Isolierung von Speicheldrüsenepithelzellen aus menschlichen Speicheldrüsen für In-Vitro-Wachstum als Speicheldrüsen oder Monolayer

Zusammenfassung

Wir präsentieren eine Methode zur Isolierung und Kultivierung primärer menschlicher Speicheldrüsen-abgeleiteten Epithelzellen. Diese Zellen zeigen Genexpressionsmuster, die mit ihrem Epithel-Ursprung übereinstimmen und können als Salisphären auf Kellermembranmatrizen aus Engelbreth-Holm-Schwarm-Tumorzellen oder als Monolayer auf behandelten Kulturgerichten angebaut werden.

Zusammenfassung

Die Speicheldrüsen sind ein Ort von erheblichem Interesse für Forscher, die an mehreren Aspekten der menschlichen Krankheit interessiert sind. Ein Ziel der Forscher ist es, die Funktion der Drüsen wiederherzustellen, die durch Strahlentherapien oder aufgrund von Pathologien im Zusammenhang mit dem Sjögren-Syndrom geschädigt sind. Ein zweites Ziel der Forscher ist es, die Mechanismen zu definieren, durch die sich Viren im Drüsengewebe replizieren, wo sie dann Zugang zu Speicheldrüsenflüssigkeiten erhalten können, die für die horizontale Übertragung wichtig sind. Diese Ziele unterstreichen die Notwendigkeit eines robusten und zugänglichen In-vitro-Speicheldrüsenmodells, das von Forschern genutzt werden kann, die sich für die oben genannten sowie verwandten Forschungsbereiche interessieren. Hier diskutieren wir ein einfaches Protokoll, um Epithelzellen aus menschlichen Speicheldrüsen zu isolieren und sie in vitro zu vermehren. Unser Protokoll kann weiter optimiert werden, um den Anforderungen einzelner Studien gerecht zu werden. Kurz gesagt, Speicheldrüsengewebe wird mechanisch und enzymatisch getrennt, um einzelne Zellen oder kleine Zellhaufen zu isolieren. Die Auswahl für Epithelzellen erfolgt durch Beschichtung auf einer Kellermembranmatrix in Gegenwart von Medien, die optimiert sind, um das Epithelzellwachstum zu fördern. Diese resultierenden Kulturen können als dreidimensionale Cluster, als "Salisphären" bezeichnet, oder als Monolayer auf behandelten Kunststoff-Gewebekultur-Gerichten angebaut werden. Dieses Protokoll führt zum Auswuchs einer heterogenen Population hauptsächlich epitheliale Zellen, die für 5-8 Passagen (15-20 Populationsverdoppelungen) propagiert werden können, bevor sie sich einer zellulären Seneszenz unterziehen.

Einleitung

Bei Säugetieren sind die Speicheldrüsen in 3 Paare von Hauptspeicheldrüsen organisiert: die Ohrspeicheldrüsen, submandibulären und sublingualen Drüsen. Es gibt auch eine Reihe von kleineren Drüsen auf der Zunge und verstreut in der Mundhöhle¹. Die Hauptdrüsen sind verantwortlich für das Massenvolumen des erzeugten Speichels². Neben dem antimikrobiellen Schutz durch sezernierte Faktoren ist der Speichel wichtig für den Prozess des Kauens und Schmierens von Lebensmitteln, während er durch die Speiseröhre geht². Als solche, Speicheldrüsenfunktionsstörungen stellt ein medizinisches Problem, wo Betroffene, die nicht in der Lage sind, genug Speichel zu produzieren sind anfälliger für die Entwicklung von Krankheiten wie Zahnhöhlen oder orale Candidiasis³. Darüber hinaus führt reduzierter Speichel zu größeren Schwierigkeiten beim Essen und Verdauen von Lebensmitteln, die einen erheblichen Einfluss auf die Lebensqualität haben.

