Salispheres veya Monolayers olarak In vitro büyüme için ınsan tükürük bezlerinden tükürük epitelyal hücrelerin yalıtım

Özet

Birincil insan tükürük bezi türevi epitelyal hücreleri izole etmek ve yetiştirmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu hücreler onları tükürük epitelyal orijinli olmak ile tutarlı gen ifade desenleri sergiler ve Engelbreth-Holm-Swarm tümör hücrelerinden türetilen Bodrum membran matrisleri üzerinde salispheres olarak veya tedavi kültür yemekleri monolayers olarak yetişebilir.

Özet

Tükürük bezleri insan hastalığının birden fazla yönü ile ilgilenen araştırmacılar için önemli bir ilgi alanı vardır. Araştırmacıların bir amacı, Radyasyon terapileri veya Sjögren sendromu ile ilişkili patolojiler nedeniyle hasar görmüş bezlerin fonksiyonunu geri yüklemek. Araştırmacıların ikinci hedefi, virüslerin glandüler doku içinde çoğaldığı mekanizmaları tanımlamaktır, böylece yatay iletim için önemli olan tükürük sıvılarına erişim sağlayabilirler. Bu hedefler yukarıda bahsedilen yanı sıra ilgili araştırma alanları ile ilgilenen araştırmacılar tarafından kullanılabilecek sağlam ve erişilebilir bir in vitro tükürük bezi modeli için ihtiyaç vurgulayın. Burada, epitelyal hücreleri insan tükürük bezlerinden yalıtmak ve onları in vitro yaymak için basit bir protokol tartışıyoruz. Protokollerimiz, bireysel çalışmaların ihtiyaçlarını karşılamak için daha da optimize edilebilir. Kısaca, tükürük dokusu mekanik ve enzince tek hücreleri veya hücrelerin küçük kümeleri yalıtmak için ayrılır. Epitelyal hücreler için seçim, epitelyal hücre büyümesini teşvik etmek için optimize edilmiş medyanın varlığında bir Bodrum membran matrisinin üzerine kaplamadan oluşur. Bu ortaya çıkan kültürler üç boyutlu kümeleri olarak muhafaza edilebilir, "salispheres" olarak adlandırılan, ya da tedavi plastik doku kültürü yemekleri bir tek tabakalı olarak büyüdü. Bu protokol, hücresel senescence yapmadan önce 5-8 pasajlar (15-20 nüfus doublings) için yayılabilir ağırlıklı olarak epitelyal hücrelerin heterojen bir nüfusun gelişmesinde sonuçlanır.

Giriş

Memelilerde, tükürük bezleri 3 çift büyük tükürük bezi halinde düzenlenmiştir: parotis, submandibular ve dil altı bezleri. Ayrıca dilde bulunan ve ağız boşluğu boyunca dağınık küçük bezleri bir dizi var¹. Büyük bezleri üretilen tükürük toplu hacminin sorumludur². Salgılanmış faktörler aracılığıyla antimikrobiyal koruma sağlamaya ek olarak, tükürük, özofagus²' den geçerken gıda çiğneme ve yağlama sürecinde önemlidir. Bu nedenle, tükürük bezi disfonksiyon yeterli tükürük üretmek mümkün olmayan hastalarında diş boşlukları veya oral kandidiyasis³gibi maladies gelişmekte daha eğilimli olduğu bir tıbbi sorunu temsil eder. Ayrıca, düşük tükürük sonuçları yaşam kalitesi üzerinde önemli bir etkiye sahip yemek ve sindirme daha fazla zorluk.

Tükürük bezi disfonksiyon öncelikle Sjögren sendromu muzdarip hastalarda bulunur, otoimmün bozukluk, ya da ışınlama terapisi geçirmiş olan baş ve boyun kanseri olan hastalarda^{3,4,5, 6}' ya kadar. Otoimmünite veya radyasyon tedavisinin bir sonucu olarak bezler içinde hasarlı salgını acini kendi kendine yenilenmez, bu da geri dönüşümsüz hasar⁶ile yaşayan bir hasta ile sonuçlanır. Tükürük bezleri çalışma da dikkat veya viral patogenezi mekanizmaları ile ilgilenen araştırmacılar topladı. İnsan sitomegalovirüs (HCMV) gibi bazı patojenler, daha sonra tükürük^7,8üzerinden yeni bir ana bilgisayara doğmakta olan virüsü iletimi için izin veren tükürük bezleri içinde ısrarla çoğaltır. Böylece, çeşitli tıbbi sorunları çözmek ve anlamak için tükürük bezi dokusunun sağlam ve tekrarlanabilir in vitro modellerini geliştirmek için karşılanmamış bir ihtiyaç vardır.

