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要約

一部の遺伝子操作動物では、単一のプロトコルを使用して、小脳プルキンジェ細胞にLTDを誘導できず、LTDと運動学習の間に不一致がある場合があります。遺伝子操作動物におけるLTD誘導を評価するには、複数のプロトコルが必要です。標準プロトコルが表示されます。

要約

シナプス可塑性は、学習と記憶のためのメカニズムを提供します。小脳運動学習では、並列繊維(PF)からプルキンジェ細胞(PC)へのシナプス伝達の長期うつ病(LTD)が運動学習の基礎と考えられており、LTDと運動学習の両方の欠陥が様々に観察されています。遺伝子操作された動物。運動運動反射(OKR)の適応、前庭眼反射(VOR)、ロタロッド試験などの一般的な運動学習セットを用いて、運動学習能力の評価に用いた。しかし、GluA2-カルボキシー終着を修飾したノックインマウスから得られた結果は、PF-LTDを欠いているにもかかわらず、VORおよびOKRの正常な適応を示した。その報告では、LTDの誘導は室温で1種類の刺激プロトコルを用いてのみ試みた。従って、小脳LTDを誘導する条件を、生理学的温度に近い時点で種々のプロトコルを用いて同じノックイン変異体で探索した。最後に、これらの遺伝子操作マウスにおいてLTDを誘導できる刺激プロトコルを見つけました。本研究では、LTD誘導を評価するための一連のプロトコルが提案され、LTDと運動学習との因果関係をより正確に調べることができます。結論として、遺伝子操作マウスにおいてLTDを評価する際には、実験条件が重要である。

概要

PC、分子層間ニューロン(バスケットおよび星状細胞)、ゴルジ細胞、顆粒細胞からのPF、苔状繊維およびクライミングファイバー(CF)で構成される小脳皮質の精巧な神経ネットワークのシナプス組織が解明された。励起/阻害と発散/収束の観点から、十分に組織化された回路図は、小脳が「ニューロンマシン」1であることを示唆しているが、この「機械」の目的については以前は考えられていなかった。その後、Marrは、PCへのPCへの入力がトリプル層連想学習ネットワーク2を構成することを提案しました。彼はまた、各CFが元素運動2のための脳の指示を伝えるように提案した。彼は、PFとCFの同時活性化がPF-PCシナプス活性を高め、PF-PCシナプスの長期増強(LTP)を引き起こすと仮定した。一方、アルバスは、PFとCFの同期活性化がPF-PCシナプス3でLTDをもたらしたと仮定した。上記の研究はいずれも、小脳をユニークな記憶装置と解釈し、その小脳皮質ネットワークへの組み込みは、マー・アルバスモデル学習機モデルの形成につながる。

これらの理論的予測に続いて、2行の証拠は、小脳中のシナプス可塑性の存在を示唆している。証拠の最初の行は、凝膜の解剖学的組織によって示唆されました。ここでは、前庭器官起源のMF経路と、頸部起源のCF経路がPC4に収束する。このユニークな収束パターンは、凝集体に発生するシナプス可塑性が前庭眼反射の顕著な適応性を引き起こすことを示唆している。第二に、フロクチュラスにおけるPC応答の記録および凝集の病変も上記仮説5、6、7を支持した。さらに、サルの手の動き8の適応中のPC放電パターンは、シナプス可塑性仮説、特にアルバスのLTD-仮説3を支持した。

シナプス可塑性の性質を直接決定するために、生体内でPCを特異的に刺激するPFの束とCFの繰り返し連結刺激(Cjs)は、PF-PCシナプス9の伝達有効性のためにLTDを誘導することが示された。 10、11.その後、小脳スライス12と培養PCを用いたインビトロ探査では、共培養顆粒細胞刺激とオリーブ細胞刺激13またはイオントフォレティック適用グルタメートと体性の組み合わせ脱分極14、15は株式会社を引き起こした。LTD-誘導の基礎となるシグナル伝達機構もインビトロ製剤16,17を用いて集中的に調べた。

