Isolement des cellules épithéliales salivaires des glandes salivaires humaines pour la croissance in vitro comme Salispheres ou Monolayers

Résumé

Nous présentons une méthode pour isoler et cultiver les cellules épithéliales salivaires humaines primaires dérivées. Ces cellules présentent des modèles d'expression génique compatibles avec le fait qu'elles soient d'origine épithéliale salivaire et peuvent être cultivées sous forme de salisphères sur des matrices de membrane de sous-sol dérivées de cellules tumorales Engelbreth-Holm-Swarm ou comme monocouches sur des plats de culture traités.

Résumé

Les glandes salivaires sont un site d'intérêt significatif pour les chercheurs intéressés par de multiples aspects de la maladie humaine. L'un des objectifs des chercheurs est de restaurer la fonction des glandes endommagées par les radiothérapies ou en raison de pathologies associées au syndrome de Sjâgren. Un deuxième objectif des chercheurs est de définir les mécanismes par lesquels les virus se répliquent dans les tissus glandulaires où ils peuvent ensuite accéder à des fluides salivaires importants pour la transmission horizontale. Ces objectifs soulignent la nécessité d'un modèle robuste et accessible de glande salivaire in vitro qui peut être utilisé par les chercheurs intéressés par ce qui précède ainsi que les domaines de recherche connexes. Ici nous discutons un protocole simple pour isoler les cellules épithéliales des glandes salivaires humaines et les propager in vitro. Notre protocole peut être optimisé pour répondre aux besoins des études individuelles. En bref, le tissu salivaire est séparé mécaniquement et enzymatiquement pour isoler les cellules simples ou les petits groupes de cellules. La sélection des cellules épithéliales se fait en placage sur une matrice de membrane de sous-sol en présence de médias optimisés pour favoriser la croissance épithéliale de cellules. Ces cultures résultantes peuvent être maintenues sous forme d'amas tridimensionnels, appelés « salispheres », ou cultivées en monocouche sur des plats de culture de tissus plastiques traités. Ce protocole entraîne la croissance d'une population hétérogène de cellules principalement épithéliales qui peuvent être propagées pour 5-8 passages (15-20 doubles de population) avant de subir la sénescence cellulaire.

Introduction

Chez les mammifères, les glandes salivaires sont organisées en 3 paires de glandes salivaires majeures : les glandes parotide, submandibulaires et sublinguales. Il existe également une série de glandes mineures situées sur la langue et dispersées dans la cavité buccale¹. Les principales glandes sont responsables du volume de salive produite². En plus de fournir une protection antimicrobienne par des facteurs sécrétés, la salive est importante dans le processus de mastication et de lubrification des aliments comme il passe à travers l'œsophage². En tant que tel, le dysfonctionnement des glandes salivaires représente un problème médical où les personnes atteintes qui sont incapables de produire suffisamment de salive sont plus enclins à développer des maladies telles que les caries dentaires ou la candidose orale³. De plus, la réduction de la salive entraîne une plus grande difficulté à manger et à digérer les aliments ayant un impact significatif sur la qualité de vie.

Le dysfonctionnement salivaire de glande est principalement trouvé dans les patients souffrant du syndrome de Sjàgren, un désordre autoimmun, ou dans les patients présentant le cancer de tête et de cou qui ont subi la thérapie d'irradiation^{3,4,5, 6}. Acini sécréteur endommagé dans les glandes à la suite de l'auto-immunité ou la radiothérapie ne subissent pas l'auto-renouvellement, ce qui entraîne un patient vivant avec des dommages irréversibles⁶. L'étude des glandes salivaires a également attiré l'attention ou les chercheurs intéressés par les mécanismes de la pathogénie virale. Certains agents pathogènes, comme le cytomégalovirus humain (HCMV), se reproduisent constamment dans les glandes salivaires, ce qui permet ensuite la transmission du virus naissant à un nouvel hôte via la salive^7,8. Ainsi, il y a un besoin non satisfait de développer des modèles in vitro robustes et reproductibles du tissu salivaire de glande pour aborder et comprendre un éventail divers de problèmes médicaux.

Plusieurs modèles du système salivaire de glande saurine ont été employés comme point de départ pour comprendre et caractériser les différentes cellules épithéliales qui forment les glandes salivaires^9,10. Il existe des différences évidentes et majeures entre les glandes salivaires humaines et maurines¹¹. Plus particulièrement la glande parotide humaine est plus grande par rapport à la glande submandibulaire tandis que la souris submandibulaire et parotide sont beaucoup semblables dans la taille^1,2,11. Bien qu'il existe des lignées cellulaires sous-mandibulaires humaines immortalisées, il existe des préoccupations majeures quant au fait que les cellules immortalisées ne maintiennent pas avec précision le phénotype du tissu primaire et les préoccupations secondaires selon lesquelles les cellules immortalisées ne sont pas réellement dérivées épithélium salivaire lui-même¹². Pour ces raisons, il ya un intérêt et un besoin d'étudier les tissus salivaires primaires de l'homme.

