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Resumo

Em alguns animais gene-manipulados, usar um único protocolo pode não induzir o LTD em pilhas Cerebelares de Purkinje, e pode haver uma discrepância entre o LTD e a aprendizagem do motor. Os protocolos múltiplos são necessários avaliar a LTD-indução em animais gene-manipulados. Os protocolos padrão são mostrados.

Resumo

A plasticidade sináptica fornece um mecanismo de aprendizado e memória. Para a aprendizagem do motor cerebelar, a depressão a longo prazo (Ltd) de transmissões sináptica das fibras paralelas (PF) às pilhas de Purkinje (PC) é considerada a base para a aprendizagem do motor, e as deficiências do Ltd e da aprendizagem do motor são observadas em vários animais manipulados por genes. Conjuntos de aprendizagem motora comum, como a adaptação do reflexo optocinético (okr), o reflexo vestibular-ocular (VOR) e o teste de do foram utilizados para avaliação da capacidade de aprendizagem motora. Entretanto, os resultados obtidos dos camundongos Knock-in modificados no término do GluA2-carboxy demonstraram a adaptação normal do VOR e do OKR, apesar da falta de PF-LTD. Nesse relatório, a indução do LTD foi tentada somente usando um tipo de protocolo da estimulação na temperatura ambiente. Assim, as condições para induzir o LTD cerebelar foram exploradas nos mesmos mutantes do Knock-in que usam vários protocolos na temperatura fisiológica próxima. Finalmente, nós encontramos protocolos da estimulação, por que LTD poderia ser induzida nestes ratos gene-manipulados. Neste estudo, um conjunto de protocolos é proposto para avaliar a indução de LTD, o que permitirá um exame mais preciso da relação causal entre o LTD e a aprendizagem motora. Em conclusão, as condições experimentais são cruciais na avaliação de LTD em camundongos manipulados por genes.

Introdução

A organização sináptica das redes neuronais elaboradas do córtex cerebelar, composta por PCs, interneurônios de camada molecular (cesta e células esteladas), células de Golgi, PFs de células de grânulos, fibras Mossy e fibras de escalada (CFs), foram elucidados em termos de excitação/inibição e divergência/convergência, e o diagrama de circuitos bem organizados sugeriu que o cerebelo é uma "máquina neuronal"1, embora não houvesse anteriormente nenhuma idéia sobre a finalidade desta "máquina". Posteriormente, a Marr propôs que a entrada de PFs em PCs constitua uma rede de aprendizagem associativa de camada tripla2. Ele também sugeriu que cada CF transmite uma instrução cerebral para o movimento elementar2. Ele assumiu que a ativação simultânea de PFs e CF melhoraria a atividade da sinapse PF-PC, e causava potenciação a longo prazo (LTP) da sinapse PF-PC. Por outro lado, a Albus assumiu que a ativação síncrona de PFs e CF resultou em LTD nas sinapses PF-PC3. Ambos os estudos acima interpretam o cerebelo como um dispositivo original da memória, a incorporação de que na rede cortical cerebelar conduz à formação do modelo da máquina da aprendizagem do modelo de Marr-Albus.

Seguindo estas predições teóricas, duas linhas de evidência sugerem a presença de plasticidade sináptica no cerebelo. A primeira linha de evidência foi sugerida pela organização anatômica do floculus; aqui as vias MF de origem de órgãos vestibulares e vias CF de origem retiniana convergem nos PCs4. Este teste padrão original da convergência sugere que uma plasticidade sináptica que ocorre no flocculus cause a adaptação notável do reflexo vestíbulo-ocular. Segundo, a gravação da resposta dos PCs no floculado e o lesioning do floculus também apoiaram a hipótese acima de5,6,7. Além disso, o padrão de descarga do PC durante a adaptação do movimento da mão de um macaco8 apoiou a hipótese da plasticidade sináptica, especialmente a hipótese de Albus Ltd-3.

Para determinar a natureza da plasticidade sináptica diretamente, a estimulação conjuntivo repetida (CJS) de um pacote de PFS e o CF que inervam especificamente o PC in vivo foi mostrado para induzir o Ltd para a eficácia da transmissão do PF-PC sinapses9, 10,11. Nas explorações subseqüentes in vitro usando uma fatia cerebelar12 e PCes cultivados, a conjunção da estimulação cocultivada da pilha do grânulo e da estimulação da pilha verde-oliva13 ou a conjunção do glutamato após aplicado e somático despolarização14,15causou Ltd . O mecanismo de transdução de sinal subjacente à indução Ltd também foi intensivamente investigado por meio de preparações in vitro16,17.

