성인 소뇌 슬라이스에 장기 우울증 유도의 평가

요약

일부 유전자 조작 동물에서, 단일 프로토콜을 사용하여 소뇌 Purkinje 세포에서 LTD를 유도하는 데 실패할 수 있으며, LTD와 모터 학습 사이에 불일치가 있을 수 있다. 유전자 조작 동물에서 LTD 유도를 평가하기 위해 여러 프로토콜이 필요합니다. 표준 프로토콜이 표시됩니다.

초록

시냅스 가소성은 학습과 기억을 위한 메커니즘을 제공합니다. 소뇌 운동 학습의 경우, 병렬 섬유 (PF)에서 Purkinje 세포 (PC)에 시냅스 전송의 장기 우울증 (LTD)는 모터 학습의 기초로 간주되며, LTD 및 모터 학습모두의 결핍은 다양한 에서 관찰된다 유전자 조작 동물. 안구 반사(OKR), 전두환-안구 반사(VOR) 및 회전 시험의 적응과 같은 일반적인 운동 학습 세트는 운동 학습 능력의 평가에 사용되었다. 그러나, GluA2-카르복시 종단 변형 마우스로부터 얻은 결과는 PF-LTD가 부족함에도 불구하고 VOR 및 OKR의 정상적인 적응을 입증하였다. 이 보고서에서, LTD의 유도는 실온에서 한 가지 유형의 자극 프로토콜을 사용하여 시도되었다. 따라서, 소뇌 를 유도하는 조건은 거의 생리적 온도에서 다양한 프로토콜을 사용하여 동일한 노크인 돌연변이체에서 탐구되었다. 마지막으로, 우리는 LTD가 이 유전자 조작마우스에서 유도될 수 있는 자극 프로토콜을 발견했습니다. 이 연구에서는 LTD-유도를 평가하기 위해 일련의 프로토콜이 제안되어 LTD와 모터 학습 사이의 인과 관계를 보다 정확하게 검사할 수 있습니다. 결론적으로, 실험 조건은 유전자 조작 마우스에서 LTD를 평가할 때 결정적이다.

서문

PC, 분자층 인터뉴런(바구니 및 스텔레이트 세포), 골지 세포, 과립 세포로부터의 PF, 이끼 섬유 및 등반 섬유(CFs)로 구성된 소뇌 피질의 정교한 뉴런 네트워크의 시냅스 조직이 해명되었습니다. 여기 / 억제 및 발산 / 수렴의 관점에서, 잘 조직 된 회로 도면은 소뇌가 "신경^{기계"1이라고}제안했지만 이전에는이 "기계"의 목적에 대해 전혀 알지 못했습니다. 나중에 Marr는 PC에 대한 PFs 입력이 삼중 층 연관 학습 네트워크^2를구성할 것을 제안했다. 그는 또한 각 CF원소 운동에 대한 대뇌 지시를 전달하는 것이 좋습니다². 그는 PF와 CF의 동시 활성화가 PF-PC 시냅스 활성을 향상시키고, PF-PC 시냅스의 장기 적인 강력성(LTP)을 유발할 것이라고 가정했습니다. 한편, Albus는 PF와 CF의 동기 활성화가 PF-PC 시냅스^3에서LTD를 초래했다고 가정했습니다. 위의 두 연구는 소뇌를 독특한 메모리 장치로 해석하며, 소뇌 피질 네트워크에 통합하면 Marr-Albus 모델 학습 기계 모델의 형성으로 이어집니다.

이러한 이론적 예측에 따라, 증거의 두 줄은 소뇌에 시 냅 스가 소의 존재를 제안. 증거의 첫 번째 줄은 flocculus의 해부학 조직에 의해 제안되었다; 여기에 전정 기관 기원의 MF 경로와 망막 기원의 CF 경로는 PC에 수렴^4. 이 독특한 수렴 패턴은 응고에서 발생하는 시냅스 가소성이 현관 -안구 반사의 현저한 적응성을 유발한다는 것을 시사합니다. 둘째, 상기 가설^5,6,7을지지한 부두및 플류쿠스의 병변에서의 PC 반응의 기록도 뒷받침한다. 더욱이, 원숭이의 손 운동 8의 적응 시 PC 방전^패턴은 시냅스 가설, 특히 알버스의 LTD 가설3을 지지했다.

