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  • Discusión
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  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

En algunos animales manipulados por genes, el uso de un solo protocolo puede no inducir LTD en células de Purkinje cerebelosas, y puede haber una discrepancia entre LTD y el aprendizaje motor. Se utilizan varios protocolos para evaluar la inducción LTD en animales manipulados genéticamente. Se muestran los protocolos estándar.

Resumen

La plasticidad sináptica proporciona un mecanismo para el aprendizaje y la memoria. Para el aprendizaje motor cerebeloso, la depresión a largo plazo (LTD) de las transmisiones sinápticas de fibras paralelas (PF) a células Purkinje (PC) se considera la base para el aprendizaje motor, y las deficiencias de LTD y el aprendizaje motor se observan en varios animales manipulados por genes genéticos. Se utilizaron conjuntos comunes de aprendizaje motor, como la adaptación del reflejo optocinético (OKR), el reflejo vestibular-ocular (VOR) y la prueba de rotarod para evaluar la capacidad de aprendizaje motor. Sin embargo, los resultados obtenidos de los ratones knock-in modificados de GluA2-carboxy demostraron una adaptación normal del VOR y el OKR, a pesar de la falta de PF-LTD. En ese informe, la inducción de LTD sólo se intentó utilizar un tipo de protocolo de estimulación a temperatura ambiente. Por lo tanto, las condiciones para inducir a LTD cerebeloso fueron exploradas en los mismos mutantes knock-in usando varios protocolos a temperatura casi fisiológica. Finalmente, encontramos protocolos de estimulación, por los cuales LTD podría ser inducido en estos ratones manipulados genéticamente. En este estudio, se propone un conjunto de protocolos para evaluar la inducción LTD, que permitirá con mayor precisión el examen de la relación causal entre LTD y el aprendizaje motor. En conclusión, las condiciones experimentales son cruciales a la hora de evaluar LTD en ratones manipulados por genes.

Introducción

La organización sináptica de las redes neuronales elaboradas de la corteza cerebelosa, compuesta por PC, interneuronas de capa molecular (células de cesta y células estelares), células Golgi, PFs de células gráulas, fibras musgosas y fibras de escalada (CF), se han aclarado en términos de excitación/inhibición y divergencia/convergencia, y el diagrama de circuitos bien organizados ha sugerido que el cerebelo es una "máquina neuronal"1, aunque anteriormente no había idea sobre el propósito de esta "máquina". Más tarde Marr propuso que la entrada de PFs a los PC constituya una red de aprendizaje asociativo de triple capa2. También sugirió que cada CF transmitiera una instrucción cerebral para el movimiento elemental2. Asumió que la activación simultánea de los PF y el CF mejoraría la actividad de la sinapsis PF-PC y causaría la potenciación a largo plazo (LTP) de la sinapsis PF-PC. Por otro lado, Albus asumió que la activación síncrona de los PF y CF dio lugar a LTD en las sinapsis PF-PC3. Ambos estudios anteriores interpretan el cerebelo como un dispositivo de memoria único, la incorporación de los cuales en la red cortical cerebelosa conduce a la formación del modelo de máquina de aprendizaje Marr-Albus.

Después de estas predicciones teóricas, dos líneas de evidencia sugieren la presencia de plasticidad sináptica en el cerebelo. La primera línea de evidencia fue sugerida por la organización anatómica del floculus; aquí las vías MF de origen orgánico vestibular y las vías CF de origen retiniano convergen en los PC4. Este patrón de convergencia único sugiere que una plasticidad sináptica que ocurre en el floculus causa la notable adaptabilidad del reflejo vestibulo-ocular. En segundo lugar, el registro de la respuesta de los PC en el floculus y la lesión del floculus también apoyó la hipótesis anterior5,6,7. Además, el patrón de descarga de PC durante la adaptación del movimiento de la mano de un mono8 apoyó la hipótesis de plasticidad sináptica, especialmente la hipótesis LTD de Albus3.

Para determinar la naturaleza de la plasticidad sináptica directamente, se demostró que la estimulación conjuntiva repetida (Cjs) de un haz de Pf sFs y el CF que inerva específicamente el PC in vivo induce a LTD para la eficacia de transmisión de las sinapsis PF-PC9, 10,11. En las exploraciones in vitro posteriores utilizando una rebanada cerebelosa12 y PC cultivadas, la conjunción de estimulación de células de gránulos cocultivadas y estimulación de células de olivo13 o la conjunción de glutamato aplicado iontoforéticamente y somático despolarización14,15 causó LTD. El mecanismo de transducción de señales subyacente a la inducción LTD también se investigó intensivamente utilizando los preparados in vitro16,17.

