عزل الخلايا الظهارية اللعابية من الغدد اللعابية البشرية للنمو في المختبر كما ساليسفيرس أو الطبقات الأحادية

Summary

نقدم طريقة لعزل وزراعة الخلايا الظهارية المشتقة من الغدة اللعابية البشرية الأولية. هذه الخلايا تظهر أنماط التعبير الجيني متسقة مع كونها من أصل ظهاري اللعابي ويمكن زراعتها كما ساليسفيرس على مصفوفات غشاء الطابق السفلي المستمدة من الخلايا السرطانية Engelbreth-Holm-Swarm أو كطبقات أحادية على أطباق الثقافة المعالجة.

Abstract

الغدد اللعابية هي موقع مهم كبير للباحثين المهتمين في جوانب متعددة من الأمراض البشرية. هدف واحد من الباحثين هو استعادة وظيفة الغدد التالفة من العلاجات الإشعاعية أو بسبب الأمراض المرتبطة بمتلازمة Sjögren. والهدف الثاني للباحثين هو تحديد الآليات التي تتكرر بها الفيروسات داخل الأنسجة الغدية حيث يمكنها بعد ذلك الوصول إلى السوائل اللعابية الهامة للانتقال الأفقي. وتبرز هذه الأهداف الحاجة إلى نموذج قوي ويمكن الوصول إليه في المختبر للغدة اللعابية التي يمكن استخدامها من قبل الباحثين المهتمين في المجالات المذكورة أعلاه وكذلك مجالات البحوث ذات الصلة. هنا نناقش بروتوكول بسيط لعزل الخلايا الظهارية من الغدد اللعابية البشرية ونشرها في المختبر. ويمكن تحسين بروتوكولنا لتلبية احتياجات الدراسات الفردية. باختصار، يتم فصل الأنسجة اللعابية ميكانيكيًا وعنأنزيمي لعزل الخلايا المفردة أو مجموعات صغيرة من الخلايا. اختيار الخلايا الظهارية يحدث عن طريق الطلاء على مصفوفة غشاء الطابق السفلي في وجود وسائل الإعلام الأمثل لتعزيز نمو الخلايا الظهارية. ويمكن الحفاظ على هذه الثقافات الناتجة كمجموعات ثلاثية الأبعاد، تسمى "ساليسفيرز"، أو تزرع كطبقة أحادية على أطباق زراعة الأنسجة البلاستيكية المعالجة. ينتج عن هذا البروتوكول نمو السكان غير المتجانسين من الخلايا الظهارية بشكل رئيسي التي يمكن نشرها لمدة 5-8 ممرات (15-20 تضاعف السكان) قبل أن تخضع للشيخوخة الخلوية.

Introduction

في الثدييات يتم تنظيم الغدد اللعابية في 3 أزواج من الغدد اللعابية الرئيسية: الغدد النكفية، تحت الفك السفلي، وتحت اللسان. هناك أيضا سلسلة من الغدد الثانوية الموجودة على اللسان ومتناثرة في جميع أنحاء تجويف الفم¹. الغدد الرئيسية هي المسؤولة عنحجم الجزء الأكبر من اللعاب المنتجة 2. بالإضافة إلى توفير الحماية المضادة للميكروبات من خلال عوامل سرية ، فإن اللعاب مهم في عملية مضغ وتزييت الطعام أثناء مروره عبر المريء². على هذا النحو ، يمثل خلل الغدة اللعابية مشكلة طبية حيث يكون المصابون غير القادرين على إنتاج ما يكفي من اللعاب أكثر عرضة لتطوير أمراض مثل تجاويف الأسنان أو داء المبيضات الفموي³. بالإضافة إلى ذلك، يؤدي انخفاض اللعاب إلى صعوبة أكبر في تناول الطعام وهضمه مما يؤثر بشكل كبير على نوعية الحياة.

