Aislamiento de células epiteliales salivales de glándulas salivales humanas para el crecimiento in vitro como salisferas o monocapas

Resumen

Presentamos un método para aislar y cultivar células epiteliales derivadas de glándulas salivales humanas primarias. Estas células exhiben patrones de expresión génica consistentes con que son de origen epitelial salival y pueden ser cultivadas como salisferas en matrices de membranas de sótano derivadas de células tumorales Engelbreth-Holm-Swarm o como monocapas en platos de cultivo tratados.

Resumen

Las glándulas salivales son un sitio de interés significativo para los investigadores interesados en múltiples aspectos de la enfermedad humana. Uno de los objetivos de los investigadores es restaurar la función de las glándulas dañadas por las radioterapias o debido a patologías asociadas con el síndrome de Sjogren. Un segundo objetivo de los investigadores es definir los mecanismos por los cuales los virus se replican dentro del tejido glandular donde luego pueden obtener acceso a fluidos salivales importantes para la transmisión horizontal. Estos objetivos ponen de relieve la necesidad de un modelo de glándula salival in vitro robusto y accesible que pueda ser utilizado por investigadores interesados en lo mencionado anteriormente, así como áreas de investigación relacionadas. Aquí discutimos un protocolo simple para aislar las células epiteliales de las glándulas salivales humanas y propagarlas in vitro. Nuestro protocolo se puede optimizar aún más para satisfacer las necesidades de los estudios individuales. Brevemente, el tejido salival se separa mecánica y enzimáticamente para aislar células individuales o pequeños grupos de células. La selección de células epiteliales se produce mediante el enchapado en una matriz de membrana de sótano en presencia de medios optimizados para promover el crecimiento de células epiteliales. Estos cultivos resultantes pueden mantenerse como racimos tridimensionales, llamados "salisferas", o crecer como monocapa en platos de cultivo de tejidos plásticos tratados. Este protocolo resulta en el crecimiento de una población heterogénea de células principalmente epiteliales que se pueden propagar para 5-8 pasajes (15-20 duplicaciones de población) antes de someterse a senescencia celular.

Introducción

En los mamíferos, las glándulas salivales se organizan en 3 pares de glándulas salivales principales: las glándulas parótidas, submandibulares y sublinguales. También existe una serie de glándulas menores ubicadas en la lengua y dispersas por toda la cavidad oral¹. Las glándulas principales son responsables del volumen mayor de saliva producida². Además de proporcionar protección antimicrobiana a través de factores secretos, la saliva es importante en el proceso de masticar y lubricar los alimentos a medida que pasa a través del esófago². Como tal, la disfunción de la glándula salival representa un problema médico donde los enfermos que son incapacesde producir suficiente saliva son más propensos a desarrollar enfermedades como caries dentales o candidiasis oral 3. Además, la reducción de la saliva da como resultado una mayor dificultad para comer y digerir los alimentos que tienen un impacto significativo en la calidad de vida.

La disfunción de la glándula salival se encuentra principalmente en pacientes que sufren del síndrome de Sjogren, un trastorno autoinmune, o en pacientes con cáncer de cabeza y cuello que se han sometido a terapia de irradiación^{3,4,5, 6}. El secretor dañado acini dentro de las glándulas como resultado de la autoinmunidad o radioterapia no se somete a la auto-renovación, lo que resulta en un paciente que vive con daños irreversibles⁶. El estudio de las glándulas salivales también ha atraído la atención o investigadores interesados en los mecanismos de la patogénesis viral. Algunos patógenos, como el citomegalovirus humano (HCMV), se replican persistentemente dentro de las glándulas salivales, lo que permite la transmisión del virus naciente a un nuevo huésped a través de la saliva^7,8. Por lo tanto, existe una necesidad insatisfecha de desarrollar modelos in vitro robustos y reproducibles de tejido de la glándula salival para abordar y entender una amplia gama de problemas médicos.

Varios modelos del sistema de glándulas salivales murinas se han utilizado como punto de partida paracomprender y caracterizar las diferentes células epiteliales que forman las glándulas salivales 9,^10. Existen diferencias obvias y importantes entre las glándulas salivales humanas y murinas^11. Más notablemente la glándula parótida humana es más grande en relación con la glándula submandibular mientras que el ratón submandibular y parótido son muy similares en tamaño^1,2,11. Si bien existen líneas celulares submandibulares humanas inmortalizadas, hay grandes preocupaciones de que las células inmortalizadas no mantengan con precisión el fenotipo del tejido primario y las preocupaciones secundarias de las que las células inmortalizadas no se derivan realmente epitelio salival en sí¹². Por estas razones hay un interés y una necesidad de estudiar el tejido salival primario de los seres humanos.