시냅스 가소성의 성질을 직접 확인하기 위해, PC를 생체 내에서 특이적으로 조절하는 PF및 CF의 번들의 반복적인 결막 자극(Cjs)은 PF-PC 시냅스의 투과 효능에 대한 LTD를 유도하는 것으로 나타났다^{9, 10,11}. 후속 시험관내 탐사에서 소뇌 슬라이스¹² 및 배양된 PC를 사용하여, 공동 배양된 과립 세포 자극 및 올리브 세포^자극(13) 또는 이온토포리스트 및 체세포의 결합 탈분극^14,15 는 LTD. LTD-유도의 기초가 되는 신호 환전 메커니즘도 시험관내 제제^16,17을사용하여 집중적으로 조사되었다.

VOR 및 OKR의 적응은 종종 소뇌 운동 학습에 대한 유전자 조작 효과의 정량적 평가에 사용되었으며, 이는 현관-소뇌 피질이 VOR^18의 적응 학습에서 필수적인 기원인 것으로 입증되었기 때문입니다. ^,19,20 및 OKR^19,21 LTD 유도 실패와 행동 모터 학습장애 사이의 상관관계는 LTD가 모터에서 필수적인 역할을 한다는 증거로 간주되었습니다. 학습 메커니즘²². 이러한 견해는 총칭하여 모터 학습의 LTD 가설, 또는 Marr-Albus-Ito 가설^{23,24,25,26으로}지칭된다.

눈 운동의 적응 학습은 유사한 프로토콜을 사용하여 측정되었으며, 다양한 실험 조건은 슬라이스 준비^{27,28,29,30,31에서 LTD를 유도하는 데 사용되었습니다.} . 최근 Schonewille 등²⁶ 일부 유전자 조작 마우스는 정상적인 운동 학습을 입증했지만 소뇌 조각은 LTD를 보여주지 않았으며, 따라서 LTD가 모터 학습에 필수적이지 않다는 결론을 내렸습니다. 그러나, LTD의 유도는 실온에서 한 가지 유형의 프로토콜만을 사용하여 시도되었다. 따라서, 우리는 약 30 °C에서 기록 조건 하에서 LTD 유도 프로토콜의 여러 유형을 사용하고, 우리는 LTD가 거의 생리적 온도^32에서이러한 프로토콜을 사용하여 유전자 조작 마우스에서 안정적으로 유도되었다는 것을 확인하였다.

그러나, 결막 자극의 기본 속성에 관한 몇 가지 질문이 남아있다. 첫 번째는 복잡한 스파이크의 모양과 LTD의 진폭 간의 관계입니다. 둘째, PF-자극 및 체세포 탈분극과 함께, 사용된 자극의 수가 필요한지 아닌지는 모호했다. 본 연구에서, 이들 질문은 야생형(WT) 마우스를 사용하여 조사하였다.

프로토콜

모든 실험 절차는 실험에서 동물의 관리 및 사용에 대한 RIKEN 위원회의 승인을 받았습니다. 마우스는 잘 제어 된 온도 (23-25 ° C)와 습도 (45 %-65 %)에서 뇌 과학RIKEN 센터의 동물 시설에 보관되었다 조건. 남성과 여성 WT 마우스 둘 다 사용 (C57BL/6, 3-6 개월) 사용 되었다.

1. 실험에 사용되는 솔루션준비

참고: 모든 용액은 금속 (저항 > 18.2 MΩ) 및 기타 불순물 (총 유기 탄소 (TOC) 및 lt; 5.0 ppb)가없는 초순수로 만들어야합니다. 슬라이스 절단 및 기록을위한 인공 뇌척수액 (ACSF)은 ACSF의 10 배 (x10) 재고에서 실험 당일에 신선하게 만들어집니다. 사용 전에 5% CO₂/ 95 % O 2 가스 혼합물로_용액을 거품. ACSF의 pH는 7.4±0.1로 조정되고, 삼투압은 초순수를 첨가하여 315±5 mOsm/kg으로 조정된다.