يوجد خلل في الغدة اللعابية في المقام الأول في المرضى الذين يعانون من متلازمة Sjögren، اضطراب المناعة الذاتية، أو في المرضى الذين يعانون من سرطان الرأس والرقبة الذين خضعوا للعلاج بالتشعيع^{3،4،5، 6}. أسيني إفرازي تالف داخل الغدد نتيجة للمناعة الذاتية أو العلاج الإشعاعي لا تخضع للتجديد الذاتي، مما يؤدي إلى مريض يعيش مع ضرر لا رجعة فيه⁶. وقد جذبت دراسة الغدد اللعابية أيضا الاهتمام أو الباحثين المهتمين في آليات مسببات الأمراض الفيروسية. بعض مسببات الأمراض، مثل الفيروس المضخم للخلايا البشرية (HCMV)، تتكرر باستمرار داخل الغدد اللعابية، والذي يسمح بعد ذلك بانتقال الفيروس الوليد إلى مضيف جديد عن طريق اللعاب^7،8. وهكذا، هناك حاجة غير ملباة لتطوير نماذج قوية واستنساخفي المختبر من أنسجة الغدة اللعابية لمعالجة وفهم مجموعة متنوعة من المشاكل الطبية.

وقد استخدمت عدة نماذج من نظام الغدة اللعابية المورين كنقطة انطلاق لفهم وتوصيف الخلايا الظهارية المختلفة التي تشكل الغدد اللعابية^9،10. هناك اختلافات واضحة وكبيرة بين الغدد البشرية والغدد اللعابية المورين¹¹. أبرزها الغدة النكفية البشرية أكبر بالنسبة للغدة تحت الفك السفلي في حين أن الماوس تحت الفك السفلي وparotid متشابهة إلى حد كبير في حجم^1،2،11. في حين توجد خطوط الخلايا تحت الفك السفلي البشرية الخالدة، هناك مخاوف كبيرة من أن الخلايا الخالدة لا تحافظ بدقة على النمط الظاهري للأنسجة الأولية والمخاوف الثانوية التي لا تستمد الخلايا الخالدة في الواقع من ظهارة اللعاب ية نفسها¹². لهذه الأسباب هناك اهتمام والحاجة إلى دراسة الأنسجة اللعابية الأولية من البشر.

هنا نقوم بوصف بروتوكول لعزل الخلايا الظهارية الأولية من الغدد اللعابية البشرية لثقافة الأنسجة. ويستند بروتوكولنا على أعمال Pringle وآخرون وتران وآخرون مع التعديلات التي أدخلت لتبسيط إجراءاتها عموما^13،14. أولاً، في حين أن بروتوكول تران وآخرون يدعو إلى حضانة لمدة خمس ساعات طويلة لهضم الأنسجة اللعابية بشكل أنزيمي، فإن بروتوكولنا المعدل كان ناجحاً بأقل من ساعة واحدة من الحضانة، على غرار ما هو الحال في برينغل وآخرون. ثانيا، نحن نستخدم إنزيمات مختلفة لهضم الأنسجة، وأبرزها أننا لا نستخدم التربسين كما هو مستخدم في بروتوكول تران وآخرون الأصلي، ولكن بدلا من ذلك استخدام خليط من dispase والكولاجين. نحن نفضل تجنب التربسين في خطوات الهضم الأولية كما اقترحت دراسة حديثة أن الهضم الأولي للأنسجة اللعابية عن طريق التربسين يؤدي إلى انخفاض صلاحية الخلايا، وربما عن طريق فقدان مجموعة نادرة من الخلايا الجذعية¹⁵. وأخيرا، نحن ثقافة ساليسفيرس على سطح مصفوفة غشاء الطابق السفلي (BMM) باستخدام وسائل الإعلام المتاحة تجاريا وضعت أصلا لنشر الخلايا الظهارية القصبية. يمكن استخدام بروتوكولنا لعزل الخلايا اللعابية من الغدد النكفية، تحت الفك السفلي، وتحت اللسان. هذه الخلايا تعبر عن الميليز اللعابي وغيرها من الجينات الخاصة اللعابية تشير إلى أنها تحافظ علىالنمط الظاهري مماثلة لتلك التي من الخلايا الظهارية acinar اللعاب7 . لقد نجحنا في توليد الثقافات اللعابية من > 50 عينة الأنسجة البشرية الأولية باستخدام هذه المنهجية. وعلاوة على ذلك، يمكن بسهولة حفظ الخلايا اللعابية الأولية بالتبريد لاستخدامها في وقت لاحق.