Speicheldrüsenfunktionsstörungen finden sich vor allem bei Patienten mit Sjögren-Syndrom, einer Autoimmunerkrankung oder bei Patienten mit Kopf- und Nackenkrebs, die einer Bestrahlungstherapie unterzogen wurden^{3,4,5, 6}. Beschädigte sekretotische Acini in den Drüsen als Folge von Autoimmunität oder Strahlentherapie unterziehen sich keiner Selbsterneuerung, was dazu führt, dass ein Patient mit irreversiblen Schäden lebt⁶. Die Untersuchung von Speicheldrüsen hat auch die Aufmerksamkeit oder Forscher, die an Mechanismen der viralen Pathogenese interessiert. Einige Krankheitserreger, wie das menschliche Zytomegalievirus (HCMV), replizieren sich hartnäckig innerhalb der Speicheldrüsen, was dann die Übertragung des entstehenden Virus auf einen neuen Wirt über Speichel^7,8ermöglicht. Daher besteht ein unerfülltes Bedürfnis, robuste und reproduzierbare In-vitro-Modelle von Speicheldrüsengewebe zu entwickeln, um eine Vielzahl medizinischer Probleme anzugehen und zu verstehen.

Mehrere Modelle des murinen Speicheldrüsensystems wurden als Ausgangspunkt verwendet, um die verschiedenen Epithelzellen zu verstehen und zu charakterisieren, die die Speicheldrüsen^9,10bilden. Es gibt offensichtliche und große Unterschiede zwischen menschlichen und murinen Speicheldrüsen¹¹. Vor allem die menschliche Ohrspeicheldrüse ist größer im Verhältnis zur submandibulären Drüse, während die Maus submanddibuläre und Ohrspeicheldrüse sind viel ähnlich in Größe^1,2,11. Während verewigte menschliche submandibuläre Zelllinien existieren, gibt es große Bedenken, dass die verewigten Zellen den Phänotyp des primären Gewebes nicht genau aufrechterhalten, und sekundäre Bedenken, dass die verewigten Zellen nicht tatsächlich von Speichelepithel selbst¹². Aus diesen Gründen gibt es ein Interesse und die Notwendigkeit, primäre speicheldrüsengewebe vom Menschen zu studieren.

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Isolierung primärer Epithelzellen aus menschlichen Speicheldrüsen für die Gewebekultur. Unser Protokoll basiert auf den Arbeiten von Pringle et al. und Tran et al. mit Änderungen, die vorgenommen wurden, um ihre Verfahren generell zu vereinfachen^13,14. Erstens: Während das Protokoll von Tran et al. eine lange fünfstündige Inkubation zur enzymatischen Verdauung des Speicheldrüsengewebes fordert, war unser modifiziertes Protokoll mit nur einer Stunde Inkubation erfolgreich, ähnlich wie in Pringle et al. Zweitens verwenden wir verschiedene Enzyme für die Gewebeverdauung, vor allem verwenden wir Trypsin nicht, wie es im ursprünglichen Tran et al.-Protokoll verwendet wird, sondern verwenden eine Mischung aus Dispase und Kollagennase. Wir ziehen es vor, Trypsin in den ersten Verdauungsschritten zu vermeiden, da eine aktuelle Studie nahelegte, dass die Erstverdauung des Speichelgewebes durch Trypsin zu einer verminderten Zelllebensfähigkeit führt, möglicherweise durch den Verlust einer seltenen Stammzellpopulation¹⁵. Schließlich bewirtschaften wir die Salisphären auf der Oberfläche der Kellermembranmatrix (BMM) mit einem kommerziell erhältlichen Medium, das ursprünglich für die Ausbreitung von Bronchialepithelzellen entwickelt wurde. Unser Protokoll kann verwendet werden, um Speicheldrüsenzellen aus Ohrspeicheldrüsen, submandibulären und sublingualen Drüsen zu isolieren. Diese Zellen drücken Speicheldrüsenamylase und andere Speicheldrüsen-spezifische Gene aus, was darauf hindeutet, dass sie einen Phänotyp beibehalten, der dem von Speicheldrüsen-Acinar-Epithelzellen^{ähnelt 7}. Mit dieser Methode haben wir erfolgreich Speicheldrüsenkulturen aus >50 primären menschlichen Gewebeproben erzeugt. Darüber hinaus können die primären Speicheldrüsenzellen leicht kryokonserviert werden, um sie zu einem späteren Zeitpunkt zu verwenden.

Protokoll

Diese Protokolle und Studien wurden vom Institutional Review Board der Universität Cincinnati überprüft und genehmigt (Federal-wide Assurance #00003152, IRB-Protokoll 2016-4183). Speichelgewebe wird häufig in vielen Kopf-und Hals chirurgische nusziert und ist in der Regel unbeteiligtdurcht durch den bösartigen Prozess. Typischerweise wird frisch resektiertes Speicheldrüsengewebe innerhalb von 2-4 h nach der Entfernung vom Patienten verwendet (Abbildung 1A).

