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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

In alcuni animali manipolati dai geni, l'utilizzo di un unico protocollo potrebbe non indurre LTD nelle cellule cerebellar Purkinje, e ci può essere una discrepanza tra LTD e apprendimento motorio. Sono necessari più protocolli per valutare l'induzione di LTD in animali manipolati dal gene. Vengono visualizzati i protocolli standard.

Abstract

La plasticità sinaptica fornisce un meccanismo per l'apprendimento e la memoria. Per l'apprendimento motorio cerebellare, la depressione a lungo termine (LTD) delle trasmissioni sinaptiche dalle fibre parallele (PF) alle cellule Purkinje (PC) è considerata la base per l'apprendimento motorio, e le carenze di LTD e di apprendimento motorio sono osservate in vari animali manipolati dal gene. Per la valutazione della capacità di apprendimento motorio, sono stati utilizzati set comuni di apprendimento motorio, come l'adattamento del riflesso ottimale (OKR), il riflesso vestibolare-oculare (VOR) e il test di rotazione. Tuttavia, i risultati ottenuti dal capolinea GluA2-carboxy modificato topi knock-in hanno dimostrato il normale adattamento del VOR e della OKR, nonostante la mancanza di PF-LTD. In tale relazione, l'induzione di LTD è stata tentata utilizzando un solo tipo di protocollo di stimolazione a temperatura ambiente. Così, le condizioni per indurre cerebellar LTD sono state esplorate negli stessi mutanti knock-in utilizzando vari protocolli a temperatura quasi fisiologica. Infine, abbiamo trovato protocolli di stimolazione, mediante i quali la LTD potrebbe essere indotta in questi topi manipolati dai geni. In questo studio, viene proposta una serie di protocolli per valutare l'induzione di LTD, che consentirà più accuratamente l'esame della relazione causale tra LTD e apprendimento motorio. In conclusione, le condizioni sperimentali sono cruciali nella valutazione di LTD in topi manipolati dai geni.

Introduzione

L'organizzazione sinaptica delle elaborate reti neuronali della corteccia cerebellare, composta da PC, interneuroni a strato molecolare (cellule da canestro e stellate), cellule di Golgi, PF da cellule granule, fibre muschioe e fibre rampicanti (CF), sono state chiarite in termini di eccitazione/inibizione e divergenza/convergenza, e il diagramma del circuito ben organizzato ha suggerito che il cervelletto è una "macchina neuronale"1, anche se in precedenza non c'era idea dello scopo di questa "macchina". Successivamente Marr propose che l'input di PF per i PC costituisca una rete di apprendimento associativo a triplo strato2. Suggerì anche che ogni CF trasmette un'istruzione cerebrale per il movimento elementale2. Ha assunto che l'attivazione simultanea di FR e CF avrebbe migliorato l'attività di sinapsi PF-PC, e causare potenziamento a lungo termine (LTP) della sinapsi PF-PC. D'altra parte, Albus ha ritenuto che l'attivazione sincrona di GIF e CF ha portato a LTD presso le sinapsi PF-PC3. Entrambi gli studi di cui sopra interpretano il cervelletto come un dispositivo di memoria unico, la cui incorporazione nella rete corticale cerebellare porta alla formazione del modello di machine di apprendimento del modello Marr-Albus.

Seguendo queste previsioni teoriche, due linee di prova suggeriscono la presenza di plasticità sinaptica nel cervelletto. La prima linea di prova è stata suggerita dall'organizzazione anatomica del flocculus; qui le vie MF di origine dell'organo vestibolare e le vie CF di origine retinica convergono sui PC4. Questo modello di convergenza unico suggerisce che una plasticità sinaptica che si verifica nel flocculus provoca la notevole adattabilità del riflesso vestibulo-oculare. In secondo luogo, la registrazione dei PC risposta nel flocculus e la lesioning del flocculus anche sostenuto l'ipotesi di cui sopra5,6,7. Inoltre, il modello di scarico del PC durante l'adattamento del movimento della mano di una scimmia8 ha sostenuto l'ipotesi della plasticità sinaptica, in particolare l'ipotesi LTD di Albus3.

