בידוד של תאים אפיתל הרוק מן הרוק בלוטות האדם עבור צמיחה מחוץ לתחום כמו סאליספירות או Monolayers

Summary

אנו מציגים שיטה לבידוד וטיפוח תאים האפיתל בלוטת הרוק העיקרי של האדם. תאים אלה התערוכה ביטוי גנים דפוסי עקבי עם אותם להיות של מוצא האפיתל הרוק ניתן לגדל כמו כדורי הריר על מטריצות קרום מרתף נגזר אנגלברב-הולם-בתאי הגידול נחיל או כמו monolayers על מנות תרבות מטופלים.

Abstract

בלוטות הרוק הם אתר של עניין משמעותי עבור החוקרים המעוניינים היבטים מרובים של המחלה האנושית. מטרה אחת של החוקרים היא לשחזר פונקציה של בלוטות ניזוק על ידי טיפולים קרינה או עקב הפתווגיות הקשורים תסמונת Sjöגרנה. המטרה השנייה של חוקרים היא להגדיר את המנגנונים שבהם וירוסים לשכפל בתוך רקמת הבלוטות שבו הם יכולים לקבל גישה נוזלי הרוק חשוב עבור הילוכים אופקית. מטרות אלה להדגיש את הצורך חזק ונגיש במודל בלוטת הרוק מבחנה שיכול להיות מנוצל על ידי חוקרים המעוניינים המוזכרים לעיל, כמו גם אזורי מחקר קשורים. כאן אנו דנים פרוטוקול פשוט כדי לבודד תאים אפיתל מבלוטות הרוק האנושי להפיץ אותם בתוך מבחנה. הפרוטוקול שלנו יכול להיות ממוטב נוסף כדי לענות על הצרכים של מחקרים אישיים. בקצרה, רקמת הרוק היא מכנית ואנזימטי מופרדים כדי לבודד תאים בודדים או אשכולות קטנים של תאים. בחירה עבור תאים אפיתל מתרחשת על ידי ציפוי על מטריצה קרום המרתף בנוכחות של מדיה אופטימיזציה לקידום צמיחת תאים אפיתל. ניתן לתחזק את התרבויות הללו כאשכולות תלת-ממדיים, הנקראת "כדורי הערבה", או לגדול כמונאולייר על מנות תרבות של רקמה פלסטית. פרוטוקול זה מביא את הצמיחה של אוכלוסיית הטרוגניים בעיקר תאים אפיתל שניתן להפיץ עבור 5-8 מעברים (15-20 האוכלוסייה טווח) לפני שעברו הזדקנות הסלולר.

Introduction

ביונקים בלוטות הרוק מאורגנים 3 זוגות של בלוטות הרוק הגדולות: הפרוטיד, תת הלסת, ואת בלוטות המשנה. קיימת גם סדרה של בלוטות קטין הממוקם על הלשון ומפוזרים ברחבי חלל אוראלי¹. בלוטות הגדולות אחראים נפח בצובר של רוק המיוצר². בנוסף למתן הגנה מיקרוביאלית באמצעות גורמים מופרש, רוק חשוב בתהליך של לעיסת מזון שימון כפי שהוא עובר דרך הוושט². ככזה, תפקוד בלוטת הרוק מייצג בעיה רפואית שבה הסובלים שאינם מסוגלים לייצר רוק מספיק נוטים יותר לפתח חלות כגון חללים שיניים או הקנאזיס אוראלי³. בנוסף, מופחתת הרוק גורמת לקושי רב יותר לאכול ולעכל את המזון בעל השפעה משמעותית על איכות החיים.

תפקוד בלוטת הרוק נמצא בעיקר בחולים הסובלים מתסמונת sjöגרנה, הפרעה אוטואימונית, או בחולים עם סרטן ראש וצוואר שעברו טיפול הקרנה^3,4,5, . שישה מטרים הפרשה הפגומה acini בתוך הבלוטות כתוצאה של חסינות אוטומטית או טיפול בקרינה לא עוברים התחדשות עצמית, אשר גורמת לחולה החיים עם נזק בלתי הפיך⁶. המחקר של בלוטות הרוק צברה גם את תשומת הלב או החוקרים המעוניינים מנגנונים של פתוגנזה נגיפית. כמה פתוגנים, כגון cytomegalovirus ירוס האדם (מימן), בהתמדה שכפול בתוך בלוטות הרוק, אשר לאחר מכן מאפשר שידור של וירוס המתהווה למחשב מארח חדש דרך רוק^7,8. לפיכך, יש צורך לא מתקיים לפתח חזק ומלא מודלים של בלוטת הרוק להתמודד ולהבין מגוון מגוון של בעיות רפואיות.