As adaptações do VOR e do OKR foram usadas frequentemente para a avaliação quantitativa de efeitos da gene-manipulação na aprendizagem do motor cerebelar, porque o córtice vestibule-cerebelar foi provado ser a origem essencial na aprendizagem adaptativa do VOR18 ,19,20 e o okr19,21 a correlação entre a falha da indução do Ltd e o prejuízo da aprendizagem motora comportamental foi tomada como a evidência que Ltd desempenha um papel essencial no motor mecanismos de aprendizagem22. Essas visões são coletivamente referidas como a hipótese de Ltd de aprendizagem motora, ou hipótese de Marr-Albus-Ito23,24,25,26.

A aprendizagem adaptativa do movimento ocular foi mensurada por protocolos semelhantes, enquanto várias condições experimentais foram utilizadas para induzir o Ltd na preparação da fatia27,28,29,30,31 . Recentemente, Schonewille et al.26 relataram que alguns camundongos manipulados por genes demonstraram aprendizagem motora normal, mas as fatias Cerebelares não mostraram o Ltd e, assim, concluíram que a Ltd não era essencial para a aprendizagem motora. Entretanto, a indução de LTD foi tentada somente usando um tipo de protocolo na temperatura ambiente. Daqui, nós usamos diversos tipos de protocolos LTD-induzindo condições da gravação em torno de 30 ° c, e nós confirmamos que o LTD estêve induzido confiantemente nos ratos gene-manipulados usando estes protocolos em temperaturas physiological próximas32.

No entanto, permanecem algumas questões sobre as propriedades básicas da estimulação conjuntiva. O primeiro é a relação entre a forma do pico complexo e a amplitude de LTD. Em segundo lugar, em conjunto com a PF-estimulação e a despolarização somática, se o número de estímulos utilizados era necessário ou não era elusivo. No presente estudo, essas questões foram investigadas com camundongos tipo Wild (WT).

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Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê RIKEN sobre o cuidado e uso de animais em experimentos. Os camundongos foram mantidos na instalação animal do centro de RIKEN para a ciência do cérebro temperatura bem controlada (23 – 25 ° c) e umidade (45% – 65%) Condições. Foram utilizados camundongos do peso masculino e feminino (C57BL/6, 3 – 6 meses).

1. preparação de soluções utilizadas nos experimentos

Nota: Todas as soluções devem ser feitas em água ultrapura livre de metais (resistividade > 18,2 MΩ) e outras impurezas (carbono orgânico total (TOC) < 5,0 ppb). O líquido cerebrospinal artificial de trabalho (ACSF) para cortar-corte e a gravação são feitos recentemente no dia da experiência de um estoque de 10 vezes (X10) de ACSF. Bubble as soluções com 5% CO2/95% o2 gás mistura antes de usar. O pH do ACSF é ajustado para 7,4 ± 0,1, e a osmolaridade é ajustada 315 ± 5 mOsm/kg adicionando água ultrapura.

  1. Prepare o estoque 10x de ACSF contendo 1250 mM de NaCl, 30 mM KCl, 12,5 mM NaH2po4e 260 mm NaHCO3. Esta solução pode ser armazenada a 4 ° c.
  2. Prepare o trabalho ACSF contendo 125 mM NaCl, 3 mM KCl, 2 mM CaCl1,2mm mg2so4, 1,25 mm NaH2po4, 26 mm NaHCO3 e 20 mm glicose.
    1. Em primeiro lugar, adicionar 1 mL de 2 M CaCl2 solução seguida de 1 ml de 1 m mg2so4 solução em torno de 800 ml de água ultrapura, para evitar a precipitação. Em seguida, adicione 100 mL de 10x ACSF e glicose. Finalmente, compo a um volume total de 1.000 ml adicionando a água ultrapura.
  3. Prepare 3,3% de agar para manuseio cerebral. Dissolva 1 g de agar em 30 mL de solução de NaCl a 0,9% e aqueça-o num microondas até ferver. Mexa para misturar, em seguida, despeje-o em uma caixa de plástico estéril de 4 cm x 10 cm e deixe solidificar. Guarde a placa de agar (~8 mm de espessura) num frigorífico.
  4. Prepare a solução interna.
    1. Prepare a solução interna baseada em K+contendo 60 mm kcl, 60 mm k-gluconato, 0,3 mm EGTA, 4 mm MgCl2, 4 mM ATP, 0,4 mm GTP e 30 mm hepes (pH 7,2).
      Nota: Baixa concentração (0,3 mM) de EGTA, um lento CA2 +-chelator, é adicionado ao quelato possivelmente contaminado CA2 + em água pura, mas esta baixa concentração de EGTA na solução interna nunca bloqueia a indução de Ltd (Figura 3, Figura 4, Figura 5) durante a gravação de células inteiras. A pressão osmótica medida é 285 mOsm/kg.
    2. Prepare a solução interna baseada em cs+contendo 60 mm de cscl, 46 mm D-gluconato, cloreto de tetraetilamónio de 27 mm (Tea-CL), 0,3 mm EGTA, 4 mm MgCl2, 4 mM ATP, 0,4 mm GTP e 30 mm hepes (pH 7,2, ajustado usando CsOH).
      Nota: Cs+ bloqueia os canais K dependentes de tensão e melhora as condições de fixação do espaço em dendritos remotos, aumentando o comprimento-constante. A pressão osmótica medida é 285 mOsm/kg.
    3. Prepare 200 μL de alíquotas das soluções e armazene a-30 ° c.