Per determinare direttamente la natura della plasticità sinaptica, la stimolazione congiuntiva ripetuta (Cjs) di un fascio di GIF e della CF che in particolare innervail i minattici il PC in vivo è stato dimostrato a LTD indurre per l'efficacia della trasmissione delle sinapsi PF-PC9, 10,11. Nelle successive esplorazioni in vitro con una fetta cerebellare12 e PC coltivati, congiunzione di stimolazione cellulare granulo co-coltivata e stimolazione delle cellule ulivi13 o congiunzione di glutammato e somatica depolarizzazione14,15 ha causato LTD. Anche il meccanismo di trasduzione del segnale alla base dell'induzione del LTD è stato studiato intensamente utilizzando preparati in vitro16,17.

Gli adattamenti del VOR e dell'OKR sono stati spesso utilizzati per la valutazione quantitativa degli effetti di manipolazione genica sull'apprendimento motorio cerebellare, perché la corteccia vestibule-cerebellare è stata dimostrata come l'origine essenziale nell'apprendimento adattivo del VOR18 ,19,20 e L'OKR19,21 La correlazione tra il fallimento dell'induzione di LTD e la compromissione dell'apprendimento motorio comportamentale è stata presa come prova che LTD svolge un ruolo essenziale nel motore meccanismi di apprendimento22. Queste opinioni sono collettivamente indicate come l'ipotesi LTD dell'apprendimento motorio, o ipotesi Marr-Albus-Ito23,24,25,26.

L'apprendimento adattivo del movimento oculare è stato misurato utilizzando protocolli simili, mentre varie condizioni sperimentali sono state utilizzate per indurre LTD nella preparazione delle fette27,28,29,30,31 . Recentemente, Schonewille et al.26 ha riferito che alcuni topi manipolati dai geni hanno dimostrato un normale apprendimento motorio, ma le fette di cerebellar non mostravano LTD, e quindi hanno concluso che ltd non era essenziale per l'apprendimento motorio. Tuttavia, l'induzione di LTD è stata tentata utilizzando un solo tipo di protocollo a temperatura ambiente. Quindi, abbiamo utilizzato diversi tipi di protocolli che inducono LTD in condizioni di registrazione a circa 30 gradi centigradi, e abbiamo confermato che il LTD è stato indotto in modo affidabile nei topi manipolati dai geni utilizzando questi protocolli a temperature quasi fisiologiche32.

Tuttavia, rimangono alcune domande riguardanti le proprietà di base della stimolazione congiuntiva. Il primo è la relazione tra la forma del picco complesso e l'ampiezza di LTD. In secondo luogo, in combinazione con la stimolazione PF e la depolarizzazione somatica, se il numero di stimoli utilizzati erano necessari o meno era inafferrato. Nel presente studio, queste domande sono state studiate utilizzando topi di tipo selvaggio (WT).

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal comitato RIKEN per la cura e l'uso degli animali negli esperimenti. I topi sono stati tenuti nell'impianto animale del RIKEN Center for Brain Science a temperatura ben controllata (23-25 gradi centigradi) e umidità (45%-65%) Condizioni. Sono stati utilizzati sia topi WT maschi che femmine (C57BL/6, 3–6 mesi).

1. Preparazione delle soluzioni utilizzate negli esperimenti

NOT: Tutte le soluzioni devono essere realizzate in acqua ultrapura priva di metalli (resistività > 18,2 M) e altre impurità (carbonio organico totale (TOC) < 5,0 ppb). Il liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) funzionante per il taglio e la registrazione delle fette viene effettuato fresco il giorno dell'esperimento da uno stock di ACSF 10 volte (x10). Bollare le soluzioni con 5% CO2/ 95% O2 miscela di gas prima dell'uso. Il pH di ACSF viene regolato a 7,4 x 0,1, e l'osmolarità viene regolata 315 mOsm/kg aggiungendo acqua ultrapura.