Protocol

وقد تم استعراض هذه البروتوكولات والدراسات والموافقة عليها من قبل مجلس الاستعراض المؤسسي في جامعة سينسيناتي (#00003152 الضمان على نطاق الاتحاد، بروتوكول IRB للفترة 2016-4183). عادة ما يتم استئصال الأنسجة اللعابية في العديد من العمليات الجراحية للرأس والرقبة وعادة ما تكون غير متورطة في العملية الخبيثة. عادة، يتم استخدام أنسجة الغدة اللعابية استئصال حديثا في غضون 2-4 ساعة بعد إزالة من المريض (الشكل1A).

1. إعداد الكاشف

1. نمو الخلايا الظهارية القصبية المتوسطة (BEGM)
   1. إضافة مكونات من المجموعة التي توفرها الشركة المصنعة (انظر جدولالمواد).
   2. غسل كل أنبوب مرة واحدة مع وسائل الإعلام الأساسية لضمان النقل الكامل للمكونات. ثم إضافة الفحم تجريد المصل البقر الجنين لجعل التركيز النهائي من 4٪ المصل.
2. حجر الليسين بخلايا الدم الحمراء (RBC)
   1. لجعل الأسهم 10X، إضافة 40.15 غرام من NH₄Cl، 5.0 غرام من NaHCO_3،و 0.186 غرام من حمض اثيلين ديايمينتيتانسيتيك (EDTA) وإحضار ما يصل إلى حجم نهائي من 200 مل باستخدام dH₂O. ثم تصفية تعقيم وتخزينها في 4 درجة مئوية.
   2. تمييع إلى تركيز العمل من 1X في dH معقمة₂O قبل الاستخدام.
3. حل التفكك
   1. إلى زجاجة 100 مل من محلول ديسباس (انظر جدولالمواد) إضافة 0.15 غرام من الكولاجين نوع الثالث. بعد أن يذوب الكولاجين بالكامل، قم بتعقيم الفلتر للحل الجديد وaliquot. تخزين في -20 درجة مئوية.

2. هضم الأنسجة

1. باستخدام لوحة 100 ملم ثقافة الأنسجة، ميكانيكيااليالمين الأنسجة إلى قطع غرامة ~ 1-2 ملم في الحجم باستخداممقص تشريح الأوتوكلاف معقمة وملقط الجراحية (الشكل1B،C). يجب قطع النسيج الضام بين القطع لضمان الفصل السليم وسهولة في مزيد من الخطوات.
2. أضف 6 مل من محلول ديسباس/كولاجيناز إلى الأنسجة المفرومة. ثم الحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة تقريبا إلى 1 ساعة.
3. تعطيل الأنسجة عن طريق الأنابيب مع ماصة المصلية 5 مل 15-20 مرات.
4. حضانة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أخرى إلى 1 ساعة.
5. كرر الخطوتين 2.3 و 2.4 مرتين أو ثلاث مرات أخرى أو حتى يشبه النسيج الطين ويمكن أن تمر بسهولة من خلال فتح الماصات (الشكل1D).
   ملاحظة: حجم البداية للعينة الأنسجة وكيف دقة الأنسجة فرم سوف تحدد عدد المرات التي يحتاج المرء لتكرار الخطوتين 2.3 و 2.4. عادة، نتلقى الأنسجة تقريبا 1 سم × 1 سم في الحجم. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للمرء أن يراقب تفكك الأنسجة باستخدام مجهر زراعة الأنسجة المقلوبة القياسية لتتبع تقدم انفصال الخلايا عن الأنسجة. مجموعات صغيرة من الخلايا مثالية للنمو الأولي للخلايا اللعابية كما ساليسفيرس.

3. طلاء الآبار مع مصفوفة غشاء الطابق السفلي

ملاحظة: ينبغي إذابة مصفوفة غشاء الطابق السفلي (BMM) بين عشية وضحاها عند 4 درجة مئوية في اليوم السابق لاستخدامها. وبمجرد ذوبانها، ينبغي الحفاظ على BMM باستمرار على الجليد أو عند 4 درجة مئوية كما أنها سوف تترسخ بسرعة (أي، تشكيل هلام) في درجات حرارة أكثر دفئا. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي توخي الحذر إذا كانت العينات قد تم تبريدها على الجليد قبل الطلاء على BMM كما عينات الباردة سوف "تذوب" BMM وتعريض الخلايا إلى الطبق البلاستيك.