Murine tükürük bezi sisteminin birkaç modeli, tükürük bezlerini oluşturacak farklı epitelyal hücreleri anlamak ve karakterize etmek için bir başlangıç noktası olarak kullanılmıştır^9,10. İnsan ve murine tükürük bezleri arasında açık ve önemli farklar var¹¹. Fare submandibular ve parotis boyutu^1,2,11çok benzer iken en önemlisi insan parotis bezi submandibular bezi ile ilgili olarak daha büyük. Ölümsüzleştirilmiş insan submandibular hücre hatları var iken, ölümsüzleştirilmiş hücrelerin doğru birincil doku ve ikincil endişeleri fenotipi korumak değil büyük endişeleri vardır ölümsüzleştirilmiş hücreler aslında türetilmemiş tükürük epitelin kendisi¹². Bu nedenlerle bir ilgi ve insanlardan birincil tükürük dokusu çalışması için bir ihtiyaç vardır.

Burada, primer epitelyal hücreleri doku kültürü için insan tükürük bezlerinden yalıtmak için bir protokol açıklanmaktadır. Protokollerimiz Pringle ve al. ve Tran ve Al 'ın eserlerine dayanmaktadır. genellikle prosedürlerini kolaylaştırmak için yapılan değişikliklerle^13,14. İlk olarak, Tran ve al. ' nin Protokolü, tükürük dokusunu enzikatik olarak sindirmek için uzun bir beş saatlik kuluçka çağrısı yaparken, modifiye protokolüm, Pringle ve Al 'da benzer şekilde bir saatlik kuluçka gibi az başarılı olmuştur. İkinci olarak, doku sindirimi için farklı enzimler kullanıyoruz, özellikle de orijinal Tran ve el protokolünde kullanılan tripsin kullanmayın, ancak bunun yerine dispaz ve collagenase karışımı kullanın. Biz yeni bir çalışma olarak ilk sindirim adımlarında tripsin önlemek için tercih düşük hücre viability tripsin sonuçları tarafından tükürük dokusunun ilk sindirim, muhtemelen nadir bir kök hücre nüfus kaybı tarafından önerilen¹⁵. Son olarak, biz kültür Bodrum membran matris (BMM) yüzeyinde salispheres aslen bronş epitelyal hücrelerin yayılması için formüle ticari olarak kullanılabilen bir medya kullanarak. Protokollerimiz, parotis, submandibular ve altdilde bezlerden gelen tükürük hücrelerini izole etmek için kullanılabilir. Bu hücreler, tükürük asiner epitelyal hücrelerine benzer bir fenotip bulundurduğunu gösteren tükürük amilaz ve diğer tükürük spesifik genlerini ifade ederler⁷. Bu metodolojisi kullanarak > 50 primer insan dokusu örneklerinden tükürük kültürlerini başarıyla üretiyoruz. Dahası, birincil tükürük hücreleri kolayca daha sonraki bir tarihte kullanılmak üzere kriokonservirovannogo olabilir.

Protokol

Bu protokoller ve çalışmalar Cincinnati Üniversitesi 'nde (Federal kapsamlı güvence #00003152, ıRB protokol 2016-4183) Kurumsal Inceleme Kurulu tarafından gözden geçirildi ve onaylanmıştır. Tükürük dokusu yaygın olarak birçok baş ve boyun cerrahi prosedürlerinde rezeke edilir ve genellikle malign süreç tarafından yer almaz. Genellikle, hasta (Şekil 1a) kaldırıldıktan sonra 2-4 h içinde taze rezeke tükürük bezi dokusu kullanılır.