מספר דגמים של מערכת בלוטת הרוק murine שימשו נקודת התחלה כדי להבין ולאפיין את התאים האפיתל השונים היוצרים את בלוטות הרוק^9,10. קיימים הבדלים ברורים ועיקריים בין בלוטות הרוק אדם מורטין¹¹. בעיקר בלוטת הפרוטיד האנושית גדולה יותר ביחס לבלוטת הלסת התחתונה ואילו הלסת התחתונה והפרוטיד דומים הרבה בגודלם^1,2,11. בעוד מונצח האדם קווי הלסת התחתונה קיים, יש חששות עיקריים כי התאים מונצח לא לשמור במדויק את הפנוטיפ של הרקמה הראשונית חששות משניים כי התאים המודרים אינם נגזרים בפועל מ אפיתל הרוק עצמו¹². מסיבות אלה יש עניין וצורך ללמוד רקמת הרוק העיקרי מבני אדם.

כאן אנו מתארים פרוטוקול לבודד תאים אפיתל העיקרי מבלוטות הרוק האנושי לתרבות רקמות. הפרוטוקול שלנו מבוסס על יצירותיו של פרינגל ואח ' וטראן ואח '. עם שינויים שבוצעו בדרך כלל לפשט את הנהלים שלהם^13,14. ראשית, בזמן שפרוטוקול טראן ואח ' מתקשר לדגירה ארוכה של חמש שעות לעיכול הרוק, הפרוטוקול המתוקן שלנו הצליח עם מעט כמו דגירה של שעה אחת, בדומה לזה בפרינגל ואח '. שנית, אנו משתמשים באנזימים שונים לצורך עיכול רקמות, בעיקר איננו משתמשים בטריפסין כפי שנעשה בשימוש בפרוטוקול Tran et al המקורי, אך במקום זאת להשתמש בתערובת של dispase ו קולגן. אנו מעדיפים להימנע מטריפסין בצעדי העיכול הראשוניים כמחקר שנערך לאחרונה, הציע כי העיכול הראשוני של רקמת הרוק על ידי טריפסין תוצאות מופחתת הכדאיות התא, ואולי על ידי אובדן של אוכלוסיה נדירה של תאי גזע¹⁵. לבסוף, אנו התרבות הערבה על פני השטח של מטריקס קרום המרתף (BMM) באמצעות מדיה זמין מסחרית ניסח במקור עבור התפשטות של תאים אפיתל הסימפונות. הפרוטוקול שלנו יכול לשמש כדי לבודד את תאי הרוק מן הפרוטיד, הלסת התחתונה, ובלוטות תת לשוני. תאים אלה לבטא עמילז הרוק ו גנים ספציפיים אחרים הרוק המציין כי הם שומרים על פנוטיפ דומה לזה של תאים הרוק האפיתל שכבתית⁷. הצלחנו להפיק בהצלחה תרבויות הרוק מ > 50 דגימות הרקמות האנושיות הראשיות באמצעות מתודולוגיה זו. יתר על כן, התאים הרוק העיקרי יכול בקלות להיות הקפאת שמורות לשימוש במועד מאוחר יותר.

Protocol

פרוטוקולים ומחקרים אלה נבדקו ואושרו על ידי מועצת הסקירה המוסדית באוניברסיטת סינסינטי (הביטחון הפדרלי-רחב00003152, IRB פרוטוקול 2016-4183). רקמת הרוק הוא בדרך כלל resected הרבה הראש והצוואר כירורגי הליכים והוא בדרך כלל אינו מעורב על ידי תהליך ממאיר. בדרך כלל, רקמת בלוטת הרוק טרי resected משמש בתוך 2-4 h לאחר ההסרה של המטופל (איור 1A).

