从人类唾液腺中分离唾液表皮细胞,作为脂质层或单层体进行体外生长

摘要

我们提出了一种分离和培养人类原发性唾液腺衍生上皮细胞的方法。这些细胞表现出与唾液上皮起源一致的基因表达模式,可以在从恩格尔布雷斯-霍尔姆-肖温肿瘤细胞中提取的基底膜基质上作为盐层生长,或作为治疗培养皿上的单层细胞生长。

摘要

唾液腺是对人类疾病多方面感兴趣的研究人员非常感兴趣的场所。研究人员的目标之一是恢复因放射治疗或与Sjögren综合征相关的病理而受损的腺体的功能。研究人员的第二个目标是确定病毒在腺组织内复制的机制,然后它们能够获得对水平传播至关重要的唾液。这些目标突出表明,需要一种强大且易于获取的体外唾液腺模型,供对上述相关研究领域感兴趣的研究人员使用。在这里,我们讨论一个简单的协议,从人类唾液腺分离上皮细胞,并在体外繁殖它们。我们的协议可以进一步优化,以满足个别研究的需要。简单地说,唾液组织是机械和酶分离,以分离单个细胞或小簇细胞。上皮细胞的选择是在存在经过优化以促进上皮细胞生长的介质的情况下,电镀到基底膜基质上。这些生成的培养物可以作为三维簇,称为"盐层",或作为经处理的塑料组织培养皿的单层生长。该协议导致主要上皮细胞的异质种群的生长,在接受细胞衰老之前,可以繁殖5-8个通道(15-20个种群翻倍)。

引言

在哺乳动物中,唾液腺被组织成3对主要的唾液腺:小黄体、亚黄土和亚语言腺。也有一系列小腺位于舌头上,分散在整个口腔1。主要腺体负责产生的唾液的体积2。除了通过分泌因子提供抗菌保护外,唾液在咀嚼和润滑食物的过程中也非常重要,因为它通过食道2。因此,唾液腺功能障碍是一个医疗问题,患者谁不能产生足够的唾液更容易发展疾病,如蛀牙或口腔念珠菌^病3。此外,唾液减少会导致饮食和消化食物更加困难,对生活质量有显著影响。

唾液腺功能障碍主要发生在患有Sjögren综合征(一种自身免疫性疾病)的患者中,或在接受辐照治疗3、4、5的头部和颈部癌症^{患者中。 6}.由于自身免疫或放射治疗,腺体内受损的分泌性腺体不进行自我更新,导致患者生活在不可逆转的损害6。唾液腺的研究也引起了人们对病毒发病机制的关注或研究人员的关注。一些病原体,如人类巨细胞病毒(HCMV),在唾液腺内持续复制,然后允许通过唾液7、8将新生病毒传染给新的宿主。因此,开发健壮且可重复的唾液腺组织体外模型,以解决和理解各种医疗问题,是未满足的需求。

几个模型的鼠唾腺系统已被用作一个起点,了解和表征不同的上皮细胞,形成唾液腺9,10。人与鼠唾液腺11之间存在明显和重大的差异。最值得注意的是,人类的副体腺体相对于亚曼地腺体较大,而小鼠的亚曼底和花环在大小1、2、11上非常相似。虽然存在不朽的人类亚曼地状细胞系,但人们主要担心永生细胞不能准确维持主要组织的表型,二者担心永生细胞实际上并非来自唾液上皮^本身12。由于这些原因,人们有兴趣和需要研究人类的主要唾液组织。

研究方案

辛辛那提大学机构审查委员会(联邦范围的保障#00003152,IRB 协议 2016-4183) 对这些协议和研究进行了审查和批准。唾液组织通常在许多头部和颈部手术中被切除,并且通常不参与恶性过程。通常,从患者中取出后2-4小时内使用新切除的唾液腺组织(图1A)。

1. 试剂制备

1. 支气管上皮细胞生长培养基 (BEGM)
   1. 从制造商提供的套件中添加组件(参见材料表)。
   2. 用基材清洗每个管一次,以确保部件完全转移。然后加入木炭剥离胎儿牛血清,使最终浓度为4%的血清。
2. 红血球 (RBC) 莱沙缓冲液
   1. 要生产10x库存,加入40.15克NH₄Cl、5.0 g NaHCO₃和0.186克乙烯二甲乙酸(EDTA),并使用dH2 O提供200 mL的最终体积。然后过滤消毒,并储存在4°C。
   2. 使用前,在无菌 dH₂O 中稀释至工作浓度为 1 倍的工作浓度。
3. 分离解
   1. 在100 mL瓶的消胶溶液(见材料表)中加入0.15克的胶原酶III型。胶原酶完全溶解后,过滤灭菌新溶液并计分。储存在-20°C。