1. Reagenz-Vorbereitung

1. Bronchialepitheliale Zellwachstumsmedium (BEGM)
   1. Fügen Sie Komponenten aus dem vom Hersteller bereitgestellten Kit hinzu (siehe Tabelle der Materialien).
   2. Waschen Sie jedes Rohr einmal mit dem Basismedium, um eine vollständige Übertragung der Komponenten zu gewährleisten. Dann fügen Sie Holzkohle abgestreift fetales Rinderserum, um eine endgültige Konzentration von 4% Serum zu machen.
2. Red Blood Cell (RBC) Lysepuffer
   1. Um 10x Lager zu machen, fügen Sie 40,15 g NH₄Cl, 5,0 g NaHCO₃und 0,186 g Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) hinzu und bringen bis zu einem Endvolumen von 200 ml mit dH₂O. Dann sterilisieren und bei 4 °C lagern.
   2. Vor der Anwendung auf eine Arbeitskonzentrationvon 1x in sterilem dH2 O verdünnen.
3. Dissoziationslösung
   1. Zu einer 100 ml Flasche Dispase-Lösung (siehe Materialtabelle) 0,15 g Kollagenase Typ III hinzufügen. Nachdem sich die Kollagenase vollständig aufgelöst hat, sterilisieren Filter die neue Lösung und aliquot. Bei -20 °C lagern.

2. Gewebeverdauung

1. Mit einer 100-mm-Gewebekulturplatte wird das Gewebe mit autoklavensterilisierten Sezierenscheren und chirurgischen Zangen mechanisch in feine Stücke mit einer Größe von 1-2 mm zerkleinern (Abbildung 1B,C). Das Bindegewebe zwischen den Teilen sollte geschnitten werden, um eine ordnungsgemäße Trennung zu gewährleisten und in weiteren Schritten zu erleichtern.
2. 6 ml der Dispase/Kollagenase-Lösung in das gehackte Gewebe geben. Dann bei 37 °C ca. 30 min bis 1 h inkubieren.
3. Stören Sie das Gewebe durch Pipettieren mit einer 5 ml serologischen Pipette 15-20 Mal.
4. Bei 37 °C weitere 30 min bis 1 h inkubieren.
5. Wiederholen Sie die Schritte 2.3 und 2.4 zwei-drei mal oder bis das Gewebe einer Gülle ähnelt und leicht durch die Pipettenöffnung passieren kann (Abbildung 1D).
   HINWEIS: Die Anfangsgröße der Gewebeprobe und wie feine Gewebeminzeder bestimmen, wie oft man die Schritte 2.3 und 2.4 wiederholen muss. Typischerweise erhalten wir Gewebe ca. 1 cm x 1 cm Größe. Zusätzlich kann man die Gewebedissoziation mit einem Standard-Invertierten Gewebekulturmikroskop überwachen, um den Fortschritt der Zelldissoziation vom Gewebe zu verfolgen. Kleine Zellhaufen sind ideal für das anfängliche Auswachsen von Speicheldrüsenzellen als Speichelsphären.

3. Beschichtung von Brunnen mit Kellermembranmatrix

HINWEIS: Die Kellermembranmatrix (BMM) sollte am Tag vor ihrer Verwendung über Nacht bei 4 °C aufgetaut werden. Nach dem Auftauen sollte BMM ständig auf Eis oder bei 4 °C gehalten werden, da es sich bei wärmeren Temperaturen schnell erstarren (d. h. ein Gel bilden) wird. Darüber hinaus ist Vorsicht geboten, wenn Proben vor der Beschichtung auf BMM auf Eis gekühlt wurden, da kalte Proben das BMM "schmelzen" und Zellen der Kunststoffschale aussetzen.

1. Langsam Pipette BMM (siehe Materialtabelle) in jeden zu beschichtenden Brunnen. Gleichmäßig und langsam verteilen Sie das BMM über den Brunnen.
   HINWEIS: Im Allgemeinen verwenden wir 500 l pro Bohrgut einer Sechs-Brunnen-Platte, aber dieses Volumen kann für den Einsatz auf anderen Varianten von Platten wie 12-Well oder 24-Well oder nach Bedarf für dickere oder dünnere Hydrogele eingestellt werden.
2. Inkubieren Sie die beschichteten Platten mindestens 15 min bei 37 °C, bevor Sie sie verwenden, damit sich die BMM-Zeit erstarren kann.