2. dissecção e corte cerebral

  1. Chill e oxigenar 2 50 mL copos de ACSF no gelo até que a temperatura é menor do que 4 ° c. Adicionar 50 μL de tetrodotoxina (TTX, 1 mM) em um dos copos gelados de ACSF e reservá-lo para corte de fatias. Para obter a fatia cerebelar do rato reservando a habilidade indutora de LTD, a adição de TTX ao ACSF normal é necessária.
  2. Resfriar a bandeja de amostra de metal preenchendo uma área de banho de gelo da câmara de corte com gelo.
  3. Despeje 1 mL de isoflurano em um frasco de anestesia (~1000 ml), em seguida, coloque um mouse nele por 30 – 45 s. Certifique-se de que o rato está profundamente anestesiado confirmando a sua incapacidade de responder à estimulação mecânica.
  4. Decapitar o rato usando tesouras cirúrgicas. Segure a cabeça e corte a pele superficial ao longo da linha média usando uma tesoura oftalmológica. Puxe a pele segurando com os dedos para expor amplamente a superfície do crânio.
  5. Corte o crânio horizontalmente ao longo de uma linha do furo spinocerebellar principal apenas acima da orelha e do olho usando uma tesoura oftalmológico. Corte o crânio ao longo de uma linha acima dos dois olhos e retire para isolar o crânio.
  6. Corte o cérebro no meio do encéfalo usando um bisturi, em seguida, isolar a parte caudal do cérebro, incluindo o cerebelo do crânio. Mergulhe-o em uma taça gelada de ACSF. Geralmente, o tempo total da decapitação à imersão do bloco do cérebro na Taça pre-refrigerada de ACSF deve ser menos do que 60 s.
  7. A posição da tubulação de borbulhagem deve ser ajustada de modo a para não agitar o bloco do cérebro no béquer. Danos mecânicos podem causar inchaço da fatia durante a gravação. Deixe-o por pelo menos 7 min e deixe o cérebro esfriar.
  8. Para aparar o bloco cerebral, corte uma peça de agar retangular (2 cm x 2 cm) de uma grande placa de agar (4 cm x 10 cm, armazenada a 4 ° c) e coloque-a em um papel de filtro para absorver o excesso de líquido.
  9. Gire a parte de agar de cabeça para baixo no papel de filtro e coloque a peça de agar em um papel de filtro em uma bandeja de amostra de metal pré-refrigerada (16 cm x 20 cm). Pegar o bloco de cérebro usando uma espátula e absorver o líquido excessivo em torno dele com um pedaço de papel de filtro.
  10. Monte o bloco do cérebro no bloco do agar usando a colagem (adesivo imediato do cianoacrilato médico). Certifique-se de anexar o fundo (lado ventral) do bloco cerebral para o agar.
  11. Corte o hemisfério direito com uma lâmina. Certifique-se de que o lado do plano de corte seja o mais paralelo possível ao plano dendrítico do PC, pois este lado está anexado à superfície da bandeja de amostra. Corte e retire o outro lado do hemisfério. Em seguida, cortar o cérebro entre o colliculi superior e inferior, e cortar a medula espinhal.
  12. Cole o lado direito do cerebelo cortado com o bloco de agar na bandeja de amostra pré-refrigerada. Espalhe o excesso de cola em torno do cerebelo com a parte plana de uma espátula, para evitar o excesso de cola de anexar à superfície cerebelar. Incline a bandeja de metal e despeje ACSF a fim de fixar a cola e lavar o excesso de cola.