1. 1250 mM NaCl, 30 mM KCl, 12.5 mM NaH₂PO_4,260 mM NaHCO_3를포함하는 ACSF의 10 배 주식을 준비하십시오. 이 용액은 4°C에서 보관할 수 있다.
2. 125 mM NaCl, 3 mM KCl, 2 mM CaCl_2,1 mM Mg₂SO_4,1.25 mM NaH₂PO_4,26 mM NaHCO₃ 및 20 mM 포도당을 포함하는 작업 ACSF를 준비하십시오.
   1. 먼저, 침전을 피하기 위해 1 mL의 2 M CaCl₂ 용액을 1 mL에 넣고 1 MM Mg₂SO₄ 용액을 약 800 mL의 초순수에 넣습니다. 그런 다음 10x ACSF와 포도당 100 mL을 추가합니다. 마지막으로, 초순수를 첨가하여 총 1,000 mL의 부피를 구성합니다.
3. 뇌 처리를 위해 3.3% 한천을 준비하십시오. 한천 1 g을 0.9% NaCl 용액 의 30 mL에 녹이고 끓일 때까지 전자 레인지에서 가열하십시오. 저어서 섞은 다음 멸균 된 4cm x 10cm 플라스틱 상자에 붓고 굳어질 수 있습니다. 한천 판(~두께 8mm)을 냉장고에 보관하십시오.
4. 내부 솔루션을 준비합니다.
   1. 60 mM KCl, 60 mM K-글루코네이트, 0.3 mM EGTA, 4 mM MgCl_2,4 mM ATP, 0.4 mM GTP 및 30 mM HEPES (pH 7.2)를 포함하는 K⁺기반 내부 용액을 준비합니다.
      참고: 느린^Ca2+-킬레이터인 EGTA의 낮은 농도(0.3 mM)는 순수한 물에 오염된 Ca^2+를 킬레이트에 첨가하지만, 내부 용액에서 EGTA의 이 낮은 농도는 LTD의 유도를 결코 차단하지 않습니다(그림 3, 도 4, 도 5)전체 셀 레코딩 동안. 측정된 삼투압은 285mm/kg입니다.
   2. 60 mM CsCl, 46 mM D-글루코네이트, 27 mM 테트라에틸암모늄 염화물 (TEA-Cl), 0.3 mM EGTA, 4 mM MgCl_2,4 mM ATP, 0.4 mM GTP 및 30 mM HEPES (pH 7.2, 조정 된 Cs를 사용하여)를 포함하는 Cs⁺기반 내부 용액을 준비합니다.
      참고: Cs^+는 전압에 의존하는 K 채널을 차단하고 길이 상수를 증가시켜 원격 수상돌기의 공간 클램프 조건을 향상시킵니다. 측정된 삼투압은 285mm/kg입니다.
   3. 용액의 200 μL aliquots를 준비하고 -30 °C에 보관하십시오.

