הערכה של האינדוקציה לטווח ארוך של דיכאון פרוסות למבוגרים בלבד

Summary

בכמה בעלי חיים מניפולציות גנים, באמצעות פרוטוקול אחד עלול להיכשל כדי לגרום בע מ בתאים Purkinje המוח, וייתכן שקיים פער בין בע מ ללמידה מוטורית. פרוטוקולים מרובים נחוצים כדי להעריך את האינדוקציה בע מ בעלי חיים בעלי מניפולציה גנטית. פרוטוקולים רגילים מוצגים.

Abstract

הפלסטיות הסינפטית מספק מנגנון ללמידה ולזיכרון. עבור למידה מוטורית מוטוריים, דיכאון לטווח ארוך (בע מ) של שידורים סינפטית מסיבים מקבילים (PF) כדי Purkinje תאים (PC) נחשב בסיס ללמידה מוטורית, והליקויים של הן בע מ ולמידה מוטורית נצפו במגוון בעלי חיים מניפולציות בגנים. מערכות למידה נפוצות מוטוריות, כגון הסתגלות של רפלקס האופקינטי (OKR), רפלקס השמיעה העינית (VOR), ומבחן rotarod שימשו להערכת יכולת למידה מוטורית. עם זאת, התוצאות שהתקבלו מן הGluA2-קרבוקסיקהטרמינוס שונה בעכברים הראו הסתגלות נורמלית של ה-VOR ו-OKR, למרות החסר PF-LTD. בדוח זה, האינדוקציה של בע מ ניסה רק באמצעות סוג אחד של פרוטוקול גירוי בטמפרטורת החדר. כך, התנאים כדי לגרום המוח בע מ נחקרו באותו מוטציות נקישה-באמצעות פרוטוקולים שונים בסמוך לטמפרטורה פיזיולוגית. בסופו של דבר, מצאנו פרוטוקולים גירוי, אשר ניתן לגרום בע מ בעכברים אלה מניפולציות גנים. במחקר זה, קבוצה של פרוטוקולים מוצעים להערכת בע מ אינדוקציה, אשר לאפשר באופן מדויק יותר את הבדיקה של היחסים סיבתי בין בע מ ולמידה מוטורית. לסיכום, תנאים ניסיוניים הם קריטיים בעת הערכת בע מ בעכברים מניפולציות גנים.

Introduction

הארגון הסינפטיות של הרשתות עצבי הרחיב של קליפת המוח, מורכב של מחשבים, שכבת מולקולרית interneurons (סל ו stellate תאים), בתאי golgi, PFs של תאים גרגר עושה סיבים טחבי וסיבים טיפוס (cfs), הובהר במונחים של עירור/עיכוב והתפצלות/התכנסות, ואת דיאגרמת המעגלים המאורגנים היטב הציע כי המוח התת הוא "מכונה עצבית"¹, למרות שקודם לכן לא היה מושג על המטרה של "מכונה" זו. מאוחר יותר הציע מארי שקלט PFs למחשבים מהווה רשת למידה אסוציאטיבית שכבתית משולשת². הוא גם הציע כי כל CF מעביר הוראה מוחית עבור התנועה האלמנטלים². הוא הניח כי הפעלה בו זמנית של PFs ו-CF היה לשפר את הפעילות PF-PC סינפציה, ולגרום פוטנציאל לטווח ארוך (LTP) של ה-PF-PC סינפסה. מצד שני, אלבוס הניח כי הפעלה סינכרונית של PFs ו-CF הביא בע מ ב-PF-PC סינפסות³. הן המחקרים לעיל לפרש את המוח הגבוה כהתקן זיכרון ייחודי, שילוב של אשר לתוך הרשת הקרקלית המוח מוביל את היווצרות של דגם מכונת הלמידה של מימאר-אלבוס.

בעקבות תחזיות תאורטיות אלה, שתי שורות של ראיות מרמזות על נוכחות הפלסטיות הסינפטית במוח השני. קו הראיות הראשון הוצע על ידי הארגון האנטומי של הפלוקולוס; כאן MF מסלולים של הגזע שיווי המוני האיברים מסלולים CF של המקור הרשתית להתכנס על מחשבים אישיים⁴. תבנית ההתכנסות הייחודית הזאת מרמזת כי הפלסטיות הסינפטית המתרחשת בפולוקקולוס גורם ליכולת הסתגלות יוצאת דופן של רפלקס השמיעה. שנית, הקלטת התגובה של המחשבים בתוך הפלוקולוס והלילוקולוס תמכו גם בהשערה המעל^5,6,7. יתר על כן, המחשב פריקה דפוס במהלך הסתגלות של תנועת היד של הקוף⁸ תמך ההשערה הפלסטיות הסינפטית, במיוחד של אלבוס בע מ ההשערה³.