1. ببطء ماصة BMM (انظر الجدول منالمواد) في كل بئر لتكون مغلفة. توزيع بالتساوي وببطء BMM على البئر.
   ملاحظة: عموما، ونحن نستخدم 500 درجة مئوية لكل بئر من لوحة ستة جيدا، ولكن يمكن تعديل هذا الحجم للاستخدام على المتغيرات الأخرى من لوحات مثل 12-جيدا أو 24-جيدا، أو على النحو المطلوب لهيدروجيلز سمكا أو أرق.
2. قم بحضانة الأطباق المغلفة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل استخدامها للسماح لوقت BMM بالتصلب.

4. تصفية الأنسجة غير المهضومة، وlysis RBC، وطلاء الخلايا

1. نقل التجانس الأنسجة من الخطوة 2.5 إلى أنبوب مخروطي 15 مل. غسل لوحة مرة واحدة مع 6 مل من الفوسفات دولبيكو المخزنة المالحة (DPBS) لنقل الخلايا المتبقية.
2. تصفية التجانس في أنبوب مخروطي 50 مل من خلال 70 ميكرومتر نايلون شبكة مصفاة الخلية لإزالة الأنسجة غير المهضومة. الخلايا المتوترة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 500 × ز.
3. تخفيف 10X RBC lysis العازلةفي dH 2 O معقمة لجعل حل العمل 1X.
4. يستنشق الخارق. ثم إعادة تعليق بيليه الخلية في 10 مل من 1X RBC lysis العازلة. حضانة لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
5. إضافة 20-25 مل من DPBS لتحييد العازلة اللليس RBC وتقليل lysis من الخلايا اللعابية. الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 500 × ز.
   ملاحظة: بعد العلاج مع المخزن المؤقت الانليس RBC، يجب أن يكون بيليه الخلية بيضاء. اللون الأحمر في بيليه يشير إلى أن ليس كل RBC قد تم lysed تماما. كرر الخطوات من 4.4 إلى 4.5 إذا لزم الأمر للحصول على lysis كاملة من كافة RBC.
6. يستنشق الخارق. إعادة تعليق بيليه في 1-2 مل من BEGM لكل بئر ثم وضع الخلايا المعاد تعليقها على الآبار المغلفة BMM. الحضانة عند 37 درجة مئوية
7. مرة واحدة مطلية على BMM، وسوف تشكل الخلايا في هياكل كروية أو "ساليسفيرس" على مدى فترة 2-3 أيام. يمكن الحفاظ على الخلايا كساليسفيرات لمدة 5-7 أيام قبل أن يبدأ BMM في التدهور مما يسمح للخلايا بالوصول إلى البلاستيك والتمسك به وتنمو كطبقة أحادية.

5. إخضاع الساليسفيرات والصيانة على BMM

1. يستنشق وسائل الإعلام من الآبار، ثم إضافة 1 مل من محلول dispase / collagenase إلى كل بئر وحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ~ أو حتى BMM قد حل في الغالب.
2. نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 مل وغسل الآبار مرة واحدة مع DPBS للحصول على الخلايا المتبقية. الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 500 × ز.
3. يستنشق الخارق. إعادة تعليق بيليه في 2 مل من التربسين ثم احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
4. تحييد التربسين باستخدام أي وسائل الإعلام كاملة تحتوي على 10٪ المصل. الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 500 × ز.
5. يستنشق الخارق. إعادة تعليق الخلايا في DPBS لإزالة الوسائط المتبقية، التربسين، والمصل. الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 500 × ز.
6. يستنشق الخارق. إعادة تعليق في BEGM ولوحة الخلايا التي تم تعليقها على أطباق الثقافة المغلفة BMM الصلبة. كما يمكن أن تكون الخلايا المعلقة مطلية مباشرة على أطباق الخلية المعالجة للانتشار كطبقة أحادية. لمزيد من المعلومات حول نمو الخلايا اللعابية كطبقة أحادية، راجع القسم 6. يجب تغذية الخلايا المزروعة على BMM أو على البلاستيك مع BEGM الطازجة كل 2-3 أيام.
7. زراعة الخلايا في حاضنة رطبة الحفاظ على 37درجة مئوية مع 5٪ CO 2.

6. إخضاع الساليسفيرات على أطباق زراعة الأنسجة البلاستيكية المعالجة

ملاحظة: إذا تم الحفاظ على الخلايا كطبقة أحادية على البلاستيك، ابدأ في هذه الخطوة. ينطبق البروتوكول التالي على الخلايا التي تنمو في طبق 100 مم.