Aquí describimos un protocolo para aislar las células epiteliales primarias de las glándulas salivales humanas para el cultivo de tejidos. Nuestro protocolo se basa en las obras de Pringle et al. y Tran et al. con modificaciones realizadas para simplificar generalmente sus procedimientos^13,14. En primer lugar, mientras que el protocolo de Tran et al. requiere una larga incubación de cinco horas para digerir enzimáticamente el tejido salival, nuestro protocolo modificado ha tenido éxito con tan solo una hora de incubación, similar a la de Pringle et al. En segundo lugar, utilizamos diferentes enzimas para la digestión de los tejidos, sobre todo no usamos la trippsina como se utiliza en el protocolo original De tran et al., sino que usamos una mezcla de dispensa y colagenasa. Preferimos evitar la trippsina en los pasos iniciales de digestión como un estudio reciente sugirió que la digestión inicial del tejido salival por trippsina resulta en una menor viabilidad celular, posiblemente por la pérdida de una población rara de células madre¹⁵. Por último, cultivamos las salisferas en la superficie de la matriz de membrana del sótano (BMM) utilizando un medio disponible comercialmente formulado originalmente para la propagación de células epiteliales bronquiales. Nuestro protocolo se puede utilizar para aislar las células salivales de las glándulas parótidas, submandibulares y sublinguales. Estas células expresan la amilasa salival y otros genes salivales específicos que indican que mantienen un fenotipo similar al de las células epiteliales del acinar salival⁷. Hemos generado con éxito cultivos salivales a partir de >50 muestras primarias de tejido humano utilizando esta metodología. Además, las células salivales primarias se pueden crioreservar fácilmente para su uso en una fecha posterior.

Protocolo

Estos protocolos y estudios han sido revisados y aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Cincinnati (Federal-wide Assurance #00003152, protocolo IRB 2016-4183). El tejido salival se reseca comúnmente en muchos procedimientos quirúrgicos de cabeza y cuello y generalmente no está involucrado por el proceso maligno. Típicamente, el tejido de la glándula salival recién resecado se utiliza dentro de 2-4 h después de la extracción del paciente (Figura1A).

1. Preparación de reactivos

1. Medio de crecimiento de células epiteliales bronquiales (BEGM)
   1. Agregue componentes del kit proporcionado por el fabricante (consulte la Tabla de materiales).
   2. Lave cada tubo una vez con el soporte base para asegurar la transferencia completa de los componentes. Luego agregue carbón despojado de suero bovino fetal para hacer una concentración final de 4% de suero.
2. Tampón de lisis de glóbulos rojos (RBC)
   1. Para hacer 10x stock, añadir 40.15 g de NH₄Cl, 5.0 g de NaHCO₃, y 0.186 g de ácido etilendiaminetetraacético (EDTA) y llevar hasta un volumen final de 200 mL usando dH₂O. A continuación, filtrar el esterilizado y almacenar a 4 oC.
   2. Diluir a una concentración de trabajo de 1x en dH₂O estéril antes de su uso.
3. Solución de disociación
   1. A una botella de 100 ml de solución de dispensación (ver la Tabla de Materiales)añadir 0,15 g de colagenasa tipo III. Después de que la colagenasa se haya disuelto completamente, el filtro esteriliza la nueva solución y la alícuota. Conservar a -20oC.

2. Digestión de tejidos

1. Usando una placa de cultivo de tejido de 100 mm, mecánicamente el tejido en trozos finos de 1-2 mm detamaño utilizando tijeras de diselación autoclave esterilizadas y fórceps quirúrgicos (Figura1B,C). El tejido conectivo entre las piezas debe cortarse para garantizar una separación adecuada y facilitar la facilidad en otros pasos.
2. Añadir 6 ml de la solución de dispensa/colagenasa al tejido picado. A continuación, incubar a 37oC durante aproximadamente 30 min a 1 h.
3. Interrumpa el tejido pipeteando con una pipeta serológica de 5 ml 15-20 veces.
4. Incubar a 37oC durante otros 30 min a 1 h.
5. Repita los pasos 2.3 y 2.4 dos-tres veces más o hasta que el tejido se asemeje a un lodo y pueda pasar fácilmente a través de la abertura de la pipeta (Figura1D).
   NOTA: El tamaño inicial de la muestra de tejido y la forma en que la finura de la picadura del tejido determinará cuántas veces se necesita repetir los pasos 2.3 y 2.4. Típicamente, recibimos tejido de aproximadamente 1 cm x 1 cm de tamaño. Además, se puede monitorear la disociación del tejido usando un microscopio de cultivo de tejido invertido estándar para rastrear el progreso de la disociación celular del tejido. Pequeños racimos de células son ideales para el crecimiento inicial de células salivales como salisferas.