כדי לקבוע את טבעו של הפלסטיות הסינפטית ישירות, וחזר גירוי משלים (Cjs) של צרור של PFs ו-CF כי במיוחד innervates את המחשב ב vivo הוצגה כדי לגרום בע מ עבור יעילות השידור של PF – PC סינפסות^{9, 10,11}. בעקבות בחיפושי מבחנה באמצעות פרוסת מחשב¹² ומחשבים בעלי מחשב תרבותי, השילוב של גירוי תא משותף הגרניט ושיתוף של תאים באוליב הזית¹³ או בצירוף של גלוטמט שהוחלו באופן מתורבת וסומטיים דפולריזציה^14,15 גרם בע מ מנגנון התמרה האותות בבסיס האינדוקציה נחקר באופן אינטנסיבי גם בהכנות של מבחנה^16,17.

עיבודים של ה-VOR ו-OKR השתמשו לעתים קרובות להערכה כמותית של השפעות מניפולציה גנטית על למידה מוטורית של המוח, בגלל המוח פרוזדור המוח הוכח להיות מקור חיוני בלמידה אדפטיבית של ה-VOR^{18 ,19,20} ו-okr^19,21 הקורלציה בין כישלון של בע מ השראה ופגיעה של למידה מוטורית התנהגותית נלקח כראיה כי בע מ ממלא תפקיד חיוני במנוע מנגנוני למידה²². תצוגות אלה מכונים באופן קולקטיבי ההשערה של למידה מוטורית, או מימאר-אלבוס-היפותזה-איטו^23,24,25,26.

למידה אדפטיבית של תנועת העין נמדד באמצעות פרוטוקולים דומים, בעוד מצבים ניסיוניים שונים שימשו כדי לגרום בע מ הכנת פרוסה^{27,28,29,30,31} . לאחרונה, Schonewille ואח '²⁶ דיווחו כי כמה עכברים מניפולציות גנים הפגינו למידה רגילה מוטוריים, אבל הפרוסות המוח לא הראו בע מ, ובכך סיכם כי בע מ לא היה חיוני ללמידה מוטורית. עם זאת, האינדוקציה של בע מ ניסה רק באמצעות סוג אחד של פרוטוקול בטמפרטורת החדר. לפיכך, השתמשנו במספר סוגים של פרוטוקולים מבוססי בע מ בתנאי הקלטה בסביבות 30 ° c, ואנו אישרו כי בע מ המושרה באופן אמין בעכברים מניפולציות הגן באמצעות פרוטוקולים אלה בסמוך לטמפרטורות פיזיולוגיות³².

עם זאת, נותרו מספר שאלות בנוגע לתכונות הבסיסיות של גירוי משלים. הראשון הוא הקשר בין הצורה של ספייק מורכב משרעת בע מ. שנית, בשילוב עם גירוי של PF ודפולריזציה סומטיים, בין אם מספר הגירויים היה הכרחי או לא היה חמקמק. במחקר הנוכחי, שאלות אלה נחקרו באמצעות סוג פראי (WT) עכברים.

Protocol

כל ההליכים הניסיוניים אושרו על ידי ועדת RIKEN על הטיפול והשימוש בבעלי חיים בניסויים. עכברים נשמרו במתקן החי של מרכז ריקן למדעי המוח בטמפרטורה מבוקרת היטב (23 – 25 ° c) ולחות (45% – 65%) תנאים. השתמשו בשני עכברים זכריים ונקביים (C57BL/6, 3 – 6 חודשים).

1. הכנת הפתרונות המשמשים בניסויים

הערה: כל הפתרונות צריך להתבצע במים באולטרטהור ללא מתכות (מרסיסטילים > 18.2 MΩ) וזיהומים אחרים (פחמן אורגני סך (TOC) < 5.0 ppb). עבודה נוזל מלאכותי שדרתי (ACSF) עבור חיתוך גזירה והקלטה נעשים טריים ביום הניסוי החל 10 פעמים (x10) מלאי של ACSF. בועה הפתרונות עם 5% CO₂/95% O₂ תערובת גז לפני השימוש. ה-pH של ACSF מותאם 7.4 ± 0.1, ו osmolarity מותאם 315 ± 5 mOsm/ק ג על ידי הוספת מים באולטרטהורים.