Las adaptaciones del VOR y el OKR se utilizaron a menudo para la evaluación cuantitativa de los efectos de manipulación genética en el aprendizaje motor cerebeloso, porque se demostró que la corteza de vestibulo-cerebelosa era el origen esencial en el aprendizaje adaptativo del VOR18 ,19,20 y el OKR19,21 La correlación entre el fracaso de la inducción LTD y el deterioro del aprendizaje motor conductual se ha tomado como evidencia de que LTD desempeña un papel esencial en el motor mecanismos de aprendizaje22. Estas vistas se conocen colectivamente como la hipótesis LTD del aprendizaje motor, o la hipótesis De Marr-Albus-Ito23,24,25,26.

El aprendizaje adaptativo del movimiento ocular se midió utilizando protocolos similares, mientras que se utilizaron varias condiciones experimentales para inducir LTD en la preparación de rodajas27,28,29,30,31 . Recientemente, Schonewille y otros26 informaron que algunos ratones manipulados genéticamente demostraron un aprendizaje motor normal, pero las rodajas cerebelosas no mostraron LTD, y por lo que concluyeron que LTD no era esencial para el aprendizaje motor. Sin embargo, la inducción de LTD sólo se intentó utilizar un tipo de protocolo a temperatura ambiente. Por lo tanto, utilizamos varios tipos de protocolos inducidores de LTD en condiciones de registro a alrededor de 30 oC, y confirmamos que el LTD fue inducido de forma fiable en los ratones manipulados por genes mediante el uso de estos protocolos a temperaturas casi fisiológicas32.

Sin embargo, quedan algunas preguntas con respecto a las propiedades básicas de la estimulación conjuntiva. La primera es la relación entre la forma del pico complejo y la amplitud de LTD. En segundo lugar, junto con la estimulación de la PF y la despolarización somática, si el número de estímulos utilizados era necesario o no era esquiva. En el presente estudio, estas preguntas se investigaron utilizando ratones de tipo salvaje (WT).

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el comité de RIKEN sobre el cuidado y uso de animales en experimentos. Los ratones fueron mantenidos en las instalaciones animales del Centro RIKEN para la Ciencia del Cerebro bajo una temperatura bien controlada (23-25 oC) y humedad (45%–65%) Condiciones. Se utilizaron ratones WT masculinos y femeninos (C57BL/6, 3-6 meses).

1. Preparación de soluciones utilizadas en los experimentos

NOTA: Todas las soluciones deben hacerse en agua ultrapura libre de metales (resistividad > 18,2 M) y otras impurezas (carbono orgánico total (TOC) < 5,0 ppb). El trabajo de líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) para cortar y grabar en rodajas se hace recién en el día del experimento a partir de un stock de ACSF 10 veces (x10). Burbuja las soluciones con 5% CO2/ 95% O2 mezcla de gas antes de su uso. El pH de ACSF se ajusta a 7,4 x 0,1, y la osmolaridad se ajusta 315 a 5 mOsm/kg añadiendo agua ultrapura.

  1. Preparar 10x stock de ACSF que contenga 1250 mM NaCl, 30 mM KCl, 12,5 mM NaH2PO4y 260 mM NaHCO3. Esta solución se puede almacenar a 4 oC.
  2. Preparar el trabajo ACSF que contiene 125 mM NaCl, 3 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM Mg2SO4, 1.25 mM NaH2PO4, 26 mM NaHCO3 y 20 mM glucosa.
    1. En primer lugar, añadir 1 ml de 2 M CaCl2 solución seguida de 1 mL de 1 M Mg2SO4 solución en alrededor de 800 mL de agua ultrapura, para evitar la precipitación. A continuación, añadir 100 mL de 10x ACSF y glucosa. Por último, conforma hasta un volumen total de 1.000 ml añadiendo agua ultrapura.
  3. Prepare un 3,3% de agar para el manejo del cerebro. Disolver 1 g de agar en 30 ml de solución de NaCl al 0,9% y calentar en un microondas hasta que hierva. Revuelva para mezclar, luego vierta en una caja de plástico estéril de 4 cm x 10 cm y deje solidificar. Almacene la placa de agar(de 8mm de espesor) en un refrigerador.
  4. Prepare la solución interna.
    1. Preparar la solución interna basada en K+que contiene 60 mM de KCl, 60 mM de K-gluconato, 0,3 mM EGTA, 4 mM MgCl2,4 mM ATP, 0,4 mM GTP y 30 mM HEPES (pH 7,2).
      NOTA: Baja concentración (0,3 mM) de EGTA, un lento Ca2+-quelator, se añade al quelato posiblemente contaminado Ca2+ en agua pura, pero esta baja concentración de EGTA en la solución interna nunca bloquea la inducción de LTD (Figura 3, Figura 4, Figura 5) durante la grabación de toda la célula. La presión osmótica medida es de 285 mOsm/kg.
    2. Preparar la solución interna Cs+-based que contiene 60 mM CsCl, 46 mM de Gluconato D, 27 mM de cloruro de tetraetilammonio (TEA-Cl), 0,3 mM EGTA, 4 mM MgCl2,4 mM de ATP, 0,4 mM GTP y 30 mM HEPES (pH 7.2 ajustado).
      NOTA: Cs+ bloquea los canales K dependientes del voltaje y mejora las condiciones de la abrazadera de espacio en las dendritas remotas al aumentar la longitud constante. La presión osmótica medida es de 285 mOsm/kg.
    3. Preparar alícuotas de 200 l de las soluciones y almacenarlas a -30 oC.