Ici nous décrivons un protocole pour isoler les cellules épithéliales primaires des glandes salivaires humaines pour la culture de tissu. Notre protocole est basé sur les travaux de Pringle et coll. et Tran et coll. avec des modifications apportées pour simplifier généralement leurs procédures^13,14. Tout d'abord, alors que le protocole de Tran et coll. exige une longue incubation de cinq heures pour digérer enzymatiquement le tissu salivaire, notre protocole modifié a été couronné de succès avec aussi peu qu'une heure d'incubation, semblable à celle de Pringle et al. Deuxièmement, nous utilisons différentes enzymes pour la digestion des tissus, plus particulièrement nous n'utilisons pas la trypsine comme il est utilisé dans le protocole original Tran et al., mais plutôt utiliser un mélange de dispase et de collagène. Nous préférons éviter la trypsine dans les étapes initiales de digestion comme une étude récente a suggéré que la digestion initiale du tissu salivaire par trypsine a comme conséquence la viabilité réduite de cellules, probablement par la perte d'une population rare de cellules souches^15. Enfin, nous culture les salispheres sur la surface de la matrice de membrane de sous-sol (BMM) en utilisant un support disponible dans le commerce à l'origine formulé pour la propagation des cellules épithéliales bronchiques. Notre protocole peut être employé pour isoler des cellules salivaires des glandes parotides, submandibulaires, et sublinguales. Ces cellules expriment l'amylase salivaire et d'autres gènes spécifiques salivaires indiquant qu'ellesmaintiennent un phénotype semblable à celui des cellules épithéliales acinar salivaires 7. Nous avons réussi à générer des cultures salivaires à partir d'échantillons de tissus humains primaires à partir de cette méthodologie. En outre, les cellules salivaires primaires peuvent facilement être cryoconservées pour une utilisation ultérieure.

Protocole

Ces protocoles et études ont été examinés et approuvés par la Commission d'examen institutionnel de l'Université de Cincinnati (#00003152 d'assurance à l'échelle fédérale, protocole de la CISR 2016-4183). Le tissu salivaire est généralement réséqué dans beaucoup de procédures chirurgicales de tête et de cou et est habituellement non impliqué par le processus malin. Typiquement, le tissu salivaire fraîchement réséqué de glande est employé dans les 2-4 h après déplacement du patient (figure 1A).

1. Préparation de réactif

1. Milieu de croissance épithélial bronchique (BEGM)
   1. Ajouter les composants du kit fourni par le fabricant (voir le Tableau des matériaux).
   2. Laver chaque tube une fois avec le support de base pour assurer le transfert complet des composants. Ajouter ensuite le sérum bovin fœtal dépouillé de charbon de bois pour faire une concentration finale de 4% de sérum.
2. Tampon de lyse de globule rouge (RBC)
   1. Pour faire 10x stock, ajouter 40,15 g de NH₄Cl, 5,0 g de NaHCO₃, et 0,186 g d'acide éthylènediaminetetraacetic (EDTA) et porter jusqu'à un volume final de 200 ml en utilisant dH₂O. Puis filtrer la stérilisation et le stocker à 4 oC.
   2. Diluer à une concentration de travail de 1x en dH₂O stérile avant utilisation.
3. Solution de dissociation
   1. À une bouteille de 100 ml de solution de dispase (voir le tableau des matériaux)ajouter 0,15 g de collagène de type III. Une fois que la collagène est complètement dissoute, filtre stériliser la nouvelle solution et aliquot. Conserver à -20 oC.

2. Digestion des tissus

1. À l'aide d'une plaque de culture tissulaire de 100 mm, émincer mécaniquement le tissu en fines pièces de 1 à 2 mm de taille à l'aide de ciseaux disséqueurs et de forceps chirurgicaux (figure1B,C). Le tissu conjonctif entre les morceaux doit être coupé pour assurer une séparation et une facilité appropriées dans d'autres étapes.
2. Ajouter 6 ml de la solution dispase/collagenase au tissu haché. Puis incuber à 37 oC pendant environ 30 min à 1 h.
3. Perturber le tissu en pipetilage avec une pipette sérologique de 5 ml 15-20 fois.
4. Incuber à 37 oC pendant 30 min à 1 h.
5. Répétez les étapes 2.3 et 2.4 deux-trois fois de plus ou jusqu'à ce que le tissu ressemble à une boue et peut facilement passer par l'ouverture de pipette (Figure 1D).
   REMARQUE: La taille de départ du spécimen de tissu et comment la finesse du tissu hacher déterminera combien de fois on doit répéter des étapes 2.3 et 2.4. Typiquement, nous recevons le tissu approximativement 1 cm x 1 cm dans la taille. En outre, on peut surveiller la dissociation des tissus à l'aide d'un microscope standard de culture tissulaire inversée pour suivre les progrès de la dissociation cellulaire du tissu. Les petits amas de cellules sont idéaux pour la croissance initiale des cellules salivaires comme salispheres.