1. להכין מלאי 10x של ACSF המכיל 1250 מ"מ הנאל, 30 מ"מ KCl, 12.5 mM נה₂פו₄, ו 260 mM נחקו₃. ניתן לאחסן פתרון זה ב -4 ° c.
2. להכין עבודה ACSF המכיל 125 מ"מ הנאל, 3 מ"מ KCl, 2 מ"מ CaCl₂, 1 מ ג Mg₂SO₄, 1.25 mm נה₂פו₄, 26 מ"מ נחקו₃ ו 20 מ"מ גלוקוז.
   1. ראשון, להוסיף 1 mL של 2 M CaCl₂ הפתרון ואחריו 1 ml של 1 M Mg₂כל כך₄ פתרון לתוך סביב 800 ml של מים באולטרטהורים, כדי למנוע משקעים. ואז להוסיף 100 mL של 10 x ACSF ו גלוקוז. לבסוף, לפצות על נפח כולל של 1,000 mL על ידי הוספת מים באולטרטהורים.
3. הכינו 3.3% אגר לטיפול במוח. מתמוסס 1 גרם של אגר ב 30 מ ל של 0.9% הפתרון הנאקל, וחום במיקרוגל עד רק רותחים. מערבבים כדי לערבב, ולאחר מכן יוצקים אותו לתוך סטרילי 4 ס"מ x 10 ס מ פלסטיק הקופסה ולאפשר לגבש. לאחסן את הצלחת אגר (~8 מ"מ עובי) במקרר.
4. הכן את הפתרון הפנימי.
   1. הכן את הפתרון הפנימי מבוסס K⁺המכיל 60 Mm kcl, 60 mm K-גלוקונאט, 0.3 MM egta, 4 מ"מ MgCl₂, 4 מ"מ ATP, 0.4 mm GTP ו 30 מ"מ hepes (pH 7.2).
      הערה: ריכוז נמוך (0.3 מ"מ) של EGTA, Ca איטי^{2 +}-הליידי, מתווסף להיות כנראה מזוהמים ca^{2 +} ב מים טהורים, אבל זה ריכוז נמוך של egta בפתרון הפנימי אף פעם לא חוסם את אינדוקציה של בע מ (איור 3, איור 4, איור 5) במהלך הקלטה שלמה של התאים. לחץ אוסמוטי נמדד הוא 285 mOsm/ק"ג.
   2. הכינו את הפתרון הפנימי מבוסס Cs⁺המכיל 60 Mm CsCl, 46 mm D-gluconate, 27 מ"מ טטראתילמוניום כלוריד (תה-Cl), 0.3 MM egta, 4 מ"מ MgCl₂, 4 מ"מ ATP, 0.4 mm GTP ו 30 מ"מ hepes (pH 7.2, מותאם באמצעות csoh).
      הערה: מדעי הבית⁺ בלוקים של ערוצי K התלויים במתח חשמלי, ומשפר את תנאי הצבת החלל בדנדריטים מרוחקים על ידי הגדלת האורך קבוע. לחץ אוסמוטי נמדד הוא 285 mOsm/ק"ג.
   3. הכינו 200 μL של פתרונות ואחסון ב-30 ° c.

