 厘米 x 20 厘米）上。用铲子拾起脑块，用一块滤纸吸收周围过多的液体。
10. 使用胶水（医用氰化即时粘合剂）将脑块安装到琼脂块上。确保将脑块的底部（心侧）连接到琼脂上。
11. 用刀片切出右半球。确保切割平面的一侧尽可能平行于 PC 的树突面，因为这一侧连接到试样托盘的表面。剪切并移除半球的另一边。然后，切断大脑之间的上等和下级的胶卷，并切断脊髓。
12. 将修剪过小脑的右侧与琼脂块粘附在预冷却试样托盘上。用铲子的平坦部分在小脑周围铺上多余的胶水，以防止多余的胶水附着在小脑表面。倾斜金属托盘并倒入 ACSF 以固定胶水并冲洗多余的胶水。

3. 脑切片

1. 定向样品，使小脑的背侧位于前侧。倒入含 1 μM TTX 的冷切 ACSF，足以完全浸没小脑。将气体管放入 ACSF 中，然后使用 O₂/CO₂气体混合物开始冒泡。
2. 在双筒望远镜下用细钳子取出甲壳虫。用刀片切开小脑，并取出脑干和agar块。旋转托盘 180°，使小脑的背表面朝向剃刀。
3. 设置刀片，并调整第一个切割位置。将振动体切片参数设置为以下参数:振幅为 5.5，频率设置为 85 Hz，速度设置为 3⁄4，切片厚度设置为 300 μm。
4. 将尼龙网上的小脑切片转移到丙烯酸培养箱中，并将切片完全浸入含氧的 ACSF 中。培养箱应放置在水浴中，温度保持在26°C。
5. 将切片存放至少 1 小时，以便在切片期间从损坏中恢复。

4. 全细胞贴片夹记录

注:贴片夹记录需要以下设备:具有红外差分干扰对比度 （IR-DIC） 光学器件的直立显微镜、贴片钳放大器、数据数字化器、数字刺激器、隔离器、计算机、数据采集软件并分析，电动机械手，显微镜平台，振动隔离台，法拉第笼，溶液加热系统，蠕动泵和电极拉拔器。

1. 将象毒（0.1 mM）添加到ACSF，并使用超音速解决3分钟。
2. 以2 mL/min的速率将含有象毒的O_2-CO2-饱和ACSF注入记录室，使记录室的温度保持在30°C左右。
3. 使用带 4 步器的拉拔器，用细丝（外径 = 1.5 mm）拉出硼硅酸盐玻璃毛细管，制作记录电极。尖端直径应约为 1 μm。
4. 用2个步骤拉扯同一毛细管，然后断裂，在双目显微镜下用铁块敲击尖端，从而产生一个细尖。最终直径应为3~5微米。
5. 将小脑切片转移到录音室，用尼龙螺纹的 Pt 重量固定。用 ACSF 填充刺激电极。
6. 为了刺激PFs，将刺激电极放在分子层表面，距离Purkinje细胞层约50μm。
7. 要刺激CF，将刺激电极放在Purkinje细胞层的底部（步骤5.3，5.4）。
8. 过滤K⁺基或^基于Cs+的内部溶液，带0.45 μm滤波器。使用微型装载机将记录电极填充 8 μL 的内部溶液。
9. 在将记录电极浸入 ACSF 之前，先对制动电极施加弱正压。其电阻应为2~4 MΩ，液体结电位应得到校正。
10. 使用记录电极接近 PC 的健康、明亮的电池体。轻微地推普金耶细胞表面，停止施加正压，接下来施加负压，直到形成千兆欧姆密封。然后使用负压建立全细胞配置。
11. 将膜电位保持至-70 mV，并在 0.1 Hz 下应用 -2 mV 脉冲（持续时间，100 ms），以连续监测输入电阻、串联电阻和输入电容。请勿使用系列电阻补偿。当系列电阻变化超过 15% 时丢弃数据。

5. LTD的归纳

1. 用脉冲刺激分子层（持续时间，0.1 ms）。通过应用 50 ms 的双脉冲刺激（间隔间隔 （ISI））确定 PF 兴奋柱午线 （EPSC）。PF-EPSC 应显示配对脉冲促进和逐渐增加的振幅相对于刺激强度的增加。
2. 通过在0.1 Hz下应用单个脉冲来记录PF-EPSC的测试响应。调整刺激的强度，使唤起的EPSC振幅约为200 pA。避免通过电压相关离子通道污染电流。
3. 刺激 Purkinje 细胞层底部的 CF，并识别 CF 激活引起的 EPSC（通过应用双脉冲刺激）。CF-EPSC应根据刺激强度的增加，显示配对脉冲抑郁症和全或无方式。对于 LTD 感应，应使用单个刺激。
4. LTD 诱导协议 1
   1. 在电流夹紧条件下使用^含有K+的内部溶液的电极，在1Hz下同时应用单个PF刺激和单个CF-刺激，持续5分钟（300脉冲）（图1A）。
5. LTD 诱导协议 2
   1. 在电流夹合条件下使用含^电极K+的内部溶液，应用双PF刺激（ISI为50 ms）和单CF刺激，因为第二个PF刺激与1Hz的CF刺激重合5分钟（图1B）。
6. LTD 诱导协议 3
   1. 在电压夹紧条件下使用^含有Cs+的内部溶液的电极，将双PF刺激（ISI为50 ms）和单去极化电压步长（-70至0 mV，50 ms）应用于1 Hz的soma，持续3分钟，使第二个PF刺激相当于去极化电压步长的开始（图1C）。
7. LTD 诱导协议-4
   1. 在电压夹紧条件下使用^含有Cs+的内部溶液的电极，同时将PF-刺激（100 Hz时为5倍）和单去极化电压步长（-70至0 mV，50 ms）应用于0.5 Hz的索马3分钟（图1D）).

结果

本研究使用了四种方案来诱导小脑LTD。在前两个协议（协议1和2）中，在电流夹紧条件下应用了PF刺激和CF刺激的结合。在其他两个协议（协议3和4）中，体体去极化被取代在电压夹条件下的CF刺激。比较了结合刺激过程中的电压轨迹或电流轨迹（图2）。

在电流夹合条件下（协议-1）中，1个PF刺激和1个CF刺激的结合通常用于切片^{制备26，27。}

讨论

四个协议之间的差异

在LTD诱导协议1和2中，Cjs在1Hz时300次足以诱导小脑LTD. CF的刺激频率似乎在生理范围内，因为警报成年小鼠（P60）的复杂尖峰发射速率报告为1.25赫^兹36。然而，单单CF刺激并没有导致PF-CF突触的长期可塑性，如协议1和2（图4，图5）中使用的，虽然仅CF刺激在较高频率诱导LTD^24。协?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amplifier	Molecular Devices-Axon	Multiclamp 700B
Borosilicate glass capillary	Sutter	BF150-110-10
Digitizer	Molecular Devices-Axon	Digidata1322A
Electrode puller	Sutter	Model P-97
Isoflurane	FUJIFILM Wako Pure Chemical	26675-46-7
Isolator	A.M.P.I.	ISOflex
Linear slicer	Dosaka EM	PRO7N
Microscope	NIKON	Eclipse E600FN
Peristaltic pump	Gilson	MP1 Single Channel Pump
Picrotoxin	Sigma-Aldrich	P1675
Pure water maker	Merck-Millipore	MilliQ 7000
Software for experiment	Molecular probe-Axon	pClamp 10
Software for statistics	KyensLab	KyPlot 5.0
Stimulator	WPI	DS8000
Temperature controller	Warner	TC-324B
Tetrodotoxin	Tocris	1078