2. 组织消化

1. 使用100毫米组织培养板,使用高压灭菌消毒解剖剪刀和手术钳(图1B,C),机械地将组织切成1-2毫米的细片。应切割片之间的结缔组织,以确保适当的分离和在进一步的步骤中轻松。
2. 将6 mL的消酶/胶原酶溶液加入切碎的组织。然后在37°C孵育约30分钟至1小时。
3. 使用 5 mL 血清移液器移液 15-20 次,破坏组织。
4. 在 37°C 孵育 30 分钟到 1 小时。
5. 重复步骤2.3和2.4两三次,或直到组织类似于浆料,并可以很容易地通过移液器开口(图1D)。
   注:组织标本的起始大小以及组织切片的细度将决定需要重复步骤 2.3 和 2.4 的次数。通常,我们接收的组织约 1 厘米 x 1 厘米的大小。此外,可以使用标准倒置组织培养显微镜监测组织分离,以跟踪细胞与组织分离的进度。小细胞簇是唾液细胞作为盐层的初始生长的理想选择。

3. 用基底膜基质涂井

注:基底膜基质(BMM)应在使用前一天4°C解冻过夜。一旦解冻,BMM应持续保持在冰上或4°C,因为它将在较温暖的温度下迅速凝固(即形成凝胶)。此外,如果样品在BMM上电镀之前在冰上冷藏,应小心谨慎,因为冷样品会"融化"BMM,并将细胞暴露到塑料盘上。

1. 慢慢地移液BMM(见材料表)进入每个井进行涂布。均匀且缓慢地将 BMM 分布在井上。
   注:通常,我们每口六孔板使用500 μL,但此体积可调整为用于12孔或24孔板的其他型号,或用于较厚或更薄的水凝胶。
2. 在使用前至少15分钟在37°C下孵育涂层板,使BMM时间凝固。

4. 过滤未消化的组织、RBC解说和细胞电镀

1. 将组织均质从步骤2.5转移到15 mL锥形管。洗板一次与6 mL的Dulbeco的磷酸盐缓冲盐水(DPBS)转移剩余的细胞。
2. 通过 70 μm 尼龙网状细胞过滤器将均质化成 50 mL 锥形管,以去除未消化的组织。在500 x g下离心使细胞离心5分钟。
3. 在无菌 dH₂O 中稀释 10 倍 RBC 解液缓冲液,以做出 1x 工作溶液。
4. 吸气上清液。然后重新悬浮细胞颗粒在10 mL的1xRBC赖沙缓冲液。在37°C下孵育5分钟。
5. 加入20-25 mL的DPBS中和红着红细胞赖沙缓冲液,并尽量减少唾液细胞的赖沙。在500 x g下离心5分钟。
   注:使用RBC莱沙缓冲液治疗后,细胞颗粒应为白色。颗粒中的红色表示并非所有 RBC 都已完全分丝。如果需要完成所有 RBC 的分莱,请重复步骤 4.4 到 4.5。
6. 吸气上清液。将颗粒重新悬浮在每口井的 BEGM 的 1-2 mL 中,然后将重新悬浮的细胞放入 BMM 涂层的井中。在37°C孵育。
7. 一旦在BMM上镀层,细胞将在2-3天内形成球形结构或"水球"。在BMM开始降解之前,细胞可以作为盐球维持约5-7天,使细胞能够进入并粘附在塑料上,并作为单层体生长。

5. 对沙地层进行分栽,并维护BMM

1. 从井中吸出培养基,然后向每口井中加入1 mL的消泡/胶原酶溶液,并在37°C孵育15分钟或直到BMM大部分溶解。
2. 将细胞转移到15 mL锥形管中,用DPBS洗水井一次,以获得剩余的细胞。在500 x g下离心5分钟。
3. 吸气上清液。将颗粒重新悬浮在2 mL的胰蛋白酶中,然后在37°C孵育15分钟。
4. 使用含有10%血清的任何完整培养剂中和胰蛋白酶。在500 x g下离心5分钟。
5. 吸气上清液。重新悬浮DPBS中的细胞,以去除残留的培养液、胰蛋白酶和血清。在500 x g下离心5分钟。
6. 吸气上清液。在 BEGM 中重新悬浮,并将重新悬浮的细胞盘到凝固的 BMM 涂层培养皿上。再悬浮的细胞也可以直接镀在细胞培养皿上,作为单层进行增殖。有关唾液细胞作为单层生长的更多信息,请参阅第 6 节。在BMM或塑料上生长的细胞应每2~3天喂食一次新鲜的BEGM。
7. 培养在加湿培养箱中的细胞保持在37°C与5%CO2。