前庭小脳皮質がVOR18の適応学習に不可欠な起源であることが証明されたため、VORおよびOKRの適応は、小脳運動学習に対する遺伝子操作効果の定量的評価にしばしば用いられた。,19,20 , OKR19,21 LTD誘導の失敗と行動運動学習の障害との相関関係は、LTDが運動において重要な役割を果たしていることを証明する証拠としてとなっている。学習メカニズム22.これらの見解は、総称して運動学習のLTD仮説、またはマーアルバスイトー仮説23、24、25、26と呼ばれる。

眼球運動の適応学習は同様のプロトコルを用いて測定され、一方、スライス調製27、28、29、30、31におけるLTDを誘導するために様々な実験条件が用いられた。.最近、Schonewille et al.26は、遺伝子操作されたマウスの一部が正常な運動学習を実証したが、小脳のスライスはLTDを示さなかったと報告し、それによってLTDは運動学習に不可欠ではないと結論付けた。しかし、LTDの誘導は室温で1種類のプロトコルを用いてのみ試みた。そこで、30°C前後の記録条件下でいくつかのタイプのLTD誘導プロトコルを用いて、これらのプロトコルを生理温度32に近い温度で用いることで、遺伝子操作マウスに確実に誘導されたことを確認した。

しかし、結膜刺激の基本的な特性に関するいくつかの疑問が残っています。1つ目は、複雑なスパイクの形状とLTDの振幅との関係です。第二に、PF刺激と体細胞脱分極と併せて、使用される刺激の数が必要か否かは解明されなかった。本研究では、これらの質問を野生型(WT)マウスを用いて検討した。

プロトコル

すべての実験手順は、実験における動物のケアと使用に関する理化学研究所委員会によって承認されました。マウスは、十分に制御された温度(23-25°C)と湿度(45%-65%)の下で理化学研究所脳科学センターの動物施設で飼育しました。条件。雄および雌のWTマウス(C57BL/6、3-6ヶ月)を用いた。

1. 実験に用いられるソリューションの準備

注:すべての溶液は、金属(抵抗>18.2 MΩ)およびその他の不純物(総有機炭素(TOC)<5.0 ppb)を含まない超純水で行う必要があります。スライス切断および記録のための働く人工脳脊髄液(ACSF)は、ACSFの10回(x10)ストックから実験の日に新鮮に作られる。使用前に5%CO2/95%O2ガス混合物で溶液を泡立てます。ACSFのpHは7.4±0.1に調整され、超純水を加えることで浸透圧を315±5mOsm/kgに調整します。

  1. 1250 mM NaCl、30 mM KCl、12.5 mM NaH2PO4、および 260 mM NaHCO3を含む ACSF の 10 倍のストックを準備します。この溶液は4°Cで貯えることができる。
  2. 125 mM NaCl、3 mM KCl、2 mM CaCl2、1mM Mg2SO 4、1.25 mM NaH2PO4、26mM NaHCO3および 20 mM ブドウ糖を含む作業 ACSF を調圧します。
    1. まず、沈殿を避けるために、1MMg2SO4溶液の1mLを約800mLの超純水に加え、続いて2MCaCl2溶液の1mLを加える。次に、10x ACSFおよびブドウ糖の100 mLを加える。最後に、超純水を加えて総体積1,000mLにします。
  3. 脳の取り扱いのための3.3%寒天を準備します。0.9%NaCl溶液の30mLに寒天の1gを溶解し、沸騰するまで電子レンジで加熱します。混ぜてから、無菌4cm x 10cmのプラスチックボックスに注ぎ、固化します。寒天板(厚さ約8mm)を冷蔵庫に保管してください。
  4. 内部ソリューションを準備します。
    1. 60 mM KCl、60 mM K-グルコン酸、0.3 mM EGTA、4 mM MgCl2、4mM ATP、0.4 mM GTP および 30 mM HEPES(pH 7.2)を含む K+ベースの内部溶液を調製します。
      注:EGTAの低濃度(0.3mM)、遅いCa2+-chelatorは、純水中で汚染されたCa2+をキレートするために添加されますが、内部溶液中のEGTAのこの低濃度はLTDの誘導を妨げることはありません(図3、図4、図5)は、全細胞記録中である。測定された浸透圧は285 mOsm/kgである。
    2. 60 mM CsCl、46 mM D-グルコン酸、27 mM テトラエチランモニウム塩化物(TEA-Cl)、0.3 mM EGTA、4 mM MgCl2、4mM ATP、0.4 mM GTP および 30 mM HEPES(pH 7.2、CsOH を使用して調整)を含む Cs+ベースの内部溶液を調製します。
      注:Cs+は電圧依存のKチャネルをブロックし、長さ定数を増やすことによってリモートデンドライトのスペースクランプ条件を改善します。測定された浸透圧は285 mOsm/kgである。
    3. 溶液の200 μLアリコートを準備し、-30 °Cで保存します。