2. 뇌 해부 및 트리밍

1. 온도가 4 °C 보다 낮을 때까지 얼음에 ACSF의 두 50 mL 비커를 냉각하고 산소. 50 μL의 테트로도톡신(TTX, 1 mM)을 ACSF의 차가운 비커 중 하나에 넣고 슬라이스 절단을 위해 예약하십시오. 마우스 소뇌 슬라이스 를 얻기 위해 LTD 유도 능력을 예약, 정상 ACSF에 TTX의 추가가 필요하다.
2. 슬라이스 챔버의 얼음 욕조 영역을 얼음으로 채우면서 금속 표본 트레이를 식힙니다.
3. 이소플루란 1mL를 마취 용기(~1000mL)에 부은 다음 마우스를 30-45s에 넣은 다음 마우스가 기계적 자극에 반응할 수 없음을 확인하여 마우스가 깊이 마취되었는지 확인합니다.
4. 외과 용 가위를 사용하여 마우스를 참수하십시오. 머리를 잡고 안과 가위를 사용하여 중간선을 따라 피상적 인 피부를 잘라. 손가락으로 피부를 당겨 두개골의 표면을 넓게 노출시다.
5. 안과 가위를 사용하여 귀와 눈 바로 위의 주요 척추 구개 구멍에서 선을 따라 두개골을 수평으로 자릅니다. 두개골을 양쪽 눈 위의 선을 따라 자르고 두개골을 분리합니다.
6. 메스를 사용하여 뇌의 중간에 뇌를 잘라, 다음 두개골에서 소뇌를 포함한 뇌의 꼬리 부분을 분리. ACSF의 얼음 차가운 비커에 담그고. 보통, ACSF의 미리 차가운 비커에 뇌 블록의 침수에 참수에서 총 시간은 60 초 미만이어야한다.
7. 버블링 튜브의 위치는 비커에서 뇌 블록을 교반하지 않도록 조정해야합니다. 기계적 손상은 기록 중에 슬라이스의 팽윤을 일으킬 수 있습니다. 적어도 7 분 동안 방치하고 뇌가 식도록하십시오.
8. 뇌 블록을 다듬기 위해 큰 한천 접시 (4cm x 10cm, 4 °C에 보관)에서 직사각형 한천 조각 (2cm x 2cm)을 자르고 여분의 액체를 흡수하기 위해 필터 종이에 놓습니다.
9. 한천 조각을 필터 용지에 거꾸로 뒤집은 다음 한천 조각을 미리 차가운 금속 표본 트레이(16cm x 20cm)에 여과지에 놓습니다. 주걱을 사용하여 뇌 블록을 선택하고 필터 종이 조각으로 주위에 과도한 액체를 흡수.
10. 접착제 (의료 시아노 아크릴레이트 인스턴트 접착제)를 사용하여 한천 블록에 뇌 블록을 마운트합니다. 한천에 뇌 블록의 바닥 (복부 쪽)을 부착해야합니다.
11. 블레이드로 오른쪽 반구를 잘라냅니다. 절단 평면의 측면이 시편 트레이의 표면에 부착되어 있기 때문에 절단 평면의 측면이 PC의 수지상 평면과 가능한 평행을 이뤄야 합니다. 반구의 다른 쪽을 잘라내고 제거합니다. 그런 다음, 우수하고 열등한 콜리큘리 사이의 뇌를 잘라 내고 척수를 잘라냅니다.
12. 한천 블록을 미리 차가운 표본 트레이에 다듬은 소뇌의 오른쪽을 붙입니다. 주걱의 평평한 부분으로 소뇌 주위에 여분의 접착제를 확산, 소뇌 표면에 부착에서 과잉 접착제를 방지하기 위해. 금속 트레이를 기울이고 ACSF를 부어 접착제를 고정하고 여분의 접착제를 씻어냅니다.

3. 뇌 슬라이스

1. 소뇌의 등쪽이 전면에 있도록 샘플을 지향. 소뇌를 완전히 담그기에 충분한 1 μM TTX를 함유 한 얼음 차가운 절단 ACSF를 붓습니다. 가스 튜브를 ACSF에 넣고 O₂/CO₂ 가스 혼합물로 버블링을 시작합니다.
2. 쌍안경 아래 의 미세 핀처를 사용하여 거미를 제거합니다. 소뇌 페달을 칼로 자르고 뇌간과 한천 블록을 제거하십시오. 소뇌의 등쪽 표면이 면도날을 향할 수 있도록 트레이를 180°로 회전시킴.
3. 블레이드를 설정하고 첫 번째 절단 위치를 조정합니다. 진폭을 5.5로, 주파수를 85Hz로, 속도를 3-4로, 슬라이스 두께를 300μm로 설정합니다.
4. 나일론 그물에 소뇌 슬라이스를 아크릴 인큐베이터에 옮기고 산소ACSF에 슬라이스를 완전히 담급종합니다. 인큐베이터는 26 °C에서 온도를 유지하는 수조에 배치되어야한다.
5. 슬라이스를 슬라이스하는 동안 손상에서 복구할 수 있도록 슬라이스를 최소 1시간 동안 보관합니다.

