Isolação de pilhas epithelial salivares das glândulas salivares humanas para o crescimento in vitro como Salispheres ou monolayers

Resumo

Nós apresentamos um método para isolar e cultivar pilhas epithelial glândula-derivadas humanas preliminares do salivar. Estas pilhas exibem testes padrões da expressão de gene consistentes com eles que são da origem epithelial salivar e podem ser crescidos como salispheres em matrizes da membrana do porão derivadas das pilhas do tumor de engelbreth-Holm-enxame ou como monocamadas em pratos tratados da cultura.

Resumo

As glândulas salivares são um local de interesse significativo para os pesquisadores interessados em múltiplos aspectos da doença humana. Um objetivo dos investigadores é restaurar a função das glândulas danificadas por terapias de radiação ou devido às patologias associadas com Sjögren ' síndrome de s. Um segundo objetivo dos pesquisadores é definir os mecanismos pelos quais os vírus se replicam dentro do tecido glandular, onde eles podem então obter acesso aos fluidos salivares importantes para a transmissão horizontal. Esses objetivos destacam a necessidade de um modelo de glândula salivar robusta e acessível in vitro que possa ser utilizado por pesquisadores interessados nas áreas de pesquisa acima mencionadas, bem como relacionadas. Aqui nós discutimos um protocolo simples para isolar pilhas epithelial das glândulas salivares humanas e para propagá-las in vitro. Nosso protocolo pode ser otimizado para atender às necessidades de estudos individuais. Resumidamente, o tecido salivar é mecanicamente e enzimaticamente separado para isolar células individuais ou pequenos aglomerados de células. A seleção para pilhas epithelial ocorre chapeando em uma matriz da membrana do porão na presença dos meios aperfeiçoados para promover o crescimento epithelial da pilha. Estas culturas resultantes podem ser mantidas como aglomerados tridimensionais, denominados "salispheres", ou cultivados como monocamada em pratos de cultura de tecidos plásticos tratados. Este protocolo resulta no crescimento de uma população heterogénea de células principalmente epiteliais que podem ser propagadas para 5-8 passagens (15-20 duagações populacionais) antes de se submeterem à senescência celular.

Introdução

Em mamíferos, as glândulas salivares são organizadas em 3 pares de glândulas salivares principais: as glândulas parótida, submandibular e sublingual. Existe também uma série de glândulas menores localizadas na língua e espalhadas por toda a cavidade oral¹. As glândulas principais são responsáveis para o volume de maioria de saliva produziu². Além de fornecer proteção antimicrobiana por meio de fatores secretados, a saliva é importante no processo de mastigação e lubrificação de alimentos à medida que passa pelo esôfago². Como tal, a disfunção da glândula salivar representa um problema médico em que os doentes que são incapazes de produzir saliva suficiente são mais propensos a desenvolver doenças, como cavidades dentárias ou candidíase oral³. Adicionalmente, a redução da saliva resulta em maior dificuldade em comer e digerir os alimentos com um impacto significativo na qualidade de vida.

A disfunção da glândula salivar é encontrada principalmente em pacientes que sofrem de síndrome de Sjögren, uma desordem auto-imune, ou em pacientes com câncer de cabeça e pescoço que passaram por terapia de irradiação^3,4,^5, a ⁶. O ácinos secretora danificado dentro das glândulas em conseqüência da autoimunidade ou da terapia de radiação não se submete à autorenovação, que conduz a um paciente que vive com dano irreversível⁶. O estudo das glândulas salivares também tem ganhou a atenção ou pesquisadores interessados em mecanismos de patogênese viral. Alguns patógenos, como o citomegalovírus humano (HCMV), persistentemente replicam dentro das glândulas salivares, o que permite a transmissão do vírus nascente para um novo hospedeiro via saliva^7,8. Assim, há uma necessidade não satisfeita de desenvolver modelos in vitro robustos e reprodutíveis do tecido da glândula salivar para abordar e compreender uma disposição diversa de problemas médicos.

Vários modelos do sistema de glândula salivar Murina têm sido utilizados como ponto de partida para compreender e caracterizar as diferentes células epiteliais que formam as glândulas salivares^9,10. Existem diferenças óbvias e importantes entre as glândulas salivares humanas e murinas¹¹. Mais notavelmente, a glândula parótida humana é maior em relação à glândula submandibular, enquanto o camundongo submandibular e a parótida são muito semelhantes no tamanho^1,2,11. Quando as linhas de pilha submandibular humanas imortalizado existirem, há umas preocupações principais que as pilhas imortalized não mantêm exatamente o phenotype do tecido preliminar e das preocupações secundárias que as pilhas imortalized não são derivadas realmente do epitélio salivar próprio¹². Por estas razões há um interesse e uma necessidade de estudar o tecido salivar preliminar dos seres humanos.