4. Filterung von unverdautem Gewebe, RBC-Lyse und Zellbeschichtung

1. Gewebe homogenisieren von Schritt 2,5 auf ein 15 ml konisches Rohr. Waschplatte einmal mit 6 ml Dulbecco Phosphat gepufferte Kochchen (DPBS) zu übertragen verbleibenden Zellen.
2. Filtern Sie das Homogenat durch ein 70 m sm Nylon-Netzzellensieb in ein 50 ml konisches Rohr, um unverdautes Gewebe zu entfernen. Zentrifugen-gespannte Zellen für 5 min bei 500 x g.
3. 10x RBC-Lysepuffer in sterilem dH₂O verdünnen, um eine 1x Arbeitslösung herzustellen.
4. Aspirieren Sie den Überstand. Setzen Sie das Zellpellet dann in 10 ml 1x RBC-Lysepuffer wieder aus. 5 min bei 37 °C inkubieren.
5. Fügen Sie 20-25 ml DPBS hinzu, um den RBC-Lysepuffer zu neutralisieren und die Lyse von Speicheldrüsenzellen zu minimieren. Zentrifuge für 5 min bei 500 x g.
   HINWEIS: Nach der Behandlung mit RBC-Lysepuffer sollte das Zellpellet weiß sein. Rote Farbe im Pellet zeigt an, dass nicht alle RBC vollständig lysiert wurden. Wiederholen Sie die Schritte 4.4 bis 4.5, falls erforderlich, um die vollständige Lyse aller RBC zu lysieren.
6. Aspirieren Sie den Überstand. Das Pellet in 1-2 ml BEGM pro Brunnen wieder aufsetzen und resuspendierte Zellen auf BMM-beschichtete Bohrungen legen. Bei 37 °C inkubieren.
7. Einmal auf BMM plattiert, bilden sich Zellen über einen Zeitraum von 2-3 Tagen zu sphärischen Strukturen oder "Salisphären". Zellen können als Salisphären für etwa 5-7 Tage gehalten werden, bevor das BMM zu abbauen beginnt, so dass die Zellen auf den Kunststoff zugreifen und haften und als Monolayer wachsen.

5. Unterkultivierung der Speichelsphären und Wartung auf BMM

1. Saugen Sie Medien aus Brunnen, fügen Sie dann 1 ml Dispase/Kollagenase-Lösung zu jedem Brunnen und inkubieren bei 37 °C für 15 min oder bis BMM sich weitgehend aufgelöst hat.
2. Übertragen Sie Zellen in ein 15 ml konisches Rohr und waschen Sie Brunnen einmal mit DPBS, um verbleibende Zellen zu erhalten. Zentrifuge für 5 min bei 500 x g.
3. Aspirieren Sie den Überstand. Das Pellet in 2 ml Trypsin wieder aufhängen und dann bei 37 °C für 15 min inkubieren.
4. Neutralisieren Sie das Trypsin mit allen vollständigen Medien, die 10% Serum enthalten. Zentrifuge für 5 min bei 500 x g.
5. Aspirieren Sie den Überstand. Unterbrechen Sie die Zellen in DPBS, um Restmedien, Trypsin und Serum zu entfernen. Zentrifuge für 5 min bei 500 x g.
6. Aspirieren Sie den Überstand. In BEGM aufsetzen und die resuspendierten Zellen auf erstarrte BMM-beschichtete Kulturgerichte aufgeben. Resuspendierte Zellen können auch direkt auf zellkulturbehandelte Gerichte zur Proliferation als Monoschicht plattiert werden. Weitere Informationen zum Wachstum von Speicheldrüsenzellen als Monoschicht finden Sie in Abschnitt 6. Zellen, die auf BMM oder auf Kunststoff angebaut werden, sollten alle 2–3 Tage mit frischem BEGM gefüttert werden.
7. Kultur die Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei37 °C mit 5% CO2 gehalten.

6. Subkulieren der Speichelsphären auf behandelten Kunststoff-Gewebekultur-Gerichte

HINWEIS: Wenn Sie Zellen als Monolayer auf Kunststoff beibehalten, beginnen Sie mit diesem Schritt. Das folgende Protokoll gilt für Zellen, die in einer 100-mm-Schale wachsen.