  1. Preparare le scorte 10x di ACSF contenenti 1250 mM NaCl, 30 mM KCl, 12,5 mM NaH2PO4e 260 mM NaHCO3. Questa soluzione può essere immagazzinata a 4 gradi centigradi.
  2. Preparare il lavoro ACSF contenente 125 mM NaCl, 3 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM Mg2SO4, 1,25 mM NaH2PO4, 26 mM NaHCO3 e 20 mM di glucosio.
    1. In primo luogo, aggiungere 1 mL di 2 M CaCl2 soluzione seguita da 1 mL di 1 M Mg2SO4 soluzione in circa 800 mL di acqua ultrapura, per evitare precipitazioni. Quindi aggiungere 100 mL di 10x ACSF e glucosio. Infine, fino a un volume totale di 1.000 mL con l'aggiunta di acqua ultrapura.
  3. Preparare 3.3% agar per la gestione del cervello. Sciogliere 1 g di agar in 30 mL di 0,9% soluzione NaCl, e riscaldare in un forno a microonde fino a far bollire. Mescolare per mescolare, quindi versarlo in una scatola di plastica sterile 4 cm x 10 cm e lasciare solidificare. Conservare la piastra di agar(spessore di 8 mm) in frigorifero.
  4. Preparare la soluzione interna.
    1. Preparare la soluzione interna a K ea4 mM contenente 60 mM KCl, 60 mM K-gluconate, 0,3 mM EGTA, 4 mM MgCl2, 4 mM ATP, 0,4 mM GTP e 30 mM HEPES (pH 7.2).
      NOT: Bassa concentrazione (0,3 mM) di EGTA, un lento Ca 2o-chelator, viene aggiunto per chelate possibilmente contaminato Ca2s in acqua pura, ma questa bassa concentrazione di EGTA nella soluzione interna non blocca mai l'induzione di LTD (Figura 3, Figura 4, Figura 5) durante la registrazione dell'intera cella. La pressione osmotica misurata è di 285 mOsm/kg.
    2. Preparare la soluzione interna basata su CseC contenente 60 mM CsCl, 46 mM D-gluconato, 27 mM di cloruro tetraetilenium (TEA-Cl), 0,3 mM EGTA, 4 mM MgCl2, 4 mM ATP, 0,4 mM GTP e 30 mM HEPES (pH 7.2, utilizzando CsOH regolato).
      NOT: Cs: blocca i canali K dipendenti dalla tensione e migliora le condizioni di morsetto dello spazio ai dendriti remoti aumentando la costante di lunghezza. La pressione osmotica misurata è di 285 mOsm/kg.
    3. Preparare 200 aliquote l'aliquote delle soluzioni e conservarle a -30 gradi centigradi.