6. 在经过处理的塑料组织培养皿上对沙地球进行分栽

注:如果将细胞作为单层在塑料上保持,则从此步骤开始。以下协议适用于在100毫米盘中生长的细胞。

1. 吸气介质。用 DPBS 清洗一次以去除残余介质。
2. 加入2 mL的胰蛋白酶,然后在37°C孵育15分钟,或直到细胞完全分离。
3. 使用含有10%血清的任何完整培养剂使用4 mL中和胰蛋白酶。将细胞转移到15 mL锥形管中。
4. 用大约 5 mL 的 DPBS 清洗一次板以收集剩余的细胞。在500 x g下离心5分钟。
5. 吸气上清液。在 DPBS 的 6-10 mL 中重新悬浮细胞以去除残余介质。
6. 在500 x g下离心5分钟。
7. 吸出上清液,并在 BEGM 中重新悬浮。将细胞盘到经过处理的塑料组织培养皿上。每 2-3 天喂一次新鲜的 BEGM。
8. 培养在加湿培养箱中的细胞保持在37°C与5%CO2。

7. 细胞冷冻保存

注:细胞的冷冻保存可以从源自盐层或单层生长细胞的单细胞悬浮液中完成。

1. 计算造血细胞仪上的细胞,以计算存在的细胞总量。
2. 在500 x g下离心5分钟。
3. 吸气上清液。用10%二甲基亚硫酸盐(DMSO)在BEGM中重新悬浮颗粒。细胞的浓度应为2 x 10⁶细胞/mL至10 x 10⁶细胞/mL。
4. 将异位细胞放入无菌低温储存管中。将管子放在绝缘泡沫架中,在-80°C孵育过夜,缓慢冻结细胞。
5. 第二天,将管子放入液氮中进行长期储存。
   注:细胞应在37°C处快速解冻。解冻后,应在500 x g处颗粒,并在电镀前去除含DMSO的介质。

结果

在将细胞从消化组织电镀到BMM后两三天,细胞将很容易形成小簇,每个簇的大小将继续扩大至15-20个细胞(图2A)。通常可以看到细胞碎片和分离的死细胞,应通过吸气和补充新鲜介质来清除。细胞将继续增殖为盐层约3-10天,或只要BMM层保持完整。有时,由于BMM的部分分解,细胞将附着在底层塑料上,并开始增殖为单层。生长在BMM上的盐层在尺寸和结构复杂性方?...

讨论

唾液功能障碍代表了对Sjögren综合征患者以及接受唾液腺3、4、5附近癌症放射治疗的人的生活质量的关注。 ¹⁶.治疗这些病人的一种建议疗法是在体外生长功能性唾液干细胞或器官,然后可以插入受损的唾液腺,以取代受影响的组织9。此外,唾液腺通常是人类病原体的持久性和传播的场所...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm culture dishes	Thermo Scientific	172931
15 mL conical tubes	Thermo Scientific	339651
50 mL conical tubes	Thermo Scientific	339653
Bronchial Epithelial Cell Growth Media	Lonza	CC-3171	Add bullet kit as per manufacturer's instructions. Supplement with 20 mL of charcoal stripped serum.
Cell strainer 70 µm nylon mesh	Fisher	22-363-548
Charcoal stripped fetal bovine serum	Gibco	12676-029
Collagenase type III	Worthington	LS004182	Store at 4 °C.
Cryogenic Tube	Fisher	5000-0020
Dispase	Cell Applications	07923	Dissolve collagenase to make a 0.15% (w/v) stock. Filter sterilize then store at -20 °C.
Dissecting scissors	Fisher	08-940
Dulbecco phosphate buffered saline	Corning	55-031-PC
General Chemicals	Sigma
PathClear Basement membrane extract	Cultrex	3432-005-01	Thaw at 4 °C at least 24 hr prior to use. Always handle on ice.
Six-well culture dishes	Falcon	353046
Surgical forceps	Fisher	22-079-742
Trypsin-EDTA solution	Corning	25-052-CI