2. 脳解剖とトリミング

  1. 温度が4°Cより低くなるまで、氷上のACSFの2つの50 mLビーカーを冷蔵して酸素化します。ACSFの氷冷ビーカーの1つに50 μLのテトロドトキシン(TTX、1 mM)を加え、スライス切断用に予約します。マウス小脳スライス予約LTD誘導能を得るためには、通常のACSFにTTXを添加する必要がある。
  2. スライス室の氷浴エリアを氷で満たして、金属試料トレイを冷却します。
  3. イソフルランの1 mLを麻酔瓶(~1000mL)に注ぎ、30~45sのマウスを入れ、機械的刺激に反応できないことを確認して深く麻酔を行います。
  4. 外科用はさみを使ってマウスの首を切り落とす。頭部を保持し、眼科のはさみを使用して中間線に沿って表在性皮膚をカットします。指で持って皮膚を引っ張り、頭蓋骨の表面を広く露出させます。
  5. 眼科用はさみを使用して、耳と目のすぐ上にある主要な脊椎脳の穴から線に沿って水平に頭蓋骨を切断します。両目の上の線に沿って頭蓋骨をカットし、頭蓋骨を分離するために削除します。
  6. メスを使用して脳の真ん中で脳を切断し、頭蓋骨から小脳を含む脳の側頭部分を分離します。ACSFの氷冷ビーカーに浸します。通常、ACSFの予め冷やされたビーカーへの脳ブロックの切断から浸漬までの合計時間は60s未満でなければなりません。
  7. バブリングチューブの位置は、ビーカーで脳ブロックをかき混ぜないように調整する必要があります。機械的な損傷は、記録中にスライスの腫れを引き起こす可能性があります。少なくとも7分間放置し、脳を冷やすことができます。
  8. 脳ブロックをトリミングするには、大きな寒天板(4cm x 10 cm、4°Cに保存)から長方形の寒天片(2cm x 2cm)を切り、余分な液体を吸収するためにフィルターペーパーに置きます。
  9. 寒天片をフィルターペーパーの上に逆さまにし、冷や部分をあらかじめ冷やした金属試料トレイ(16cm x 20 cm)のフィルターペーパーに置きます。へらを使って脳ブロックを拾い、フィルターペーパーで周囲の過剰な液体を吸収します。
  10. 接着剤(医療シアノクリレートインスタント接着剤)を使用して寒天ブロックに脳ブロックをマウントします。寒天に脳ブロックの底部(腹部側)を取り付けることを確認してください。
  11. 右半球を刃で切り取る。この側面は試料トレイの表面に取り付けられているので、切断面の側面がPCの樹状面にできるだけ平行であることを確認してください。半球の反対側を切り取って取り外します。次いで、上司と劣ったコリクリの間で脳を切り取り、脊髄を切り取る。
  12. トリミングされた小脳の右側を寒天ブロックで、あらかじめ冷やされた標本トレイに接着します。余分な接着剤が小脳表面に付着するのを防ぐために、ヘラの平らな部分で小脳の周りに余分な接着剤を広げます。金属トレイを傾け、接着剤を固定し、余分な接着剤を洗い流すためにACSFを注ぎます。