2. Dissezione e taglio del cervello

  1. Raffreddare e ossigenare due becher da 50 mL di ACSF sul ghiaccio fino a quando la temperatura è inferiore a 4 gradi centigradi. Aggiungere 50 -L di tetrodotossina (TTX, 1 mM) in uno dei becher ghiacciati di ACSF e riservarlo per il taglio delle fette. Per ottenere la fetta cerebellare del topo che riserva la capacità di indurre LTD, è necessaria l'aggiunta di TTX al normale ACSF.
  2. Raffreddare il vassoio dei campioni di metallo riempiendo una zona di bagno di ghiaccio della camera di taglio con ghiaccio.
  3. Versare 1 mL di isoflurane in un barattolo anestesizzante(1000 mL) quindi posizionarvi un topo per 30-45 s. Assicurarsi che il mouse sia profondamente anesteto confermando la sua incapacità di rispondere alla stimolazione meccanica.
  4. Decapitare il topo usando forbici chirurgiche. Tenere la testa e tagliare la pelle superficiale lungo la linea mediana utilizzando una forbice oftalmologica. Tirare la pelle tenendo con le dita per esporre ampiamente la superficie del cranio.
  5. Tagliare il cranio orizzontalmente lungo una linea dal foro spinocerebellare maggiore appena sopra l'orecchio e l'occhio utilizzando una forbice oftalmologica. Tagliare il cranio lungo una linea sopra entrambi gli occhi e rimuovere per isolare il cranio.
  6. Tagliare il cervello al centro del cervello usando un bisturi, quindi isolare la parte caudale del cervello compreso il cervelletto dal cranio. Immergilo in un becher ghiacciato di ACSF. Di solito, il tempo totale dalla decapitazione all'immersione del blocco cerebrale nel becher pre-raffreddato di ACSF dovrebbe essere inferiore a 60 s.
  7. Posizione di tubo gorgogliante dovrebbe essere regolato in modo da non mescolare il blocco cerebrale nel becher. Danni meccanici possono causare gonfiore della fetta durante la registrazione. Lasciare per almeno 7 min e lasciare che il cervello di raffreddare.
  8. Per tagliare il blocco cerebrale, tagliare un pezzo di agar rettangolare (2 cm x 2 cm) da una grande piastra di agar (4 cm x 10 cm, conservata a 4 gradi centigradi) e metterla su una carta da filtro per assorbire il liquido in eccesso.
  9. Capovolgere il pezzo di agar sulla carta da filtro, quindi posizionare il pezzo di agar su una carta da filtro su un vassoio di campioni di metallo pre-raffreddato (16 cm x 20 cm). Raccogliere il blocco cerebrale utilizzando una spatola e assorbire liquido eccessivo intorno ad esso con un pezzo di carta da filtro.
  10. Montare il blocco cerebrale sul blocco di agar utilizzando la colla (adesivo istantaneo cianoacrilato medico). Assicurarsi di attaccare il fondo (lato ventrale) del blocco cerebrale all'agar.
  11. Tagliare l'emisfero destro con una lama. Assicurarsi che il lato del piano di taglio sia il più parallelo possibile al piano dendritico del PC perché questo lato è attaccato alla superficie del vassoio del provino. Tagliare e rimuovere l'altro lato dell'emisfero. Quindi, tagliare il cervello tra i colliculi superiori e inferiori, e tagliare il midollo spinale.
  12. Incollare il lato destro del cervelletto tagliato con il blocco di agar sul vassoio dei campioni pre-raffreddati. Stendere la colla in eccesso intorno al cerriletto con la parte piatta di una spatola, per evitare che la colla in eccesso si attacchi alla superficie del cerebellare. Inclinare il vassoio di metallo e versare ACSF al fine di fissare la colla e lavare via la colla in eccesso.

3. Affettare il cervello

  1. Orientare il campione in modo che il lato dorsale del cervelletto si trova sul lato anteriore. Versare a CAGOdi di taglio a freddo ghiaccio, contenente 1 TTX, sufficiente a immergere completamente il cervelletto. Mettere un tubo del gas nell'ACSF e iniziare a spumeggiare con miscela di gas O2/ CO2.
  2. Rimuovere il mater aracnoide utilizzando una pinzetta fine sotto il binocolo. Tagliare il peduncolo cerebellare con una lama, e rimuovere il tronco encefalico e il blocco di agar. Ruotare il vassoio di 180 gradi, in modo che la superficie dorsale del cervelletto si affaccia su una lama di rasoio.
  3. Impostare la lama e regolare la prima posizione di taglio. Impostare i parametri di sezionamento del vibratoma su: ampiezza a 5,5, frequenza a 85 Hz, velocità a 3-4 e spessore della fetta su 300 m.
  4. Trasferire la fetta cerebellare su una rete di nylon in un'incubatrice acrilica e immergerla completamente nell'ACSF ossigenato. L'incubatrice deve essere collocata in un bagno d'acqua che mantenga una temperatura a 26 gradi centigradi.
  5. Conservare le fette per almeno 1 h per consentire il recupero dal danno durante la sezionamento.