4. 전체 셀 패치 클램프 기록

참고: 패치 클램프 기록에는 적외선 차동 간섭 콘트라스트(IR-DIC) 광학이 있는 직립 현미경, 패치 클램프 증폭기, 데이터 디지타이저, 디지털 자극기, 방열제, 컴퓨터, 데이터 수집용 소프트웨어 및 분석, 전동 조작기, 현미경 플랫폼, 진동 격리 테이블, 패러데이 케이지, 솔루션 가열 시스템, 연동 펌프 및 전극 풀러.

1. ACSF에 픽로톡신(0.1mM)을 추가하고 3분 동안 초음파 처리로 해결합니다.
2. 피크로톡신 함유, O2-CO2-포화 ACSF를2 mL/min의 속도로 녹음 챔버에 침투.
3. 필라멘트(외경 = 1.5 mm)로 보로실리케이트 유리 모세관을 당겨 4단풀러를 사용하여 기록 전극을 만든다. 팁 직경은 약 1 μm이어야 합니다.
4. 2 단계로 풀러를 사용하여 동일한 모세관을 당겨 자극 전극을 만들고 쌍안경 현미경 아래철 블록에 대한 팁을 쳐서 미세한 팁을 생성합니다. 최종 직경은 3-5 μm이어야 합니다.
5. 소뇌 슬라이스를 녹음 실로 옮기고 나일론 실로 Pt-weight로 고정합니다. 자극 전극을 ACSF로 채웁니다.
6. PFs의 자극을 위해, Purkinje 세포 층에서 약 50 μm 떨어진 분자 층의 표면에 자극 전극을 놓습니다.
7. CF의 자극을 위해, 자극 전극을 Purkinje 세포층의 바닥에 놓습니다(단계 5.3, 5.4).
8. 0.45 μm 필터를 갖춘 K⁺-기반 또는 Cs⁺기반 내부 솔루션을 필터링합니다. 마이크로 로더를 사용하여 8 μL의 내부 용액으로 기록 전극을 채웁니다.
9. ACSF에 담그기 전에 기록 전극에 약한 양압을 가합니다. 저항은 2-4 MΩ이어야하며 액체 접합 전위를 수정해야합니다.
10. 기록 전극으로 PC의 건강하고 밝은 세포체에 접근합니다. Purkinje 세포의 표면을 살짝 밀고 양압을 가하는 것을 멈추고 기가 옴 씰을 형성 할 때까지 음압을 적용하십시오. 그런 다음 음압을 사용하여 전체 셀 구성을 설정합니다.
11. 멤브레인 전위를 -70 mV로 잡고 0.1Hz에서 -2 mV 펄스(지속 시간, 100ms)를 적용하여 입력 저항, 직렬 저항 및 입력 정전 용량을 지속적으로 모니터링합니다. 시리즈 저항 보정을 사용하지 마십시오. 계열 저항이 15% 이상 변하는 경우 데이터를 삭제합니다.