3. 脳スライス

  1. 小脳の背面側が前面にあるようなサンプルの向きを付します。1 μM TTXを含む氷冷切断ACSFを注ぎ、小脳を完全に浸漬するのに十分である。ACSFにガス管を入れ、O2/CO2ガス混合物でバブリングを開始します。
  2. 双眼鏡の下に細かいインテザーを使用してくも膜下の母を取り除きます。小脳の歩行者を刃で切り、脳幹と寒天ブロックを取り除きます。小脳の後部がかみそり刃に直面できるように、トレイを180°回転させます。
  3. ブレードを設定し、最初の切断位置を調整します。ビブラートスライスパラメータを次のように設定します:振幅を5.5に、周波数を85 Hzに、速度を3-4に、スライスの厚さを300 μmにします。
  4. ナイロンネット上の小脳スライスをアクリルインキュベーターに移し、スライスを酸素化ACSFに完全に浸します。インキュベーターは、26 °Cで温度を維持する水浴に配置する必要があります。
  5. スライス中の損傷からの回復を可能にするために、少なくとも1時間スライスを保管してください。

4. 全セルパッチクランプ記録

注:パッチクランプ記録には、赤外線差動干渉コントラスト(IR-DIC)光学系の直立顕微鏡、パッチクランプアンプ、データデジタイザ、デジタル刺激器、アイソレータ、コンピュータ、データ集録用ソフトウェアが必要です。分析、電動マニピュレータ、顕微鏡プラットフォーム、振動絶縁テーブル、ファラデーケージ、溶液加熱システム、蠕動ポンプ、電極プーラー。

  1. ACSFにピクロトキシン(0.1 mM)を追加し、3分間超音波処理を使用して解決します。
  2. ピクロトキシン含有、O2-CO2-飽和ACSFを2mL/minの速度で記録室を透過します。
  3. 4ステップの引き出しを使用して、フィラメント(外径=1.5mm)でホウケイ酸塩ガラスキャピラリーを引っ張って記録電極を作ります。先端の直径は約1 μmでなければなりません。
  4. 2ステップで引き出し機を使用して同じ毛細血管を引っ張って刺激電極を作り、双眼顕微鏡下の鉄ブロックに対して先端を打つことによって細かい先端を作り出す。最終的な直径は3-5 μmでなければなりません。
  5. 小脳のスライスを記録室に移し、ナイロン糸でPtウェイトで固定します。ACSFで刺激電極を充填します。
  6. PFの刺激のために、刺激電極を分子層の表面に置き、Purkinje細胞層から約50μm離れたところに置く。
  7. CFの刺激のために、Purkinje細胞層の底部に刺激電極を置きます(ステップ5.3,5.4)。
  8. 0.45 μm フィルターを使用して K+ベースまたは Cs+ベースの内部ソリューションをフィルタリングします。マイクロローダーを使用して、8 μLの内部溶液で記録電極を充填します。
  9. ACSFに浸す前に、記録電極に弱い正圧を加えます。その抵抗は2-4 MΩで、液体接接電位を補正する必要があります。
  10. 記録電極でPCの健康で明るいセル本体にアプローチします。Purkinje細胞の表面をわずかに押し、正圧の適用を停止し、次にギガオームシールを形成するまで負圧を加えます。次に、負圧を使用してセル全体構成を確立します。
  11. 膜電位を-70 mVで保持し、-2 mVパルス(持続時間、100ms)を0.1 Hzで適用して、入力抵抗、直列抵抗、入力容量を連続的に監視します。シリーズ抵抗補正は使用しないでください。系列抵抗が 15% を超えるとデータを破棄します。