4. Registrazione patch-cl di patch a cella intera

NOT: La registrazione di un patch-clamp richiede le seguenti apparecchiature: un microscopio verticale con ottica a contrasto differenziale di interferenza a infrarossi (IR-DIC), un amplificatore patch-clamp, digitalizzatore di dati, stimolatore digitale, isolatore, computer, software per l'acquisizione di dati e analisi, manipolatore motorizzato, piattaforma al microscopio, tavolo di isolamento delle vibrazioni, gabbia di Faraday, sistema di riscaldamento della soluzione, pompe peristaliche e tiro elettrodo.

  1. Aggiungere la picrotosina (0,1 mM) ad ACSF e risolverla usando l'ultra-sonicazione per 3 min.
  2. Perfuso una camera di registrazione con picrotossina contenente, O2-CO2-saturata ACSF alla velocità di 2 mL/min. Mantenere la temperatura della camera di registrazione a circa 30 gradi centigradi.
  3. Fare un elettrodo di registrazione tirando un capillare di vetro borosilicato con filamento (diametro esterno 1,5 mm) utilizzando un tiratore con 4 passi. Il diametro della punta dovrebbe essere di circa 1 m.
  4. Fai un elettrodo stimolante tirando lo stesso capillare usando l'appullante con 2 passi, quindi spezza per produrre una punta fine colpendo la punta contro un blocco di ferro sotto un microscopio binoculare. Il diametro finale dovrebbe essere di 3-5 m.
  5. Trasferire la fetta cerebellare nella camera di registrazione e fissarla con un peso Pt con fili di nylon. Riempire un elettrodo stimolante con ACSF.
  6. Per la stimolazione degli IP, posizionare l'elettrodo stimolante sulla superficie dello strato molecolare, a circa 50 m di distanza dallo strato di cellule Purkinje.
  7. Per la stimolazione della CF, posizionare l'elettrodo stimolante nella parte inferiore dello strato cellulare Purkinje (passaggi 5.3, 5.4).
  8. Filtrarelasoluzione interna basata su K oCscon un filtro di 0,45 m. Utilizzare un micro-caricatore per riempire un elettrodo di registrazione con 8 l- di soluzione interna.
  9. Applicare una pressione positiva debole all'elettrodo di registrazione prima di immergerlo nell'ACSF. La sua resistenza dovrebbe essere 2-4 M e il potenziale giunzionale liquido deve essere corretto.
  10. Avvicinati al corpo cellulare sano e luminoso del PC con l'elettrodo di registrazione. Spingere leggermente la superficie della cella Purkinje, interrompere l'applicazione di pressione positiva, quindi applicare la pressione negativa fino a formare un sigillo giga-ohm. Quindi stabilire la configurazione dell'intera cella utilizzando la pressione negativa.
  11. Mantenere il potenziale della membrana a -70 mV e applicare un impulso di -2 mV (durata, 100 ms) a 0,1 Hz per monitorare la resistenza all'ingresso, la resistenza alla serie e la capacità di ingresso, in modo continuo. Non utilizzare la compensazione di resistenza della serie. Eliminare i dati quando la resistenza della serie varia di oltre il 15%.