Aqui nós descrevemos um protocolo para isolar pilhas epithelial preliminares das glândulas salivares humanas para a cultura do tecido. Nosso protocolo é baseado nas obras de Pringle et al. e Tran et al. com modificações feitas para simplificar geralmente seus procedimentos^13,14. Primeiro, enquanto o protocolo de Tran et al. exige uma longa incubação de cinco horas para digerir enzimaticamente o tecido salivar, nosso protocolo modificado tem sido bem-sucedido com pouco tempo de incubação de uma hora, semelhante ao de Pringle et al. Em segundo lugar, nós usamos enzimas diferentes para a digestão do tecido, o mais notàvelmente nós não usamos o tripsina como é usado no protocolo original de Tran et al., mas usamos uma mistura do Dispase e do Collagenase. Nós preferimos evitar o tripsina nas etapas iniciais da digestão como um estudo recente sugeriu que a digestão inicial do tecido salivar pela tripsina resulte na viabilidade reduzida da pilha, possivelmente pela perda de uma população rara da pilha de haste¹⁵. Por fim, nós cultive os salispheres na superfície da matriz da membrana do porão (BMM) usando meios comercialmente disponíveis originalmente formulados para a propagação de pilhas epithelial brônquicas. Nosso protocolo pode ser usado para isolar as células salivares das glândulas parótidas, submandibulares e sublinguais. Estas pilhas expressam a amilase salivar e outros genes específicos salivares que indicam que mantêm um phenotype similar àquele de pilhas epithelial acinar salivares⁷. Nós geramos com sucesso culturas salivares de > 50 amostras preliminares do tecido humano usando esta metodologia. Além disso, as pilhas salivares preliminares podem facilmente ser cryopreservado para o uso em uma data mais atrasada.

Protocolo

Estes protocolos e estudos foram revistos e aprovados pelo Conselho de revisão institucional da Universidade de Cincinnati (Federal-Wide Assurance #00003152, protocolo IRB 2016-4183). O tecido salivar é geralmente resected em muitos procedimentos cirúrgicos da cabeça e da garganta e é geralmente não involvido pelo processo maligno. Tipicamente, o tecido da glândula salivar recentemente resected é usado dentro de 2-4 h após a remoção do paciente (Figura 1a).

1. preparação do reagente

1. Meio de crescimento de células epiteliais brônquicas (BEGM)
   1. Adicione componentes do kit fornecido pelo fabricante (consulte a tabela de materiais).
   2. Lave cada tubo uma vez com a mídia de base para garantir a transferência completa de componentes. Em seguida, adicione o carvão vegetal despojado soro bovino fetal para fazer uma concentração final de 4% soro.
2. Tampão de lise do glóbulo vermelho (RBC)
   1. Para fazer o estoque 10x, adicione 40,15 g de NH₄Cl, 5,0 g de NaHCO₃, e 0,186 g de ácido etilenodiaminotraacético (EDTA) e trazer até um volume final de 200 ml usando DH₂o. Em seguida, filtrar esterilizar e armazenar a 4 ° c.
   2. Diluir para uma concentração de trabalho de 1x em estéril dH₂o antes de usar.
3. Solução de dissociação
   1. Para um frasco de 100 ml de solução de Dispase (ver a tabela de materiais) adicionar 0,15 g de colagenase tipo III. Após a colagenase ter sido totalmente dissolvida, o filtro esteriliza a nova solução e a alíquota. Conservar a-20 ° c.

2. digestão do tecido

1. Usando uma placa da cultura do tecido de 100 milímetros, mechanicallymince o tecido em partes finas ~ 1-2 milímetros no tamanho usando autoclave-esterilizou tesouras dissecando e fórceps cirúrgico (Figura 1b,C). O tecido conjuntivo entre as peças deve ser cortado para garantir a separação adequada e facilidade em etapas adicionais.
2. Adicionar 6 mL da solução Dispase/Collagenase ao tecido picado. Em seguida, incubar a 37 ° c por aproximadamente 30 min a 1 h.
3. Interrompa o tecido introduzindo pipetagem com uma pipeta serológica de 5 mL 15-20 vezes.
4. Incubar a 37 ° c por mais 30 min a 1 h.
5. Repita as etapas 2,3 e 2,4 duas-três vezes mais ou até que o tecido se assemelha a uma pasta e pode facilmente passar através da abertura da pipeta (Figura 1D).
   Nota: O tamanho de partida do espécime do tecido e como a finura do tecido que picar determinará quantas vezes uma precisa de repetir etapas 2,3 e 2,4. Tipicamente, nós recebemos o tecido aproximadamente 1 cm x 1 cm no tamanho. Adicionalmente, um pode monitorar a dissociação do tecido usando um microscópio invertido padrão da cultura do tecido para seguir o progresso da dissociação da pilha do tecido. Os conjuntos pequenos das pilhas são ideais para o conseqüência inicial de pilhas salivares como salispheres.