5. 주식회사 유도

1. 펄스 (지속 시간, 0.1 ms)로 분자 층을 자극하십시오. 이중 펄스 자극(50 ms의 인터스파이크 간격(ISI)을 적용하여 PF-흥분성 후분 전류(EPSC)를 식별합니다. PF-EPSC는 자극 강도의 증가에 비해 진폭의 쌍-펄스 촉진 및 점진적 증가를 보여주어야 한다.
2. 0.1 Hz에서 단일 펄스를 적용하여 PF-EPSC의 테스트 응답을 기록합니다. 자극의 강도를 조정하여 자극의 강도를 조정하여 자극이 약 200 pA가 되도록 합니다. 전압 의존이도 이온 채널을 통해 전류의 오염을 방지합니다.
3. Purkinje 세포 층의 하단에 있는 CF를 자극하고, CF 활성화에 의해 유도된 EPSC를 식별합니다(이중 펄스 자극을 적용하여). CF-EPSC는 자극 강도의 증가에 따라 쌍-펄스 우울증 및 전부 또는 없음 방식을 보여야 한다. LTD 유도의 경우 단일 자극을 사용해야 합니다.
4. LTD 유도 프로토콜 1
   1. 전류 클램프 조건에서 K⁺기반 내부 용액을 포함하는 전극을 사용하여 5 분 (300 펄스)에 대해 1 Hz에서 단일 PF 자극과 단일 CF 자극을 동시에 적용합니다(그림 1A).
5. LTD 유도 프로토콜 2
   1. 전류 클램프 조건하에서 전극 함유 K⁺기반 내부 용액을 사용하여 두 번째 PF 자극이 5 분 동안 1 Hz에서 CF 자극과 일치함에 따라 이중 PF 자극 (ISI 50 ms)과 단일 CF 자극을 적용합니다(그림 1B).
6. LTD 유도 프로토콜 3
   1. 전압 클램프 조건에서 Cs⁺-기반 내부 용액을 포함하는 전극을 사용하여 이중 PF 자극 (ISI 50 ms)과 단일 탈편극 전압 단계 (-70 ~ 0 mV, 50 ms)를 1 Hz에서 3 분 동안 소마에 적용하여 두 번째 PF 자극이 탈분극 전압 단계의 시작과동일합니다(그림 1C).
7. LTD 유도 프로토콜-4
   1. 전압 클램프 조건에서 Cs⁺기반 내부 용액을 포함하는 전극을 사용하여 PF 자극 (100 Hz에서 5x)과 단일 탈편광 전압 단계 (-70 ~ 0 mV, 50 ms)를 3 분 동안 0.5 Hz에서 소마에 동시에 적용합니다(그림 1D ).

결과

4개의 프로토콜은 소뇌 LTD를 유도하기 위하여 이 연구 결과에서 이용되었다. 처음 두 프로토콜(프로토콜 1 및 2)에서, PF-자극 및 CF-자극의 결합은 전류 클램프 조건 하에서 적용되었다. 다른 두 프로토콜(프로토콜 3 및 4)에서, 체세포 탈분극은 전압 클램프 조건하에서 CF 자극을 대체하였다. 결막 자극 동안의 전압 트레이스 또는 전류 트레이스를비교하였다(도 2).

토론

네 가지 프로토콜 간의 차이점

LTD-유도 프로토콜 1 및 2에서, CJs 300번 은 1Hz에서 소뇌 를 유도하기에^{충분하다.} 그러나, CF 자극 만으로는 프로토콜 1 및 2에서 사용되는 바와 같이 PF-CF 시냅스에서 장기적인 가소성을 일으키지않았으며(도 4, 도 5),CF 자극 이 고주파에서 단독으로 유도된 LTD^24. 프로토콜...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amplifier	Molecular Devices-Axon	Multiclamp 700B
Borosilicate glass capillary	Sutter	BF150-110-10
Digitizer	Molecular Devices-Axon	Digidata1322A
Electrode puller	Sutter	Model P-97
Isoflurane	FUJIFILM Wako Pure Chemical	26675-46-7
Isolator	A.M.P.I.	ISOflex
Linear slicer	Dosaka EM	PRO7N
Microscope	NIKON	Eclipse E600FN
Peristaltic pump	Gilson	MP1 Single Channel Pump
Picrotoxin	Sigma-Aldrich	P1675
Pure water maker	Merck-Millipore	MilliQ 7000
Software for experiment	Molecular probe-Axon	pClamp 10
Software for statistics	KyensLab	KyPlot 5.0
Stimulator	WPI	DS8000
Temperature controller	Warner	TC-324B
Tetrodotoxin	Tocris	1078