2. המוח חיתוך ו זמירה

1. לצנן ו חמצן 2 50 mL מספלים של ACSF על הקרח עד הטמפרטורה נמוכה יותר 4 ° c. הוסף 50 μl של טטרודוטוקסין (ttx, 1 מ"מ) לתוך אחד הקרים קרח קר של acsf ושריין אותו חיתוך פרוסות. כדי להשיג את העכבר פרוסה באופן שמירת פרוסות היכולת, תוספת TTX ל-ACSF הרגיל הוא הכרחי.
2. מצננים את מגש המתכת על ידי מילוי אזור אמבט הקרח בחדר הפרוסות עם קרח.
3. יוצקים 1 מ ל של isof, לתוך צנצנת מורדם (~1000 mL) ולאחר מכן למקם את העכבר בו 30-45 s. להבטיח כי העכבר הוא מורדם עמוקות על ידי אישור חוסר יכולתה להגיב גירוי מכני.
4. ערוף את ראשו של העכבר. באמצעות מספריים כירורגיים החזיקו את הראש וחתכו את העור השטחית לאורך קו האמצע תוך שימוש במספריים של אופטלמולוגית. משוך את העור על ידי החזקת עם האצבעות כדי לחשוף באופן נרחב את פני הגולגולת.
5. חותכים את הגולגולת אופקית לאורך קו מן החור הגדול spinochular ממש מעל האוזן והעין באמצעות מספריים רופא עיניים. חותכים את הגולגולת לאורך קו מעל שתי העיניים ולהסיר כדי לבודד את הגולגולת.
6. חותכים את המוח באמצע המוח באמצעות אזמל, ואז לבודד את החלק caudal של המוח כולל את המוח הראשי מהגולגולת. לטבול אותו בגביע קר קרח של ACSF. בדרך כלל, הזמן הכולל של עריפת הראש כדי טבילה של בלוק המוח לתוך הגביע הטרום מקורר של ACSF צריך להיות פחות מ 60 s.
7. מיקום של אבובים מבעבעים צריך להיות מותאם כדי לא לעורר את גוש המוח בגביע. נזק מכני עלול לגרום לנפיחות של הפרוסה במהלך ההקלטה. להשאיר אותו לפחות 7 דקות ולאפשר למוח להתקרר.
8. כדי לחתוך את המוח לחסום, לגזור פיסת אגר מלבני (2 ס"מ x 2 ס מ) מצלחת אגר גדול (4 ס"מ x 10 ס"מ, מאוחסן ב 4 ° c) ולשים אותו על נייר סינון כדי לקלוט את עודפי הנוזלים.
9. להפוך את הקטע אגר הפוך על נייר מסנן, ואז למקם את פיסת אגר על נייר סינון על מגש מתכת טרום מקורר הדגימה (16 ס"מ x 20 ס מ). להרים את בלוק המוח באמצעות מרית ולקלוט נוזל מוגזם סביבו עם פיסת נייר סינון.
10. הר המוח לחסום על בלוק אגר באמצעות דבק (הדבק מיידית רפואי ציאנואקריאקרילי). הקפד לצרף את החלק התחתון (בצד הגחוני) של בלוק המוח כדי אגר.
11. חותכים את האונה הימנית עם להב. להיות בטוח כי הצד של המטוס חיתוך הוא מקביל ככל האפשר למישור הדנדריטי של המחשב, כי הצד הזה מחובר למשטח של מגש הדגימה. חותכים ומסירים את הצד השני של האונה. לאחר מכן, חותכים את המוח בין העליון לבין המכרה הנחות, ולחתוך את חוט השדרה.
12. הדבק את הצד הימני של המוח הקצוץ החתוך עם בלוק אגר על מגש הדגימה טרום מקורר. מורחים דבק עודף סביב המוח החצי עם החלק השטוח של מרית, כדי למנוע דבק עודף מלצרף למשטח המוח. להטות את מגש המתכת ויוצקים ACSF כדי לתקן את הדבק ולשטוף את הדבק עודף.

3. חיתוך מוח

1. האוריינט המדגם כך שהצד השני של המוח הראשי נמצא בצד הקדמי. יוצקים ice-קר חיתוך ACSF, המכיל 1 μM TTX, מספיק כדי לטבול את המוח החסר לחלוטין. מניחים צינור גז לתוך ACSF ולהתחיל מבעבע עם O₂/CO₂ תערובת גז.
2. הסירו את הארכייד מאטר. בעזרת טוויצר משובח מתחת למשקפת ותסיר את גזע המוח. ואת הבלוק של אגר סובב את המגש 180 °, כך שהמשטח החלק הגבי של המוח הפנימי מתמודד עם להב גילוח.
3. הגדר את הלהב וכוונן את מיקום החיתוך הראשון. הגדר את הפרמטרים של פרוסות הרטט לבאות: משרעת ל-5.5, תדירות ל-85 Hz, מהירות ל-3-4 ועובי הפרוסה ל-300 μm.
4. להעביר את הפרוסה המוח על ניילון-נטו לתוך אינקובטור אקריליק לטבול את הפרוסה לחלוטין ACSF חמצון. יש להניח את החממה באמבט מים השומר על טמפרטורה של 26 ° c.
5. אחסן את הפרוסות עבור לפחות 1 h כדי לאפשר שחזור מהנזק במהלך החיתוך.