3. corte cerebral

  1. Orientar a amostra de tal forma que o lado dorsal do cerebelo está na parte da frente. Despeje o corte gelo-frio ACSF, contendo 1 μM TTX, suficiente para mergulhar o cerebelo completamente. Coloque um tubo de gás no ACSF e comece a borbulhar com O2/co2 mistura de gás.
  2. Remova o Mater do do arachnoid usando um pinça fino binóculos. Corte o pedúnculo cerebelar com uma lâmina, e remova o tronco cerebral e o bloco de agar. Gire a bandeja 180 °, de modo que a superfície dorsal do cerebelo enfrenta um Razorblade.
  3. Defina a lâmina e ajuste o primeiro local de corte. Defina os parâmetros de corte do do para o seguinte: amplitude para 5,5, frequência para 85 Hz, velocidade para 3 – 4 e espessura de fatia para 300 μm.
  4. Transfira a fatia cerebelar em uma nylon-rede em uma incubadora acrílica e mergulhe a fatia completamente no ACSF oxigenado. A incubadora deve ser coloc em um água-banho que mantenha uma temperatura em 26 ° c.
  5. Armazene as fatias por pelo menos 1 h para permitir a recuperação do dano durante a fatiagem.

4. gravação da remendo-braçadeira da inteiro-pilha

Nota: Uma gravação da remendo-braçadeira exige o seguinte equipamento: um microscópio ereto com óptica infravermelha do contraste da interferência diferencial (IR-DIC), um amplificador da remendo-braçadeira, digitador dos dados, stimulator digital, isolador, computador, software para a aquisição de dados e análise, manipulator motorizado, plataforma do microscópio, tabela da isolação da vibração, gaiola de Faraday, sistema de aquecimento da solução, bombas peristáltica e extrator do elétrodo.

  1. Adicionar o (0,1 mm) para ACSF e resolvê-lo usando ultra-sonication por 3 min.
  2. Perfuse uma câmara de gravação com a Picrotoxina contendo, O2-co2-saturado ACSF na taxa de 2 ml/min. manter a temperatura da câmara de gravação em torno de 30 ° c.
  3. Faça um eletrodo de gravação puxando um vidro de borosilicato capilar com filamento (diâmetro externo = 1,5 mm) usando um extrator com 4 degraus. A ponta-diâmetro deve ser em torno de 1 μm.
  4. Faça um elétrodo de estimulação puxando o mesmo capilar usando o extrator com 2 etapas, a seguir quebre para produzir uma ponta fina golpeando a ponta de encontro a um bloco do ferro um microscópio binocular. O diâmetro final deve ser de 3 – 5 μm.
  5. Transfira a fatia cerebelar para a câmara de gravação e fixe-a com um peso pt com fios de nylon. Encha um eletrodo estimulante com ACSF.
  6. Para a estimulação dos PFs, coloc o elétrodo de estimulação na superfície da camada molecular, em torno de 50 μm longe da camada da pilha de Purkinje.
  7. Para a estimulação do CF, coloc o elétrodo de estimulação na parte inferior da camada da pilha de Purkinje (etapas 5,3, 5,4).
  8. Filtrar K+-based ou cs+-based solução interna com um filtro de 0,45 μm. Use uma microcarregadeira para encher um eletrodo de gravação com 8 μL de solução interna.
  9. Aplique uma fraca pressão positiva no eletrodo de gravação antes de mergulhá-la no ACSF. Sua resistência deve ser 2 – 4 MΩ e o potencial juncional líquido deve ser corrigido.
  10. Aproxime o corpo sadio, brilhante da pilha do PC com o elétrodo da gravação. Empurre a superfície da pilha de Purkinje ligeiramente, pare de aplicar a pressão positiva, a seguir aplique a pressão negativa até formar um selo do giga-ohm. Em seguida, estabeleça a configuração da célula inteira usando pressão negativa.
  11. Segure o potencial de membrana em-70 mV, e aplique-2 mV pulso (duração, 100 ms) em 0,1 Hz para monitorar a resistência de entrada, resistência da série e capacitância de entrada, continuamente. Não use a compensação de resistência da série. Descarte os dados quando a resistência da série varia em mais de 15%.