2. Disección y recorte cerebral

  1. Enfríe y oxigene dos vasos de 50 ml de ACSF sobre hielo hasta que la temperatura sea inferior a 4 oC. Añadir 50 ml de tetrodotoxina (TTX, 1 mM) en uno de los vasos helados de ACSF y reservarlo para el corte en rodajas. Para obtener la capacidad de reserva de la rebanada cerebelosa del ratón LTD, es necesaria la adición de TTX al ACSF normal.
  2. Enfríe la bandeja de muestras de metal llenando un área de baño de hielo de la cámara de corte con hielo.
  3. Vierta 1 ml de isoflurano en un frasco de anestesia(1000ml) y, a continuación, coloque un ratón en él durante 30-45 s. Asegúrese de que el ratón esté profundamente anestesiado confirmando su incapacidad para responder a la estimulación mecánica.
  4. Decapita el ratón con tijeras quirúrgicas. Sostenga la cabeza y corte la piel superficial a lo largo de la línea media con una tijera oftalmológica. Tire de la piel sosteniendo con los dedos para exponer ampliamente la superficie del cráneo.
  5. Corta el cráneo horizontalmente a lo largo de una línea desde el agujero espinocerebeloso principal justo por encima de la oreja y el ojo usando una tijera oftalmológica. Corta el cráneo a lo largo de una línea por encima de ambos ojos y retíralo para aislar el cráneo.
  6. Cortar el cerebro en el centro del cerebro mediante el uso de un bisturí, a continuación, aislar la parte caudal del cerebro incluyendo el cerebelo del cráneo. Sumérgelo en un vaso helado de ACSF. Por lo general, el tiempo total desde la decapitación hasta la inmersión del cerebro bloquea en el vaso de precipitados pre-enfriado de ACSF debe ser inferior a 60 s.
  7. La posición del tubo burbujeante debe ajustarse para no agitar el bloqueo cerebral en el vaso de precipitados. El daño mecánico puede causar hinchazón de la rebanada durante la grabación. Déjalo durante al menos 7 minutos y deja que el cerebro se enfríe.
  8. Para recortar el bloque cerebral, corte una pieza de agar rectangular (2 cm x 2 cm) de una placa de agar grande (4 cm x 10 cm, almacenada a 4 oC) y colóquela en un papel de filtro para absorber el exceso de líquido.
  9. Gire la pieza de agar boca abajo sobre el papel del filtro y, a continuación, coloque la pieza de agar en un papel de filtro en una bandeja de muestras de metal preenfriado (16 cm x 20 cm). Recoge el bloqueo cerebral usando una espátula y absorbe el líquido excesivo a su alrededor con un pedazo de papel de filtro.
  10. Monte el bloque cerebral en el bloque de agar usando pegamento (adhesivo instantáneo de cianoacrilato médico). Asegúrese de fijar la parte inferior (lado ventral) del bloque cerebral al agar.
  11. Corta el hemisferio derecho con una cuchilla. Asegúrese de que el lado del plano de corte es lo más paralelo posible al plano dendrítico del PC porque este lado está unido a la superficie de la bandeja de muestras. Cortar y quitar el otro lado del hemisferio. Luego, corta el cerebro entre el colículo superior e inferior, y corta la médula espinal.
  12. Pegue el lado derecho del cerebelo recortado con el bloque de agar en la bandeja de muestras preenfriada. Esparce el exceso de pegamento alrededor del cerebelo con la parte plana de una espátula, para evitar que el exceso de pegamento se adhiera a la superficie cerebelosa. Incline la bandeja de metal y vierta ACSF para fijar el pegamento y lavar el exceso de pegamento.