4. הדבקת תא שלם-הקלטת קלאמפ

הערה: הקלטה מלחציים תיקון דורש הציוד הבאים: מיקרוסקופ זקוף עם הפרעה אינפרא אדום הפרעות דיפרנציאליות (IR-DIC) אופטיקה, מגבר מהדק תיקון, התקן הדיגיטציה של נתונים, גירוי דיגיטלי, מבודד, מחשב, תוכנה לרכישת נתונים ניתוח, מנועי מניפולטור, פלטפורמת מיקרוסקופ, שולחן בידוד רטט, כלוב פאראדיי, מערכת חימום פתרונות, משאבות פריסטלטיות וכלי אלקטרודה.

1. הוסף picrotoxin (0.1 mM) כדי ACSF ולפתור אותו באמצעות ultra-sonication עבור 3 דקות.
2. מבשם תא הקלטה עם picrotoxin המכיל, O₂-CO₂-רווי acsf בשיעור של 2 מ ל/דקה. לשמור על טמפרטורת חדר ההקלטה בסביבות 30 ° c.
3. לבצע הקלטה אלקטרודה ידי משיכת נימי זכוכית בורוסיליקט עם נימה (קוטר החיצוני = 1.5 מ"מ) באמצעות פולר עם 4 שלבים. קוטר הקצה אמור להיות בסביבות 1 μm.
4. לעשות אלקטרודה מגרה על ידי משיכת נימי אותו באמצעות הפולר עם 2 שלבים, ואז לשבור כדי לייצר טיפ דק על ידי הכאת הטיפ נגד גוש ברזל תחת מיקרוסקופ המשקפת. הקוטר האחרון צריך להיות 3 – 5 μm.
5. העבר את פרוסת המוח לתא ההקלטה ותקן אותו עם משקל Pt עם חוטי ניילון. למלא אלקטרודה מגרה עם ACSF.
6. לגירוי ה-PFs, הנח את האלקטרודה המעוררת על פני השטח של השכבה המולקולרית, בסביבות 50 יקרומטר הרחק משכבת התאים purkinje.
7. לגירוי של CF, המקום האלקטרודה מגרה בתחתית שכבת התאים Purkinje (שלבים 5.3, 5.4).
8. הפתרון הפנימי מבוסס מסנן K⁺או Cs⁺באמצעות מסנן 0.45 יקרומטר. השתמש מיקרו מטעין כדי למלא אלקטרודה הקלטה עם 8 μL של פתרון פנימי.
9. החל לחץ חיובי חלש על האלקטרודות ההקלטה לפני שאתה מאשר אותו לתוך ACSF. ההתנגדות שלה צריכה להיות 2 – 4 MΩ ופוטנציאל junctional נוזלי צריך להיות מתוקן.
10. גש אל גוף התאים הבריא והבהיר של המחשב עם האלקטרודה הרושמת. לדחוף את פני השטח של התאים Purkinje מעט, להפסיק את החלת לחץ חיובי, הבא להחיל לחץ שלילי עד ליצירת חותם giga-אוהם. לאחר מכן לקבוע את התצורה של התא כולו באמצעות לחץ שלילי.
11. להחזיק את הפוטנציאל הממברנה ב-70 mV, ולהחיל -2 mV פולס (משך, 100 ms) ב 0.1 הרץ כדי לפקח על התנגדות הקלט, התנגדות סדרה וקיבולת קלט, ברציפות. אל תשתמש בפיצוי ההתנגדות של הסדרה. התעלם מנתונים כאשר התנגדות הסדרה משתנה ביותר מ-15%.