1. reakajın hazırlanması

1. Bronşiyal epitelyal hücre büyüme ortamı (BEGM)
   1. Üretici tarafından sağlanan Kitten bileşenler ekleyin ( malzeme tablosunabakın).
   2. Bileşenlerin tam transferini sağlamak için her tüpü temel medyadan bir kez yıkayın. Sonra% 4 serum son konsantrasyon yapmak için kömür aldı fetal Sığır serum ekleyin.
2. Kırmızı kan hücresi (RBC) liziz tamponu
   1. 10X stok yapmak, eklemek 40,15 g NH₄Cl, 5,0 g NaHCO₃, ve 0,186 g ethylenediaminetetraasetic asit (EDTA) ve son hacmine kadar getirmek 200 ml kullanarak DH₂O. Sonra filtre sterilize ve 4 °C ' de saklayın.
   2. Steril dH₂O önce kullanım için 1 bir çalışma konsantrasyonu seyreltildi.
3. Dissociation çözüm
   1. Bir 100 ml şişe dispase çözüm için (bkz: malzeme tablosu) eklemek 0,15 g kolajenaz türü III. Kolajenaz tamamen çözülür sonra filtre sterilize yeni çözüm ve aliquot. -20 °C ' de saklayın.

2. doku sindirim

1. 100 mm 'lik doku kültürü plakasını kullanarak, dokuyu, otoklav sterilize edilmiş Diseksiyon makas ve cerrahi forseps (Şekil 1B,C) kullanarak ince parçalara% ~ 1-2 mm 'lik bir boyutta yerleştirin. Parçaları arasında bağ dokusu doğru ayırma ve daha fazla adımda kolaylığı sağlamak için kesilmelidir.
2. Kıyılmış dokuya dispase/collagenase çözeltisi 6 mL ekleyin. Sonra yaklaşık 30 dk 1 h için 37 °C ' de inkübe.
3. 5 mL serolojik pipet 15-20 kez pipetleme ile dokusu bozar.
4. 37 °C ' de 30 dakika ila 1 saat arasında inküye yapın.
5. 2,3 ve 2,4 iki-üç kez daha veya doku bir bulamaç benzer ve kolayca pipet açma (Şekil 1D) geçebilirsiniz adımları yineleyin.
   Not: Doku örneğinin başlangıç boyutu ve doku kıyma ne kadar hassas bir adım 2,3 ve 2,4 tekrarlamak için gereken kaç kez belirleyecektir. Tipik olarak, yaklaşık 1 cm x 1 cm boyutunda doku alırsınız. Ayrıca, bir standart ters doku kültürü mikroskop kullanarak doku ayrışma izleyebilirsiniz doku hücre dağılma ilerlemesini izlemek için. Küçük hücreler kümeleri salispheres olarak tükürük hücrelerinin ilk büyüme için idealdir.

3. Bodrum membran matrisli kaplama kuyuları

Not: Bodrum membran matrisi (BMM), kullanılacak gün önce 4 °C ' de bir gecede çözülür. Çözülmüş bir kez, BMM sürekli buzda veya 4 °C ' de hızlı bir şekilde (yani, bir jel formu) sıcak sıcaklıklarda korunmalıdır. Ayrıca, örnekler soğuk numuneler BMM "eritmek" ve plastik çanak hücreleri açığa olacak gibi BMM kaplama önce buz üzerinde soğutulmuş olsaydı bakım alınmalıdır.

1. Yavaşça BMM pipet ( malzeme tablosunabakın) her iyi içine kaplanmış. BMM 'ye eşit ve yavaşça kuyu üzerinde dağıtın.
   Not: genellikle, altı-kuyu plakasının her bir kuyusu için 500 μL kullanıyoruz, ancak bu hacim 12-Well veya 24-Well gibi plakaların diğer varyantları için veya kalın veya daha ince Hidrojeller için istenilen şekilde ayarlanabilir.
2. 37 °C ' de kaplı plakaları, BMM 'nin yeniden katılaşma süresi için en az 15 dakika önce kullanın.