3. Corte cerebral

  1. Orientar la muestra de tal forma que el lado dorsal del cerebelo esté en el lado frontal. Vierta el corte en frío ACSF, que contiene 1 TTX, suficiente para sumergir completamente el cerebelo. Coloque un tubo de gas en el ACSF y comience a burbujear con la mezcla de gas O2/CO2.
  2. Retire el mater aracnoides usando una pinza fina debajo de los prismáticos. Corta el pedúnculo cerebeloso con una cuchilla, y retira el tronco encefálico y el bloque de agar. Gire la bandeja 180o, de modo que la superficie dorsal del cerebelo se enfrente a una cuchilla de afeitar.
  3. Ajuste la hoja y ajuste la primera ubicación de corte. Establezca los parámetros de corte del vibratomo en lo siguiente: amplitud a 5.5, frecuencia a 85 Hz, velocidad a 3-4 y espesor de la rebanada a 300 m.
  4. Transfiera la rebanada cerebelosa en una red de nylon en una incubadora de acrílico y sumerja la rebanada completamente en el ACSF oxigenado. La incubadora debe colocarse en un baño de agua que mantenga una temperatura a 26oC.
  5. Almacene las rodajas durante al menos 1 h para permitir la recuperación del daño durante el corte.

4. Grabación de abrazadera de parche de celda completa

NOTA: Una grabación de abrazadera de parche requiere el siguiente equipo: un microscopio vertical con óptica de contraste de interferencia diferencial infrarroja (IR-DIC), un amplificador de abrazadera de parche, digitalizador de datos, estimulador digital, isolator, computadora, software para la adquisición de datos y análisis, manipulador motorizado, plataforma de microscopio, mesa de aislamiento de vibración, jaula Faraday, sistema de calentamiento de solución, bombas peristálticas y tirador de electrodos.

  1. Añadir picrotoxina (0,1 mM) a ACSF y resolverlo usando ultra-sonicación durante 3 min.
  2. Perfundie una cámara de grabación con picrotoxina que contenga, O2-CO2-saturado ACSF a una velocidad de 2 mL/min. Mantenga la temperatura de la cámara de grabación a unos 30 oC.
  3. Haga un electrodo de grabación tirando de un capilar de vidrio borosilicato con filamento (diámetro exterior de 1,5 mm) utilizando un tirador con 4 pasos. El diámetro de la punta debe ser de alrededor de 1 m.
  4. Hacer un electrodo estimulante tirando del mismo capilar usando el tirador con 2 pasos, a continuación, romper para producir una punta fina golpeando la punta contra un bloque de hierro bajo un microscopio binocular. El diámetro final debe ser de 3 a 5 m.
  5. Transfiera la rebanada cerebelosa a la cámara de grabación y fíjela con un peso Pt con hilos de nylon. Llene un electrodo estimulante con ACSF.
  6. Para la estimulación de los FP, coloque el electrodo estimulante en la superficie de la capa molecular, a unos 50 m de distancia de la capa celular de Purkinje.
  7. Para la estimulación del CF, coloque el electrodo estimulante en la parte inferior de la capa celular de Purkinje (pasos 5.3, 5.4).
  8. Solución interna basada en K+o Cs+con un filtro de 0,45 m. Utilice un microcargador para llenar un electrodo de grabación con 8 súbditos de solución interna.
  9. Aplique una presión positiva débil al electrodo de grabación antes de sumergirlo en el ACSF. Su resistencia debe ser de 2-4 M y el potencial de unión líquida debe ser corregido.
  10. Acérquese al cuerpo celular sano y brillante del PC con el electrodo de grabación. Empuje ligeramente la superficie de la célula de Purkinje, deje de aplicar presión positiva, luego aplique presión negativa hasta formar un sello giga-ohm. A continuación, establezca la configuración de toda la célula utilizando la presión negativa.
  11. Sostenga el potencial de membrana a -70 mV y aplique un pulso de -2 mV (duración, 100 ms) a 0,1 Hz para monitorizar continuamente la resistencia de entrada, la resistencia en serie y la capacitancia de entrada. No utilice la compensación de resistencia en serie. Descarte los datos cuando la resistencia de la serie varía en más del 15%.