3. poços de revestimento com matriz da membrana do porão

Nota: a matriz de membrana basal (BMM) deve ser descongelada durante a noite a 4 ° c no dia anterior ao seu uso. Uma vez descongelado, o BMM deve ser constantemente mantido no gelo ou a 4 ° c, pois irá solidificar rapidamente (ou seja, formar um gel) a temperaturas mais quentes. Adicionalmente, o cuidado deve ser tomado se as amostras foram refrigeradas no gelo antes do chapeamento em BMM porque as amostras frias "derreterão" o BMM e expõem pilhas ao prato plástico.

1. Pipeta lentamente BMM (veja a tabela dos materiais) em cada poço para ser revestido. Uniformemente e lentamente distribuir o BMM sobre o poço.
   Nota: geralmente, nós usamos 500 μL por cada poço de uma placa de seis poços, mas este volume pode ser ajustado para o uso em outras variações das placas tais como 12-well ou 24-well, ou como desejado para uns hydrogels mais grossos ou mais finos.
2. Incubar as chapas revestidas a 37 ° c durante, pelo menos, 15 minutos antes da utilização para permitir a solidificação do tempo de BMM.

4. filtragem de tecido não digerido, lise de RBC, e chapeamento de pilha

1. Transfira o homogeneato de tecido da etapa 2,5 para um tubo cônico de 15 mL. Lave a placa uma vez com 6 mL de soro fisiológico tamponado com fosfato de Dulbecco (DPBS) para transferir as células restantes.
2. Filtre o homogeneate em um tubo cônico de 50 mL através de um filtro de célula de malha de nylon de 70 μm para remover o tecido não digerido. Centrifugar as células tensas por 5 min a 500 x g.
3. Diluir 10x tampão de Lise RBC em dH estéril₂o para fazer uma solução de trabalho 1x.
4. Aspirar o sobrenadante. Em seguida, Ressuspender o pellet celular em 10 mL de 1x RBC lise tampão. Incubar por 5 min a 37 ° c.
5. Adicionar 20-25 mL de DPBS para neutralizar o tampão de lise de RBC e minimizar a lise de células salivares. Centrifugador por 5 min a 500 x g.
   Nota: após o tratamento com tampão de lise de RBC, a pelota da pilha deve ser branca. A cor vermelha na pelota indica que nem todos os RBC foram totalmente lisados. Repita os passos 4,4 a 4,5 se necessário para a Lise completa de todos os RBC.
6. Aspirar o sobrenadante. Resuspend o pellet em 1-2 mL de BEGM por poço, em seguida, colocar as células resrepended em Poços revestidos de BMM. Incubar a 37 ° c.
7. Uma vez chapeado em BMM, as células se formam em estruturas esféricas ou "salispheres" durante um período de 2-3 dias. As pilhas podem ser mantidas como salispheres por aproximadamente 5-7 dias antes que o BMM comece a degradar permitindo que as pilhas acessem e aderem ao plástico e cresçam como um monocamada.

5. subculturando os salispheres e manutenção em BMM

1. Aspirar meios dos poços, a seguir adicione 1 mL da solução do Dispase/Collagenase a cada poço e incubar em 37 ° c para ~ 15 minutos ou até que o BMM dissolveu na maior parte.
2. Transfira as células para um tubo cônico de 15 mL e lave os poços uma vez com o DPBS para obter as células restantes. Centrifugador por 5 min a 500 x g.
3. Aspirar o sobrenadante. Suspender a pelota em 2 mL de tripsina, em seguida, incubar a 37 ° c por 15 min.
4. Neutralize a tripsina usando qualquer mídia completa contendo 10% de soro. Centrifugador por 5 min a 500 x g.
5. Aspirar o sobrenadante. Ressuscite as células no DPBS para remover meios residuais, tripsina e soro. Centrifugador por 5 min a 500 x g.
6. Aspirar o sobrenadante. Resuspend no begm e na placa as pilhas ressuscipended em pratos de cultura BMM-revestidos solidificado. As células ressuscipended também podem ser chapeadas diretamente na cultura celular pratos tratados para a proliferação como uma monocamada. Para mais informações sobre o crescimento de células salivares como monocamada, ver secção 6. As células cultivadas em BMM ou em plástico devem ser alimentadas com BEGM fresco a cada 2 – 3 dias.
7. Cultura as pilhas em uma incubadora humidificada mantida em 37 ° c com 5% CO₂.