4. sindirilmemiş doku, RBC lizis ve hücre kaplama filtreleme

1. Transfer doku homojenatı adım 2,5 için 15 ml konik tüp. Kalan hücreleri aktarmak için 6 mL Dulbecco fosfat tamponlu tuz (DPBS) ile bir kez yıkayın.
2. Sindirilmemiş dokusu kaldırmak için bir 70 μm naylon kafes hücre süzgeci ile bir 50 mL konik tüp içine homojenlik filtre. Santrifüjler 500 x g'de 5 dakika boyunca gergin hücreler.
3. 1 adet çalışma çözeltisi yapmak için steril dH₂O 'DA 10X RBC lizis tamponunu seyreltin.
4. Süpernatant aspirate. Sonra 10 ml 1x RBC liziz tampon hücre Pelet pelletini. 37 °C ' de 5 dak.
5. 20-25 mL DPBS ekleme RBC liziz tamponu nötralize ve tükürük hücrelerinin liziz en aza indirmek için. 500 x g'de 5 dakika Santrifüjü.
   Not: RBC liziz tampon ile tedavi sonra, hücre peleti beyaz olmalıdır. Pelet kırmızı renk tüm RBC tamamen lysed olduğunu gösterir. Tüm RBC tam liziz için gerekirse 4,4 ile 4,5 arasındaki adımları yineleyin.
6. Süpernatant aspirate. İyi başına Begm 1-2 ml içinde Pelet resuspend sonra BMM kaplı kuyuları üzerine yer resuspended hücreler. 37 °C ' de Inküye yapın.
7. Bir kez BMM üzerinde kaplama, hücreler küresel yapıları veya "salispheres" bir 2-3-gün dönemi boyunca oluşturur. Hücreler için salispheres olarak muhafaza edilebilir yaklaşık 5-7 gün önce BMM hücreleri erişmek ve plastik uymak ve bir monolayer olarak büyümek izin düşürmeye başlar.

5. BMM üzerinde salispheres ve bakım subculturing

1. Kuyular medya aspirate, daha sonra 1 mL dispase/collagenase çözeltisi her iyi ekleyin ve ~ 15 dakika veya BMM çoğunlukla çözünmüş kadar 37 °C ' de inküye.
2. Kalan hücreleri elde etmek için hücreleri bir kez DPBS ile 15 mL konik boruya aktarın ve kuyuları yıkayın. 500 x g'de 5 dakika Santrifüjü.
3. Süpernatant aspirate. 2 ml tripsin içinde Pelet resuspend sonra 15 dakika için 37 °c ' de inkübe.
4. % 10 serum içeren tüm ortamları kullanarak tripsin nötralize. 500 x g'de 5 dakika Santrifüjü.
5. Süpernatant aspirate. Kalan medyayı, tripsin ve serumu kaldırmak için DPBS 'deki hücreleri yeniden resuspend. 500 x g'de 5 dakika Santrifüjü.
6. Süpernatant aspirate. Resuspend BEGM ve plaka üzerine resuspended hücreler üzerine katılaştırılmış BMM kaplı kültür yemekleri. Resuspended hücreler de doğrudan hücre kültürü üzerine kaplı olabilir bir monolayer olarak proliferasyon için yemekler tedavi. Bir monolayer olarak tükürük hücrelerinin büyümesi ile ilgili daha fazla bilgi için Bölüm 6 ' ya bakın. BMM veya plastik üzerinde yetiştirilen hücreler her 2 – 3 günde bir taze BEGM ile beslenmelidir.
7. % 5 CO₂Ile 37 °c ' de tutulan nemlendirilmiş bir kuluçin hücrelerinin kültürü.

6. tedavi plastik doku kültürü yemekleri üzerinde salispheres subculturing

Not: hücreleri plastik üzerinde bir tek tabakalı olarak koruyarak, bu adımda başlayın. Aşağıdaki protokol 100 mm 'lik bir çanak içinde büyüyen hücrelere uygulanır.