3. Revestimiento de pozos con matriz de membrana de sótano

NOTA: La matriz de membrana del sótano (BMM) debe descongelarse durante la noche a 4 oC el día antes de su uso. Una vez descongelado, BMM debe mantenerse constantemente en hielo o a 4 oC, ya que se solidifique rápidamente (es decir, formar un gel) a temperaturas más cálidas. Además, se debe tener cuidado si las muestras se han enfriado en hielo antes de enchapar en BMM, ya que las muestras frías "derretirán" el BMM y expondrán las células a la placa de plástico.

1. Lentamente pipetear BMM (ver la Tabla de Materiales)en cada pocal a recubrir. Distribuir uniforme y lentamente el BMM sobre el pozo.
   NOTA: Generalmente, utilizamos 500 ol por cada pozo de una placa de seis pocillos, pero este volumen se puede ajustar para su uso en otras variantes de placas como 12 pocillos o 24 pocillos, o según se desee para hidrogeles más gruesos o más delgados.
2. Incubar las placas recubiertas a 37oC durante al menos 15 minutos antes de su uso para permitir que el tiempo de la MMC se solidifique.

4. Filtrado de tejido no digerido, lisis RBC y revestimiento celular

1. Transfiera el tejido homogeneizar del paso 2.5 a un tubo cónico de 15 ml. Lave la placa una vez con 6 ml de solución salina tamponada de fosfato de Dulbecco (DPBS) para transferir las células restantes.
2. Filtrar el homogeneizado en un tubo cónico de 50 ml a través de un colador de células de malla de nylon de 70 m para eliminar el tejido no digerido. Células tensadas centrífugas durante 5 min a 500 x g.
3. Diluir 10x Tampón de lisis RBC en dH₂O estéril para hacer una solución de trabajo 1x.
4. Aspira al sobrenadante. A continuación, resuspenda el pellet celular en 10 ml de 1 búfer de lisis RBC 1x. Incubar durante 5 min a 37oC.
5. Añadir 20-25 mL de DPBS para neutralizar el tampón de lisis RBC y minimizar la lisis de las células salivales. Centrífuga durante 5 min a 500 x g.
   NOTA: Después del tratamiento con tampón de lisis RBC, el pellet celular debe ser blanco. El color rojo en el pellet indica que no todos los RBC han sido completamente lysed. Repita los pasos 4.4 a 4.5 si es necesario para la lisis completa de todo el RBC.
6. Aspira al sobrenadante. Resuspenda el pellet en 1-2 ml de BEGM por pozo y luego coloque las células resuspendidas en los pozos recubiertos con BMM. Incubar a 37oC.
7. Una vez chapadas en BMM, las células se formarán en estructuras esféricas o "salisfersferas" durante un período de 2-3 días. Las células se pueden mantener como salisferas durante unos 5-7 días antes de que el BMM comience a degradarse permitiendo que las células accedan y se adhieran al plástico y crezcan como una monocapa.

5. Suculturar las salisferas y el mantenimiento en BMM

1. Aspirar los medios de los pozos, luego añadir 1 mL de solución de dispensa/colagenasa a cada pocal e incubar a 37 oC durante 15 min o hasta que bMM se haya disuelto en su mayoría.
2. Transfiera las células a un tubo cónico de 15 ml y lave los pozos una vez con DPBS para obtener las células restantes. Centrífuga durante 5 min a 500 x g.
3. Aspira al sobrenadante. Resuspenda el pellet en 2 ml de trippsina y luego incuba a 37oC durante 15 min.
4. Neutralizar la trippsina utilizando cualquier medio completo que contenga 10% de suero. Centrífuga durante 5 min a 500 x g.
5. Aspira al sobrenadante. Resuspenda las células de DPBS para eliminar los medios residuales, la trippsina y el suero. Centrífuga durante 5 min a 500 x g.
6. Aspira al sobrenadante. Resuspenda en BEGM y placa las células resuspendidas en platos de cultivo recubiertos con BMM solidificados. Las células resuspendidas también se pueden chapar directamente en platos tratados con cultivo celular para la proliferación como monocapa. Para obtener más información sobre el crecimiento de células salivales como monocapa, ver sección 6. Las células cultivadas en BMM o en plástico deben ser alimentadas con BEGM fresco cada 2-3 días.
7. Cultivo de las células en una incubadora humidificadamantenida a 37oC con 5% de CO2.