5. 株式会社の誘導

  1. パルス(持続時間、0.1ミリ秒)で分子層を刺激します。50ミリ秒の二重パルス刺激(インタースパイク間隔(ISI))を適用することにより、PF興奮後のシナプス電流(EPSC)を同定する。PF-EPSCは、対パルス促進と刺激強度の増加に対する振幅の徐々な増加を示すべきである。
  2. 0.1 Hz で単一のパルスを適用して PF-EPSC のテスト応答を記録します。電圧依存性イオンチャネルを通る電流の汚染を避けてください。
  3. プルキンジェ細胞層の底部でCFを刺激し、CF活性化によって引き起こされたEPSCを同定する(二重パルス刺激を加えることによって)。CF-EPSCは、刺激強度の増加に応じて、対パルスうつ病とオールまたはノーの方法を示すべきである。LTD誘導の場合は、単一の刺激を使用する必要があります。
  4. LTD誘導プロトコル1
    1. 電流クランプ条件下でK+ベースの内部溶液を含む電極を用いて、単一のPF刺激と単一のCF刺激を1Hzで同時に5分間(300パルス)(図1A)に適用する。
  5. LTD誘導プロトコル2
    1. 電流クランプ条件下で電極含有K+ベースの内部溶液を用いて、2番目のPF刺激が1Hzで5分間CF刺激と一致するように二重PF刺激(50msのISI)と単一のCF刺激を適用する(図1B)。
  6. LTD誘導プロトコル 3
    1. 電圧クランプ条件下でCs+ベースの内部溶液を含む電極を使用して、二重PF刺激(50msのISI)と単一の脱分極電圧ステップ(-70〜0mV、50ms)を1Hzでソマに3分間塗布し、第2のPF刺激が可能になります。脱分極電圧ステップの始まりに相当します(図1C)。
  7. LTD誘導プロトコル-4
    1. 電圧クランプ条件下でCs+ベースの内部溶液を含む電極を使用して、PF刺激(100Hzで5x)と単一の脱分極電圧ステップ(-70~0 mV、50ms)を3分間0.5Hzでソマに同時に適用します(図1D)).

結果

本研究では4つのプロトコルを用い、小脳を誘導した。最初の2つのプロトコル(プロトコル1および2)では、PF刺激とCF刺激の結合が電流クランプ条件下で適用された。他の2つのプロトコル(プロトコル3および4)では、体性脱分極は電圧クランプ条件下でCF刺激に置き換えられた。結膜刺激時の電圧トレースまたは電流トレースを比較した(図2)。

現在のク...

ディスカッション

4つのプロトコル間の違い

LTD誘導プロトコル1および2において、Cjs 300回を1Hzで誘導するのに十分であり、CFの刺激頻度は生理学的範囲にあるように見えたが、アラート成人マウスにおける複雑なスパイク発射速度(P60)は1.25Hz36であることが報告された。しかしながら、CF刺激だけではPF-CFシナプスにおいて長期可塑性を引き起こさなかったが、プロトコル1お?...

開示事項

著者は何も開示していない。

謝辞

私たちは、A.オバの技術援助に感謝します。この研究は、科学研究のための助成金(C)17K01982からK.Y.に部分的に支援されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
AmplifierMolecular Devices-AxonMulticlamp 700B
Borosilicate glass capillarySutterBF150-110-10
DigitizerMolecular Devices-AxonDigidata1322A
Electrode pullerSutterModel P-97
IsofluraneFUJIFILM Wako Pure Chemical26675-46-7
IsolatorA.M.P.I.ISOflex
Linear slicerDosaka EMPRO7N
MicroscopeNIKONEclipse E600FN
Peristaltic pumpGilsonMP1 Single Channel Pump
PicrotoxinSigma-AldrichP1675
Pure water makerMerck-MilliporeMilliQ 7000
Software for experimentMolecular probe-AxonpClamp 10
Software for statisticsKyensLabKyPlot 5.0
StimulatorWPIDS8000
Temperature controllerWarnerTC-324B
TetrodotoxinTocris1078

参考文献

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