1. Aspirieren Sie die Medien. Einmal mit DPBS waschen, um Restmedien zu entfernen.
2. Fügen Sie 2 ml Trypsin hinzu und inkubieren Sie dann bei 37 °C für 15 min, oder bis sich die Zellen vollständig gelöst haben.
3. Neutralisieren Sie Trypsin mit 4 ml aller vollständigen Medien, die 10% Serum enthalten. Übertragen Sie Zellen in ein 15 ml konisches Rohr.
4. Waschen Sie die Platte einmal mit ca. 5 ml DPBS, um verbleibende Zellen zu sammeln. Zentrifuge für 5 min bei 500 x g.
5. Aspirieren Sie den Überstand. Resuspend Zellen in 6-10 ml DPBS, um Restmedien zu entfernen.
6. Zentrifuge für 5 min bei 500 x g.
7. Aspirieren Sie den Überstand und suspendieren Sie in BEGM. Plattenzellen auf behandelte Kunststoff-Gewebekultur-Gerichte. Füttern Sie alle 2-3 Tage mit frischem BEGM.
8. Kultur die Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei37 °C mit 5% CO2 gehalten.

7. Kryokonservierung von Zellen

HINWEIS: Die Kryokonservierung von Zellen kann aus einer Einzelzellsuspension erfolgen, die entweder aus Salisphären- oder monolayern zellenischen Zellen stammt.

1. Zählen Sie die Zellen auf einem Hämatozytometer, um die Gesamtmenge der vorhandenen Zellen zu berechnen.
2. Zentrifuge für 5 min bei 500 x g.
3. Aspirieren Sie den Überstand. Das Pellet in BEGM mit 10% Dimethylsulfoxid (DMSO) wieder aufsetzen. Die Konzentration der Zellen sollte 2 x 10⁶ Zellen/ml bis 10 x 10⁶ Zellen/ml betragen.
4. Aliquot-Zellen in sterile kryogene Speicherröhrchen. Die Rohre in ein isoliertes Schaumgestell legen und bei -80 °C über Nacht brüten, um die Zellen langsam einzufrieren.
5. Legen Sie am nächsten Tag Rohre in flüssigen Stickstoff für die Langzeitlagerung.
   HINWEIS: Zellen sollten bei 37 °C schnell aufgetaut werden. Beim Auftauen sollten die Zellen mit 500 x g pelletiert und das DMSO-haltige Medium vor der Beschichtung entfernt werden.

Ergebnisse

Zwei-drei Tage nach der Beschichtung von Zellen aus verdautem Gewebe auf BMM bilden Zellen leicht kleine Cluster, die sich weiterhin in der Größe von bis zu 15-20 Zellen pro Cluster ausdehnen werden (Abbildung 2A). Zelluläre Trümmer und abgetrennte abgestorbene Zellen sind in der Regel zu sehen und sollten durch Ansaugen und Auffüllen mit frischen Medien entfernt werden. Zellen werden sich als Salisphären für etwa 3-10 Tage weiter ausbreiten, oder sola...

Diskussion

Salivary Dysfunktion stellt ein Anliegen für die Lebensqualität für diejenigen, die mit Sjögren-Syndrom sowie diejenigen, die Strahlentherapie für Krebse neben den Speicheldrüsen^{3,4,5, 16}. Eine vorgeschlagene Therapie zur Behandlung dieser Patienten ist das Anwachsen funktioneller Speichelstammzellen oder Organoide in vitro, die dann in beschädigte Speicheldrüse eingeführt werden kön...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm culture dishes	Thermo Scientific	172931
15 mL conical tubes	Thermo Scientific	339651
50 mL conical tubes	Thermo Scientific	339653
Bronchial Epithelial Cell Growth Media	Lonza	CC-3171	Add bullet kit as per manufacturer's instructions. Supplement with 20 mL of charcoal stripped serum.
Cell strainer 70 µm nylon mesh	Fisher	22-363-548
Charcoal stripped fetal bovine serum	Gibco	12676-029
Collagenase type III	Worthington	LS004182	Store at 4 °C.
Cryogenic Tube	Fisher	5000-0020
Dispase	Cell Applications	07923	Dissolve collagenase to make a 0.15% (w/v) stock. Filter sterilize then store at -20 °C.
Dissecting scissors	Fisher	08-940
Dulbecco phosphate buffered saline	Corning	55-031-PC
General Chemicals	Sigma
PathClear Basement membrane extract	Cultrex	3432-005-01	Thaw at 4 °C at least 24 hr prior to use. Always handle on ice.
Six-well culture dishes	Falcon	353046
Surgical forceps	Fisher	22-079-742
Trypsin-EDTA solution	Corning	25-052-CI