5. indução de LTD

  1. Estimular a camada molecular com um pulso (duração, 0,1 ms). Identifique as correntes pós-sinápticas PF-excitatórias (EPSC) aplicando um estímulo de pulso duplo (intervalo interspike (ISI) de 50 ms). O PF-EPSC deve apresentar facilitação de pulso pareado e aumento gradual da amplitude em relação ao aumento da intensidade de estimulação.
  2. Registre a resposta de teste do PF-EPSC aplicando um único pulso em 0,1 Hz. Ajuste a intensidade do estímulo de modo que a amplitude evocada de EPSC seja em torno de 200 pA. Evite a contaminação da corrente através do canal iônico dependente da voltagem.
  3. Estimular a FC na parte inferior da camada de células de Purkinje, e identificar o EPSC eliciado pela ativação CF (aplicando um estímulo de pulso duplo). O CF-EPSC deve mostrar a depressão do pulso emparelhado e uma maneira All-or-None de acordo com o aumento na intensidade da estimulação. Para a indução do LTD, um único estímulo deve ser usado.
  4. Protocolo de indução de LTD 1
    1. Usando um eletrodo contendo solução interna baseada em K+condições de aperto atual, aplique um único estímulo PF e um único estímulo CF simultaneamente a 1 Hz por 5 min (300 pulsos) (Figura 1a).
  5. Protocolo de indução de LTD 2
    1. Usando uma solução interna com base em K+contendo eletrodo condições de aperto atual, aplique duplo PF-ESTÍMULOS (ISI de 50 ms) e único estímulo CF, pois o segundo estímulo PF é coincidente com estímulos CF a 1 Hz por 5 min (Figura 1b).
  6. Protocolo de indução de LTD 3
    1. Usando um elétrodo que contem a solução interna de cs+-based condições da tensão-braçadeira, aplique um PF-estímulo dobro (ISI de 50 ms) e uma única tensão-etapa despolarizantes (-70 a 0 MV, 50 ms) ao soma em 1 Hertz por 3 minutos, de modo que o segundo PF-estímulo seja equivalente ao início da etapa de tensão despolarizante (Figura 1C).
  7. LTD-induzindo Protocol-4
    1. Usando um elétrodo que contem a solução interna de cs+-based condições da tensão-braçadeira, aplique os PF-estímulos (5x em 100 hertz) e uma única tensão-etapa despolarizantes (-70 a 0 milivolt, 50 ms) ao soma em 0,5 hertz por 3 minutos, simultaneamente (Figura 1D ).

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Resultados

Quatro protocolos foram utilizados neste estudo para induzir o cerebelar LTD. Nos dois primeiros protocolos (protocolo 1 e 2), aplicou-se a conjunção da PF-estimulação e a CF-estimulação condições de aperto atual. Nos outros dois protocolos (protocolo 3 e 4), a despolarização somática foi substituída para a CF-estimulação condições da tensão-braçadeira. Os traços de tensão ou traços de corrente durante a estimulação conjuntiva foram comparados (Figura 2).

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Discussão

Diferenças entre os quatro protocolos

Nos protocolos de indução de LTD 1 e 2, CJS 300 vezes em 1 Hz é suficiente para induzir cerebelar LTD. a frequência de estimulação da FC pareceu estar em uma faixa fisiológica, pois a taxa de queima de espiga complexa em camundongos adultos alertas ("") foi relatada como sendo 1,25 Hz36. No entanto, a estimulação da FC isoladamente não ocasionou a plasticidade a longo prazo na sinapse PF-CF, conforme utilizado nos protocolo...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Agradecemos A A. Oba por sua assistência técnica. Esta pesquisa foi parcialmente apoiada por Grant-in-Aid para pesquisa científica (C) 17K01982 para KY

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
AmplifierMolecular Devices-AxonMulticlamp 700B
Borosilicate glass capillarySutterBF150-110-10
DigitizerMolecular Devices-AxonDigidata1322A
Electrode pullerSutterModel P-97
IsofluraneFUJIFILM Wako Pure Chemical26675-46-7
IsolatorA.M.P.I.ISOflex
Linear slicerDosaka EMPRO7N
MicroscopeNIKONEclipse E600FN
Peristaltic pumpGilsonMP1 Single Channel Pump
PicrotoxinSigma-AldrichP1675
Pure water makerMerck-MilliporeMilliQ 7000
Software for experimentMolecular probe-AxonpClamp 10
Software for statisticsKyensLabKyPlot 5.0
StimulatorWPIDS8000
Temperature controllerWarnerTC-324B
TetrodotoxinTocris1078

Referências

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