5. Inducción de LTD

  1. Estimular la capa molecular con un pulso (duración, 0,1 ms). Identificar las corrientes postsinápticas excitatorias PF (EPSC) aplicando un estímulo de pulso doble (intervalo de interspike (ISI) de 50 ms). El PF-EPSC debe mostrar una facilitación de pulsos emparejados y un aumento gradual de la amplitud en relación con el aumento de la intensidad de estimulación.
  2. Registre la respuesta de prueba del PF-EPSC aplicando un solo pulso a 0,1 Hz. Ajuste la intensidad del estímulo para que la amplitud EPSC evocada sea alrededor de 200 pA. Evite la contaminación de la corriente a través del canal iónico dependiente del voltaje.
  3. Estimular el CF en la parte inferior de la capa celular Purkinje, e identificar el EPSC provocado por la activación CF (mediante la aplicación de un estímulo de doble pulso). El CF-EPSC debe mostrar depresión por pulso emparejado y una manera todo o ninguno de acuerdo con el aumento en la intensidad de la estimulación. Para la inducción LTD, se debe utilizar un solo estímulo.
  4. Protocolo inductor de LTD 1
    1. Utilizando un electrodo que contenga una solución interna basada en K+en condiciones de abrazadera de corriente, aplique un único estímulo PF y un solo cf-estímulo simultáneamente a 1 Hz durante 5 min (300 pulsos)(Figura 1A).
  5. Protocolo inductor de LTD 2
    1. Utilizando una solución interna basada en K+que contiene electrodos en condiciones de abrazadera de corriente, aplique doble PF-stimuli (ISI de 50 ms) y estímulo único de CF, ya que el segundo estímulo de PF es coincidente con CF-stimuli a 1 Hz durante 5 min(Figura 1B).
  6. Protocolo inductor de LTD 3
    1. Usando un electrodo que contiene Cs+-solución interna basada en bajo condiciones de abrazadera de voltaje, aplique un doble PF-estímulo (ISI de 50 ms) y un solo paso de voltaje despolarizante (-70 a 0 mV, 50 ms) al soma a 1 Hz durante 3 min, de modo que el segundo PF-estímulo es equivalente al comienzo del paso de tensión de despolarizante(Figura 1C).
  7. Protocolo inductor de LTD-4
    1. Usando un electrodo que contenga Cs+-based solución interna bajo condiciones de abrazadera de voltaje, aplique el PF-stimuli (5x a 100 Hz) y un solo paso de voltaje despolarizante (-70 a 0 mV, 50 ms) al soma a 0.5 Hz durante 3 min, simultáneamente(Figura 1D1D ).

Resultados

En este estudio se utilizaron cuatro protocolos para inducir a LTD cerebeloso. En los dos primeros protocolos (protocolo 1 y 2), la conjunción de la estimulación PF y la estimulación CF se aplicó en condiciones de abrazadera de corriente. En los otros dos protocolos (protocolo 3 y 4), la despolarización somática se sustituyó por la estimulación CF en condiciones de abrazadera de tensión. Se compararon los rastros de tensión o de corriente durante la estimulación coyuntura (Figura 2

Discusión

Diferencias entre los cuatro protocolos

En los protocolos de inducción LTD 1 y 2, Cjs 300 veces a 1 Hz es suficiente para inducir la frecuencia de estimulación cerebelosa LTD. Sin embargo, la estimulación CF por sí sola no causó plasticidad a largo plazo en la sinapsis PF-CF, tal como se utiliza en los protocolos 1 y 2(Figura 4, Figura 5), aunque la estimulación CF sola a mayor frecuencia inducida LTD

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a A. Oba por su asistencia técnica. Esta investigación fue parcialmente apoyada por Grant-in-Aid for Scientific Research (C) 17K01982 a K.Y.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
AmplifierMolecular Devices-AxonMulticlamp 700B
Borosilicate glass capillarySutterBF150-110-10
DigitizerMolecular Devices-AxonDigidata1322A
Electrode pullerSutterModel P-97
IsofluraneFUJIFILM Wako Pure Chemical26675-46-7
IsolatorA.M.P.I.ISOflex
Linear slicerDosaka EMPRO7N
MicroscopeNIKONEclipse E600FN
Peristaltic pumpGilsonMP1 Single Channel Pump
PicrotoxinSigma-AldrichP1675
Pure water makerMerck-MilliporeMilliQ 7000
Software for experimentMolecular probe-AxonpClamp 10
Software for statisticsKyensLabKyPlot 5.0
StimulatorWPIDS8000
Temperature controllerWarnerTC-324B
TetrodotoxinTocris1078

Referencias

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