1. Medyayı aspirate. Kalan medyayı kaldırmak için DPBS ile bir kez yıkayın.
2. 2 mL tripsin ekleyin, ardından 37 °C ' de 15 dakika veya hücreler tamamen ayrılıncaya kadar inküye yapın.
3. % 10 serum içeren herhangi bir komple medyanın 4 mL 'ini kullanarak tripsin nötralize edilmesi. Hücreleri 15 mL Konik Tüpe aktarın.
4. Kalan hücreleri toplamak için yaklaşık 5 mL DPBS ile plakayı bir kez yıkayın. 500 x g'de 5 dakika Santrifüjü.
5. Süpernatant aspirate. 6-10 mL DPBS içinde resuspend hücreler kalan medya kaldırmak için.
6. 500 x g'de 5 dakika Santrifüjü.
7. Begm süpernatant ve pelletini aspirate. Tedavi plastik doku kültürü yemekleri üzerine plaka hücreleri. Her 2-3 gün taze BEGM ile yem.
8. % 5 CO₂Ile 37 °c ' de tutulan nemlendirilmiş bir kuluçin hücrelerinin kültürü.

7. hücrelerin ağaloprezervasyon

Not: hücrelerin Cryopreservation, ya salisphere veya tek tabakalı yetiştirilen hücrelerden kaynaklanan tek bir hücre süspansiyondan gerçekleştirilebilir.

1. Mevcut hücrelerin toplam miktarını hesaplamak için bir hematokytometer üzerindeki hücreleri saymak.
2. 500 x g'de 5 dakika Santrifüjü.
3. Süpernatant aspirate. % 10 dimetil sülfoxid (DMSO) ile Begm içinde Pelet resuspend. Hücreler konsantrasyonu 2 x 10 6 hücreler/ ml 10 x 10⁶ hücreler/ml olmalıdır.
4. Steril kriyojenik depolama tüpleri içine aliquot hücreleri. Tüpleri yalıtılmış bir köpük rafına yerleştirin ve hücreleri yavaşça dondurmak için-80 °C ' de bir gecede inküye yapın.
5. Ertesi gün, uzun süreli depolama için sıvı nitrojen yerleştirin tüpler.
   Not: hücreler 37 °C ' de hızla çözülür. Çözülür üzerine, hücreler 500 x g ve DMSO-kaplama önce kaldırıldı medya içeren pelleted olmalıdır.

Sonuçlar

İki-üç gün sonra BMM üzerine sindirilmiş doku hücreleri kaplama, hücreler kolayca küme başına 15-20 hücre boyutuna kadar genişletmek için devam edecek küçük kümeleri oluşturacak (Şekil 2a). Hücresel enkaz ve müstakil ölü hücreler genellikle görülür ve taze medya ile duman çekiş ve yenileyici tarafından kaldırılması gerekir. Hücreler yaklaşık 3-10 gün boyunca salispheres olarak çoğalırlar devam edecektir, ya da sürece ...

Tartışmalar

Tükürük disfonksiyon, Sjögren sendromundan muzdarip olanlar için yaşam kalitesinin yanı sıra tükürük bezlerine bitişik kanserler için radyasyon terapisi^{3,4,5, 16 yaşında}. Bu hastalar tedavi etmek için bir önerilen terapi fonksiyonel tükürük kök hücreleri veya organoids içinde vitro, daha sonra etkilenen doku⁹yerine hasarlı tükürük bezi içine ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm culture dishes	Thermo Scientific	172931
15 mL conical tubes	Thermo Scientific	339651
50 mL conical tubes	Thermo Scientific	339653
Bronchial Epithelial Cell Growth Media	Lonza	CC-3171	Add bullet kit as per manufacturer's instructions. Supplement with 20 mL of charcoal stripped serum.
Cell strainer 70 µm nylon mesh	Fisher	22-363-548
Charcoal stripped fetal bovine serum	Gibco	12676-029
Collagenase type III	Worthington	LS004182	Store at 4 °C.
Cryogenic Tube	Fisher	5000-0020
Dispase	Cell Applications	07923	Dissolve collagenase to make a 0.15% (w/v) stock. Filter sterilize then store at -20 °C.
Dissecting scissors	Fisher	08-940
Dulbecco phosphate buffered saline	Corning	55-031-PC
General Chemicals	Sigma
PathClear Basement membrane extract	Cultrex	3432-005-01	Thaw at 4 °C at least 24 hr prior to use. Always handle on ice.
Six-well culture dishes	Falcon	353046
Surgical forceps	Fisher	22-079-742
Trypsin-EDTA solution	Corning	25-052-CI