3. Puits de revêtement avec matrice de membrane de sous-sol

REMARQUE : La matrice de membrane du sous-sol (BMM) doit être décongelée pendant la nuit à 4 oC la veille de son utilisation. Une fois décongelé, le BMM doit être constamment maintenu sur la glace ou à 4 oC, car il se solidifiera rapidement (c.-à-d. former un gel) à des températures plus chaudes. En outre, il faut faire attention si des échantillons ont été refroidis sur la glace avant de placage sur BMM car les échantillons froids « fondent » le BMM et exposeront les cellules au plat en plastique.

1. Pipette BMM (voir la Table des Matériaux) dans chaque puits à enrober. Répartir uniformément et lentement le BMM sur le puits.
   REMARQUE : En général, nous utilisons 500 L par puits d'une plaque de six puits, mais ce volume peut être ajusté pour être utilisé sur d'autres variantes de plaques telles que 12-bien ou 24-bien, ou comme désiré pour les hydrogels plus épais ou plus minces.
2. Incuber les plaques enduites à 37 oC pendant au moins 15 minutes avant de les utiliser pour permettre au BMM de se solidifier.

4. Filtrage des tissus non digérés, lyse RBC et placage cellulaire

1. Transférer l'homogénéisme tissulaire de l'étape 2.5 à un tube conique de 15 ml. Laver la plaque une fois avec 6 ml de salin tamponné par le phosphate de Dulbecco (DPBS) pour transférer les cellules restantes.
2. Filtrer l'homogénéisme dans un tube conique de 50 ml à travers une passoire à cellules en nylon de 70 m pour enlever les tissus non digérés. Centrifugeuses cellules tendues pendant 5 min à 500 x g.
3. Diluer 10x TAMPON de lyse RBC en dH₂O stérile pour faire une solution de travail 1x.
4. Aspirez le supernatant. Puis resuspendre la pastille cellulaire dans 10 ml de 1x tampon de lyse RBC. Incuber pendant 5 min à 37 oC.
5. Ajouter 20-25 ml de DPBS pour neutraliser le tampon de lyse RBC et minimiser la lyse des cellules salivaires. Centrifugeuse de 5 min à 500 x g.
   REMARQUE : Après traitement avec le tampon de lyse de RBC, la granule de cellules devrait être blanche. La couleur rouge dans la pastille indique que tous les RBC n'ont pas été complètement lysés. Répétez les étapes 4.4 à 4.5 si nécessaire pour une lyse complète de tous les RBC.
6. Aspirez le supernatant. Resuspendre la pastille dans 1-2 ml de BEGM par puits, puis placer les cellules suspendues sur des puits enduits de BMM. Incuber à 37 oC.
7. Une fois plaquées sur BMM, les cellules se formeront en structures sphériques ou « salispheres » sur une période de 2-3 jours. Les cellules peuvent être maintenues comme salispheres pendant environ 5-7 jours avant que le BMM commence à se dégrader permettant aux cellules d'accéder et d'adhérer au plastique et de croître comme une monocouche.

5. Subculturing les salispheres et l'entretien sur BMM

1. Aspirez les médias des puits, puis ajoutez 1 ml de solution dispase/collagenase à chaque puits et incubez à 37 oC pendant 15 min ou jusqu'à ce que BMM soit la plupart du temps dissous.
2. Transférer les cellules dans un tube conique de 15 ml et laver les puits une fois avec dPBS pour obtenir les cellules restantes. Centrifugeuse de 5 min à 500 x g.
3. Aspirez le supernatant. Resuspendre la pastille dans 2 ml de trypsine puis incuber à 37 oC pendant 15 min.
4. Neutraliser la trypsine à l'aide de tout support complet contenant 10% de sérum. Centrifugeuse de 5 min à 500 x g.
5. Aspirez le supernatant. Resuspendre les cellules dans DPBS pour enlever les médias résiduels, la trypsine et le sérum. Centrifugeuse de 5 min à 500 x g.
6. Aspirez le supernatant. Resuspendre dans BEGM et déposer les cellules resuspension sur des plats de culture solidifiés enduits de BMM. Les cellules suspendues peuvent également être plaquées directement sur la culture cellulaire des plats traités pour la prolifération comme une monocouche. Pour plus d'informations sur la croissance des cellules salivaires en tant que monocouche, voir la section 6. Les cellules cultivées sur BMM ou sur plastique doivent être nourries avec du BEGM frais tous les 2 à 3 jours.
7. Culture les cellules dans un incubateur humidifié maintenu à 37 oC avec 5% CO₂.