6. Suculturar las salisferas en platos de cultivo de tejido plástico tratados

NOTA: Si mantiene las células como una monocapa en plástico, comience en este paso. El siguiente protocolo se aplica a las células que crecen en un plato de 100 mm.

1. Aspira a los medios de comunicación. Lavar una vez con DPBS para eliminar los medios residuales.
2. Añadir 2 ml de trippsina y luego incubar a 37 oC durante 15 minutos, o hasta que las células se hayan separado por completo.
3. Neutralizar la trippsina utilizando 4 ml de cualquier medio completo que contenga un 10% de suero. Transfiera las células a un tubo cónico de 15 ml.
4. Lave la placa una vez con aproximadamente 5 ml de DPBS para recoger las celdas restantes. Centrífuga durante 5 min a 500 x g.
5. Aspira al sobrenadante. Resuspenda las células en 6-10 mL de DPBS para eliminar los medios residuales.
6. Centrífuga durante 5 min a 500 x g.
7. Aspirar el sobrenadante y resuspender en BEGM. Células de placa sobre platos de cultivo de tejido plástico tratado. Alimentar con BEGM fresco cada 2-3 días.
8. Cultivo de las células en una incubadora humidificadamantenida a 37oC con 5% de CO2.

7. Criopreservación de células

NOTA: La criopreservación de células se puede lograr a partir de una suspensión de una sola célula originada de células cultivadas en salisfersfera o monocapa.

1. Cuente las células en un hematómetro para calcular la cantidad total de células presentes.
2. Centrífuga durante 5 min a 500 x g.
3. Aspira al sobrenadante. Resuspenda el pellet en BEGM con 10% de dimetilsulfóxido (DMSO). La concentración de células debe ser de 2 x 10⁶ celdas/ml a 10 x 10⁶ celdas/ml.
4. Células alícuotas en tubos de almacenamiento criogénicos estériles. Coloque los tubos en un estante de espuma aislado e incubaa a -80 oC durante la noche para congelar lentamente las células.
5. Al día siguiente, coloque los tubos en nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.
   NOTA: Las células deben descongelarse rápidamente a 37 oC. Al descongelarse, las células deben ser peletadas a 500 x g y el medio que contiene DMSO se debe eliminar antes del enchapado.

Resultados

Dos-tres días después de las células de chapado del tejido digerido en BMM, las células formarán fácilmente pequeños racimos que continuarán expandiéndose en tamaño hasta 15-20 células por racimo (Figura2A). Los desechos celulares y las células muertas desprendidas se ven típicamente y deben ser eliminados aspirando y reponiendo con medios frescos. Las células continuarán proliferando como salisferas durante unos 3-10 días, o mientras la capa ...

Discusión

La disfunción salival representa una preocupación por la calidad de vida de los que sufren el síndrome de Sjogren, así como por los que se someten a radioterapia para cánceres adyacentes a las glándulas salivales^{3,4,5, 16}. Una terapia propuesta para tratar a estos pacientes es cultivar células madre salivales funcionales u organoides in vitro, que luego se pueden insertar en la glándul...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm culture dishes	Thermo Scientific	172931
15 mL conical tubes	Thermo Scientific	339651
50 mL conical tubes	Thermo Scientific	339653
Bronchial Epithelial Cell Growth Media	Lonza	CC-3171	Add bullet kit as per manufacturer's instructions. Supplement with 20 mL of charcoal stripped serum.
Cell strainer 70 µm nylon mesh	Fisher	22-363-548
Charcoal stripped fetal bovine serum	Gibco	12676-029
Collagenase type III	Worthington	LS004182	Store at 4 °C.
Cryogenic Tube	Fisher	5000-0020
Dispase	Cell Applications	07923	Dissolve collagenase to make a 0.15% (w/v) stock. Filter sterilize then store at -20 °C.
Dissecting scissors	Fisher	08-940
Dulbecco phosphate buffered saline	Corning	55-031-PC
General Chemicals	Sigma
PathClear Basement membrane extract	Cultrex	3432-005-01	Thaw at 4 °C at least 24 hr prior to use. Always handle on ice.
Six-well culture dishes	Falcon	353046
Surgical forceps	Fisher	22-079-742
Trypsin-EDTA solution	Corning	25-052-CI