5. אינדוקציה בע מ

1. לעורר את השכבה המולקולרית עם דופק (משך, 0.1 ms). זיהוי הזרמים הפוסט-מפוטיים של PF (EPSC) על-ידי החלת גירוי בפעימה כפולה (מרווח זמן משני (ISI) של 50 ms). ה-PF-EPSC צריך להראות הקלה לזווג הדופק ועלייה הדרגתית משרעת יחסית להגדיל את עוצמת גירוי.
2. הקלט את תגובת הבדיקה של ה-PF-EPSC על-ידי החלת פעימה בודדת ב-0.1 Hz. להתאים את עוצמת הגירוי, כך משרעת EPSC מעורר הוא סביב 200 pA. הימנע מזיהום של הזרם דרך הערוץ היוני תלוי המתח.
3. לעורר את CF בחלק התחתון של שכבת התאים Purkinje, ולזהות את EPSC מעורר על ידי הפעלת CF (על ידי החלת גירוי הדופק כפול). CF-EPSC צריך להראות מזווג הדופק דיכאון ו-all-או-none הצורה על פי העלייה בעוצמה גירוי. עבור השראה בע מ, יש להשתמש בגירוי יחיד.
4. פרוטוקול ממריץ 1
   1. באמצעות האלקטרודה המכילה K⁺מבוסס פתרון פנימי תחת תנאים מלחציים הנוכחי, להחיל את הגירוי PF יחיד בודד CF-גירוי בו ב 1 הרץ עבור 5 דקות (300 פולסים) (איור 1a).
5. פרוטוקול ממריץ 2
   1. באמצעות אלקטרודה המכילה K⁺מבוססי פתרון פנימי תחת התנאים הנוכחיים מלחציים, להחיל כפול pf-גירויים (ISI של 50 ms) ויחיד CF-גירוי כמו ה-pf-גירוי השני הוא האירוע עם cf-גירויים ב 1 הרץ עבור 5 דקות (איור 1b).
6. פרוטוקול ממריץ 3
   1. באמצעות אלקטרודה המכילה הפתרון הפנימי מבוסס Cs⁺בתנאי מהדק מתח, להחיל את הגירוי PF כפול (ISI של 50 ms) ו בודד הקיטוב צעד (-70 כדי 0 mV, 50 ms) כדי סומה ב 1 הרץ עבור 3 דקות, כך PF-גירוי השני הוא שווה ערך לתחילת שלב המתח (איור 1C).
7. פרוטוקול וממריץ בע מ-4
   1. באמצעות אלקטרודה המכילה הפתרון הפנימי מבוסס Cs⁺בתנאי מהדק מתח, להחיל את PF-גירויים (5x ב 100 Hz) ו בודד ביטול הקיטוב צעד (-70 כדי 0 mV, 50 ms) כדי סומה ב 0.5 Hz עבור 3 דקות, בו זמנית (איור 1d ).

תוצאות

ארבעה פרוטוקולים שימשו במחקר זה כדי לגרום המוח בע מ. בשני הפרוטוקולים הראשונים (פרוטוקול 1 ו-2), השילוב של גירוי ה-PF והגירוי הCF הוחל בתנאי מלחציים נוכחיים. בשני הפרוטוקולים האחרים (פרוטוקול 3 ו-4), הוחלף בדפולריזציה של הסומונים עבור גירוי ה-CF בתנאים של מהדק מתח. סימני מתח או מרשמים נוכחיים במהל?...

Discussion

הבדלים בין ארבעת הפרוטוקולים

בפרוטוקולים מסוג 1 ו-2, Cjs 300 פעמים ב-1 Hz מספיק כדי לגרום למוח בע מ. תדירות גירוי של CF נראה להיות בטווח פיזיולוגי, כי שיעור הירי המורכב ספייק בזמן התראה עכברים מבוגרים (P60) דווחה להיות 1.25 Hz³⁶. עם זאת, הגירוי CF לבדו לא לגרום פלסטיות לטווח ארוך ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amplifier	Molecular Devices-Axon	Multiclamp 700B
Borosilicate glass capillary	Sutter	BF150-110-10
Digitizer	Molecular Devices-Axon	Digidata1322A
Electrode puller	Sutter	Model P-97
Isoflurane	FUJIFILM Wako Pure Chemical	26675-46-7
Isolator	A.M.P.I.	ISOflex
Linear slicer	Dosaka EM	PRO7N
Microscope	NIKON	Eclipse E600FN
Peristaltic pump	Gilson	MP1 Single Channel Pump
Picrotoxin	Sigma-Aldrich	P1675
Pure water maker	Merck-Millipore	MilliQ 7000
Software for experiment	Molecular probe-Axon	pClamp 10
Software for statistics	KyensLab	KyPlot 5.0
Stimulator	WPI	DS8000
Temperature controller	Warner	TC-324B
Tetrodotoxin	Tocris	1078