6. Subculturing les salispheres sur les plats traités de culture de tissu plastique

REMARQUE : Si vous maintenez les cellules en tant que monocouche sur plastique, commencez à cette étape. Le protocole suivant s'applique aux cellules qui poussent dans un plat de 100 mm.

1. Aspirez les médias. Laver une fois avec DPBS pour enlever les supports résiduels.
2. Ajouter 2 ml de trypsine puis incuber à 37 oC pendant 15 min, ou jusqu'à ce que les cellules se soient complètement détachées.
3. Neutraliser la trypsine à l'aide de 4 ml de tout support complet contenant 10% de sérum. Transférer les cellules dans un tube conique de 15 ml.
4. Laver la plaque une fois avec environ 5 ml de DPBS pour recueillir les cellules restantes. Centrifugeuse de 5 min à 500 x g.
5. Aspirez le supernatant. Resuspendre les cellules dans 6-10 ml de DPBS pour enlever les médias résiduels.
6. Centrifugeuse de 5 min à 500 x g.
7. Aspirez le supernatant et resuspendez dans BEGM. Cellules d'assiette sur les plats traités de culture de tissu plastique. Nourrissez avec du BEGM frais tous les 2-3 jours.
8. Culture les cellules dans un incubateur humidifié maintenu à 37 oC avec 5% CO₂.

7. Cryoconservation des cellules

REMARQUE : La cryoconservation des cellules peut être accomplie à partir d'une suspension de cellules simples provenant de cellules cultivées de salisphere ou de monocouches.

1. Compter les cellules sur un hématocytomètre pour calculer la quantité totale de cellules présentes.
2. Centrifugeuse de 5 min à 500 x g.
3. Aspirez le supernatant. Resuspendre la pastille dans BEGM avec 10% de sulfoxide de diméthyle (DMSO). La concentration des cellules devrait être de 2 x 10⁶ cellules/mL à 10 x 10⁶ cellules/mL.
4. Cellules Aliquot dans des tubes de stockage cryogéniques stériles. Placer les tubes dans un support en mousse isolé et couver à -80 oC pendant la nuit pour congeler lentement les cellules.
5. Le lendemain, placer les tubes dans l'azote liquide pour le stockage à long terme.
   REMARQUE : Les cellules doivent être décongelées rapidement à 37 oC. Lors de la décongélation, les cellules doivent être granulées à 500 x g et le support contenant du DMSO enlevé avant le placage.

Résultats

Deux à trois jours après le placage des cellules du tissu digéré sur le BMM, les cellules formeront facilement de petits amas qui continueront d'augmenter en taille jusqu'à 15-20 cellules par grappe (figure 2A). Les débris cellulaires et les cellules mortes détachées sont généralement vus et doivent être enlevés en s'améliorant et en se réapprovisionnant avec des milieuis frais. Les cellules continueront de proliférer sous forme de salisphères...

Discussion

Le dysfonctionnement salivaire représente une préoccupation pour la qualité de vie des personnes souffrant du syndrome de Sjâgren ainsi que de ceux qui subissent une radiothérapie pour les cancers adjacents aux glandes salivaires^{3,4,5, 16}. Une thérapie proposée pour traiter ces patients est de développer des cellules souches salivaires fonctionnelles ou des organoïdes in vitro, qui pe...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm culture dishes	Thermo Scientific	172931
15 mL conical tubes	Thermo Scientific	339651
50 mL conical tubes	Thermo Scientific	339653
Bronchial Epithelial Cell Growth Media	Lonza	CC-3171	Add bullet kit as per manufacturer's instructions. Supplement with 20 mL of charcoal stripped serum.
Cell strainer 70 µm nylon mesh	Fisher	22-363-548
Charcoal stripped fetal bovine serum	Gibco	12676-029
Collagenase type III	Worthington	LS004182	Store at 4 °C.
Cryogenic Tube	Fisher	5000-0020
Dispase	Cell Applications	07923	Dissolve collagenase to make a 0.15% (w/v) stock. Filter sterilize then store at -20 °C.
Dissecting scissors	Fisher	08-940
Dulbecco phosphate buffered saline	Corning	55-031-PC
General Chemicals	Sigma
PathClear Basement membrane extract	Cultrex	3432-005-01	Thaw at 4 °C at least 24 hr prior to use. Always handle on ice.
Six-well culture dishes	Falcon	353046
Surgical forceps	Fisher	22-079-742
Trypsin-EDTA solution	Corning	25-052-CI