6. subculturando os salispheres em pratos plásticos tratados da cultura do tecido

Nota: se a manutenção de células como monocamada em plástico, comece nesta etapa. O seguinte protocolo aplica-se às células que crescem em um prato de 100 mm.

1. Aspirar a mídia. Lave uma vez com o DPBS para remover a mídia residual.
2. Adicione 2 mL de tripsina e, em seguida, incubar a 37 ° c durante 15 min, ou até as células terem sido totalmente destacadas.
3. Neutralize a tripsina usando 4 mL de qualquer mídia completa contendo 10% de soro. Transfira as células para um tubo cônico de 15 mL.
4. Lave a placa uma vez com aproximadamente 5 mL de DPBS para recolher as células restantes. Centrifugador por 5 min a 500 x g.
5. Aspirar o sobrenadante. Ressuscite as células em 6-10 mL de DPBS para remover os meios residuais.
6. Centrifugador por 5 min a 500 x g.
7. Aspirar o sobrenadante e ressuscito em BEGM. Pilhas de placa em pratos plásticos tratados da cultura do tecido. Alimente com BEGM fresco cada 2-3 dias.
8. Cultura as pilhas em uma incubadora humidificada mantida em 37 ° c com 5% CO₂.

7. criopreservação das células

Nota: a criopreservação das células pode ser realizada a partir de uma única célula de suspensão originada a partir de qualquer salisphere ou monocamada células cultivadas.

1. Conte as células em um hematociômetro para calcular a quantidade total de células presentes.
2. Centrifugador por 5 min a 500 x g.
3. Aspirar o sobrenadante. Ressuscitem o pellet em BEGM com 10% dimetil sulfóxido (DMSO). A concentração de células deve ser de 2 x 10⁶ células/ml para 10 x 10⁶ células/ml.
4. Células alíquotas em tubos de armazenamento criogênicos estéreis. Coloc os tubos em uma cremalheira isolada da espuma e incubar em-80 ° c durante a noite para congelar lentamente as pilhas.
5. No dia seguinte, coloque os tubos em nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.
   Nota: as células devem ser descongelados rapidamente a 37 ° c. Ao descongelar, as células devem ser peletizadas em 500 x g e a mídia contendo DMSO removida antes do chapeamento.

Resultados

Dois-três dias após o chapeamento de células de tecido digerido para BMM, as células prontamente formam pequenos clusters que continuarão a expandir em tamanho até 15-20 células por cluster (Figura 2a). Os restos celulares e as pilhas inoperantes destacadas são vistos tipicamente e devem ser removidos aspirando e reabastecendo com meios frescos. As células continuarão a proliferar como salispheres por cerca de 3-10 dias, ou contanto que a camada de ...

Discussão

A disfunção salivar representa uma preocupação com a qualidade de vida para aqueles que sofrem de síndrome de Sjögren, bem como aqueles submetidos a radioterapia para cânceres adjacentes às glândulas salivares^3,4,^5, a ¹⁶. Uma terapia propor para tratar estes pacientes é crescer pilhas de haste salivares funcionais ou organóides in vitro, que podem então ser introduzidos na glândula...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm culture dishes	Thermo Scientific	172931
15 mL conical tubes	Thermo Scientific	339651
50 mL conical tubes	Thermo Scientific	339653
Bronchial Epithelial Cell Growth Media	Lonza	CC-3171	Add bullet kit as per manufacturer's instructions. Supplement with 20 mL of charcoal stripped serum.
Cell strainer 70 µm nylon mesh	Fisher	22-363-548
Charcoal stripped fetal bovine serum	Gibco	12676-029
Collagenase type III	Worthington	LS004182	Store at 4 °C.
Cryogenic Tube	Fisher	5000-0020
Dispase	Cell Applications	07923	Dissolve collagenase to make a 0.15% (w/v) stock. Filter sterilize then store at -20 °C.
Dissecting scissors	Fisher	08-940
Dulbecco phosphate buffered saline	Corning	55-031-PC
General Chemicals	Sigma
PathClear Basement membrane extract	Cultrex	3432-005-01	Thaw at 4 °C at least 24 hr prior to use. Always handle on ice.
Six-well culture dishes	Falcon	353046
Surgical forceps	Fisher	22-079-742
Trypsin-EDTA solution	Corning	25-052-CI