1. يستنشق وسائل الإعلام. غسل مرة واحدة مع DPBS لإزالة الوسائط المتبقية.
2. إضافة 2 مل من التربسين ثم احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، أو حتى الخلايا قد فصل تماما.
3. تحييد التربسين باستخدام 4 مل من أي وسائل الإعلام كاملة تحتوي على 10٪ المصل. نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
4. اغسل اللوحة مرة واحدة مع ما يقرب من 5 مل من DPBS لجمع الخلايا المتبقية. الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 500 × ز.
5. يستنشق الخارق. إعادة تعليق الخلايا في 6-10 مل من DPBS لإزالة الوسائط المتبقية.
6. الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 500 × ز.
7. يستنشق ال [سوبرنتنت] و [رلّووت] في [بغم]. خلايا اللوحة على أطباق زراعة الأنسجة البلاستيكية المعالجة. تغذية مع BEGM الطازجة كل 2-3 أيام.
8. زراعة الخلايا في حاضنة رطبة الحفاظ على 37درجة مئوية مع 5٪ CO 2.

7- حفظ الخلايا بالتبريد

ملاحظة: يمكن تحقيق الحفظ بالتبريد للخلايا من تعليق خلية واحدة تنشأ إما من الخلايا الساليسفيرة أو الخلايا المزروعة أحادية الطبقة.

1. عد الخلايا على مقياس الدم لحساب الكمية الإجمالية للخلايا الموجودة.
2. الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 500 × ز.
3. يستنشق الخارق. إعادة تعليق بيليه في BEGM مع 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). يجب أن يكون تركيز الخلايا 2 × 10⁶ خلايا / مل إلى 10 × 10⁶ خلايا / مل.
4. خلايا Aliquot في أنابيب تخزين المبردة المعقمة. وضع الأنابيب في رف رغوة معزول وحضانة في -80 درجة مئوية بين عشية وضحاها لتجميد الخلايا ببطء.
5. في اليوم التالي، وضع أنابيب في النيتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل.
   ملاحظة: يجب إذابة الخلايا بسرعة عند 37 درجة مئوية. عند الذوبان، يجب أن تكون الكريات الخلايا في 500 × ز وإزالة وسائل الإعلام التي تحتوي على DMSO قبل الطلاء.

النتائج

بعد يومين أو ثلاثة أيام من طلاء الخلايا من الأنسجة المهضومة على BMM، سوف تشكل الخلايا بسهولة مجموعات صغيرة من شأنها أن تستمر في التوسع في حجم يصل إلى 15-20 خلية لكل كتلة (الشكل2A). وعادة ما ينظر إلى الحطام الخلوي والخلايا الميتة المنفصلة وينبغي إزالتها عن طريق ?...

Discussion

يمثل الخلل اللعابي مصدر قلق لنوعية الحياة لأولئك الذين يعانون من متلازمة Sjögren وكذلك أولئك الذين يخضعون للعلاج الإشعاعي للسرطانات المجاورة للغدد اللعابية^{3،4،5، 16}. واحد العلاج المقترح لعلاج هؤلاء المرضى هو زراعة الخلاي...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm culture dishes	Thermo Scientific	172931
15 mL conical tubes	Thermo Scientific	339651
50 mL conical tubes	Thermo Scientific	339653
Bronchial Epithelial Cell Growth Media	Lonza	CC-3171	Add bullet kit as per manufacturer's instructions. Supplement with 20 mL of charcoal stripped serum.
Cell strainer 70 µm nylon mesh	Fisher	22-363-548
Charcoal stripped fetal bovine serum	Gibco	12676-029
Collagenase type III	Worthington	LS004182	Store at 4 °C.
Cryogenic Tube	Fisher	5000-0020
Dispase	Cell Applications	07923	Dissolve collagenase to make a 0.15% (w/v) stock. Filter sterilize then store at -20 °C.
Dissecting scissors	Fisher	08-940
Dulbecco phosphate buffered saline	Corning	55-031-PC
General Chemicals	Sigma
PathClear Basement membrane extract	Cultrex	3432-005-01	Thaw at 4 °C at least 24 hr prior to use. Always handle on ice.
Six-well culture dishes	Falcon	353046
Surgical forceps	Fisher	22-079-742
Trypsin-EDTA solution	Corning	25-052-CI