5. Induzione di LTD

  1. Stimolare lo strato molecolare con un impulso (durata, 0,1 ms). Identificare le correnti post-eccitatorie PF (EPSC) applicando uno stimolo a doppio impulso (intervallo interspike (ISI) di 50 ms). Il PF-EPSC dovrebbe mostrare facilitazione a impulsi accoppiati e graduale aumento dell'ampiezza rispetto all'aumento dell'intensità di stimolazione.
  2. Registrare la risposta di prova del PF-EPSC applicando un singolo impulso a 0,1 Hz. Regolare l'intensità dello stimolo in modo che l'ampiezza EPSC evocata sia di circa 200 pA. Evitare la contaminazione della corrente attraverso il canale ionico dipendente dalla tensione.
  3. Stimolare la CF nella parte inferiore dello strato cellulare Purkinje e identificare l'EPSC suscitato dall'attivazione della CF (applicando uno stimolo a doppio impulso). Il CF-EPSC dovrebbe mostrare depressione a impulsi accoppiati e un modo tutto o nessuno in base all'aumento dell'intensità di stimolazione. Per l'induzione di LTD, deve essere utilizzato un singolo stimolo.
  4. Protocollo di induzione LTD 1
    1. Utilizzando un elettrodo che contiene una soluzione interna basata suKin condizioni di morsetto corrente, applicare un singolo PF-stimolo e un singolo CF-stimolo contemporaneamente a 1 Hz per 5 min (300 impulsi) (Figura 1A).
  5. Protocollo di induzione LTD 2
    1. Utilizzando una soluzione internabasata su elettrodi in condizioni di morsetto corrente, applicare il doppio PF-stimoli (ISI di 50 ms) e un singolo CF-stimolo come il secondo PF-stimolo è coincidente con CF-stimoli a 1 Hz per 5 min (Figura 1B).
  6. Protocollo LTD-inducing 3
    1. Utilizzando un elettrodo che contiene una soluzione interna basata suCsin condizioni di coagulazione di tensione, applicare un doppio PF-stimolo (ISI di 50 ms) e un singolo passo di tensione depolarizzante (-70 a 0 mV, 50 ms) al soma a 1 Hz per 3 min, in modo che il secondo PF-smulus sia equivalente all'inizio della fase di tensione depolarizzante(Figura 1C).
  7. Protocollo che induce LTD-4
    1. Utilizzando un elettrodo che contiene una soluzione interna basata suCsin condizioni di morsetto di tensione, applicare il PF-stimuli (5x a 100 Hz) e un singolo passo depolarizzante della tensione (-70 a 0 mV, 50 ms) al soma a 0,5 Hz per 3 min, contemporaneamente ( Figura 1D ( Figura 1D (Figura 1D ).

Risultati

Quattro protocolli sono stati utilizzati in questo studio per indurre cerebellar LTD. Nei primi due protocolli (protocollo 1 e 2), la congiunzione della stimolazione PF e della stimolazione CF è stata applicata in condizioni di morsetto attuali. Negli altri due protocolli (protocollo 3 e 4), la depolarizzazione somatica è stata sostituita per la stimolazione CF in condizioni di tensione-blocco. Sono state confrontate tracce di tensione o tracce di corrente durante la stimolazione congiuntiva (Figur...

Discussione

Differenze tra i quattro protocolli

Nei protocolli di induzione di LTD 1 e 2, Cjs 300 volte a 1 Hz è sufficiente per indurre cerebellar LTD. Frequenza di stimolazione della CF sembrava essere in una gamma fisiologica, perché il complesso tasso di cottura picco nei topi adulti di allarme (P60) è stato segnalato per essere 1.25 Hz36. Tuttavia, la stimolazione CF da sola non ha causato plasticità a lungo termine nella sinapsi PF-CF, come utilizzato nei protocolli 1 e 2 (...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Ringraziamo A. Oba per la sua assistenza tecnica. Questa ricerca è stata parzialmente supportata da Grant-in-Aid for Scientific Research (C) 17K01982 a K.Y.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
AmplifierMolecular Devices-AxonMulticlamp 700B
Borosilicate glass capillarySutterBF150-110-10
DigitizerMolecular Devices-AxonDigidata1322A
Electrode pullerSutterModel P-97
IsofluraneFUJIFILM Wako Pure Chemical26675-46-7
IsolatorA.M.P.I.ISOflex
Linear slicerDosaka EMPRO7N
MicroscopeNIKONEclipse E600FN
Peristaltic pumpGilsonMP1 Single Channel Pump
PicrotoxinSigma-AldrichP1675
Pure water makerMerck-MilliporeMilliQ 7000
Software for experimentMolecular probe-AxonpClamp 10
Software for statisticsKyensLabKyPlot 5.0
StimulatorWPIDS8000
Temperature controllerWarnerTC-324B
TetrodotoxinTocris1078

Riferimenti

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