1. הכנה מגיב

1. ברונכיט הצמיחה האפיתל התאים בינונית (בז)
   1. הוסף רכיבים מתוך הערכה המסופקת על-ידי היצרן (עיין בטבלת החומרים).
   2. שטוף כל צינור פעם אחת עם מדיית הבסיס כדי להבטיח העברה מלאה של רכיבים. ואז להוסיף את הסרום העוברי פחם העובר כדי לבצע ריכוז סופי של 4% סרום.
2. מאגר לליזה תא דם אדום (RBC)
   1. כדי להפוך את מלאי 10x, להוסיף 40.15 g של NH₄Cl, 5.0 g של נחקו₃, ו 0.186 g של החומצה ethylenediamאצטט (edta) ולהביא נפח סופי של 200 mL באמצעות dH₂O. ואז לסנן לעקר ולאחסן ב 4 ° c.
   2. דלל את הריכוז העובד של 1x ב-dH הסטרילי₂O לפני השימוש.
3. פתרון דיסוציאציה
   1. כדי בקבוק 100 mL של הפתרון dispase (לראות את הטבלה של חומרים) להוסיף 0.15 g של הקולגן הסוג השלישי. לאחר הקולגן התפרקה לחלוטין, מסנן לעקר את הפתרון החדש aliquot. חנות ב-20 ° c.

2. עיכול הרקמה

1. באמצעות לוח 100 מ"מ התרבות רקמה, המכונה במיוחד את הרקמה לתוך חתיכות קנס ~ 1-2 מ"מ בגודל באמצעות החיטוי-הניתוח מעוקר מספריים כירורגי מלקחיים (איור 1B,ג). יש לגזור את רקמת החיבור בין החלקים כדי להבטיח הפרדה נכונה וקלות בשלבים נוספים.
2. הוסף 6 מ"ל של הפתרון dispase/קולגן לרקמות טחון. ואז הדגירה ב 37 ° c עבור כ 30 דקות עד 1 h.
3. משבשים את הרקמה על ידי ליטוף עם הצינורות 5 מ ל 15-20 פעמים.
4. מודקון ב 37 ° c עבור עוד 30 דקות עד 1 h.
5. חזור על שלבים 2.3 ו-2.4 שתיים-שלוש פעמים נוספות או עד הרקמה דומה לספוגית והוא יכול בקלות לעבור דרך פתיחת הפיפטה (איור 1D).
   הערה: הגודל ההתחלתי של הדגימה הרקמה וכיצד מידת העדינות של הממחטת הרקמה תקבע כמה פעמים אדם צריך לחזור על שלבים 2.3 ו 2.4. בדרך כלל, אנו מקבלים רקמות בערך 1 ס מ x 1 גודל. בנוסף, ניתן לפקח על הדיסוציאציה רקמות באמצעות תקן מיקרוסקופ הפוך תרבות הרקמה כדי לעקוב אחר ההתקדמות של דיסוציאציה של התא מן הרקמה. אשכולות קטנים של תאים הם אידיאליים עבור הצמיחה הראשונית של תאי הרוק כספירות הערבה.

3. ציפוי בארות עם מטריצות קרום מרתף

הערה: מטריצת קרום המרתף (BMM) יש להפשיר לילה ב 4 ° c יום לפני שהוא יהיה בשימוש. פעם אחת, BMM צריך להישמר כל הזמן על הקרח או ב 4 ° צ' כפי שהוא יהיה לחזק במהירות (כלומר, ליצור ג'ל) בטמפרטורות חמות יותר. בנוסף, הטיפול צריך להילקח אם הדגימות היה קריר על הקרח לפני ציפוי ב BMM כמו דגימות קר יהיה "להמיס" BMM ולחשוף את התאים לצלחת פלסטיק.

1. באיטיות הצינורות BMM (לראות את הטבלה של חומרים) לתוך כל טוב להיות מצופה. באופן שווה ובאיטיות לפזר את BMM מעל הבאר.
   הערה: בדרך כלל, אנו משתמשים 500 μL לכל טוב של צלחת שש-היטב, אבל זה יכול להיות מותאם לשימוש על גרסאות אחרות של צלחות כגון 12-טוב או 24-טוב, או כנדרש עבור הידרוג עבה או דק יותר.
2. מודטה את הצלחות מצופה ב 37 ° c עבור לפחות 15 דקות לפני השימוש כדי לאפשר את הזמן BMM לגבש.

4. סינון רקמה בלתי מתעכלת, לליזה RBC וציפוי תאים

1. העברת רקמות המגון משלב 2.5 לשפופרת חרוט של 15 מ"ל. לשטוף את הצלחת פעם אחת עם 6 מ ל של מלוחים הפוספט של Dulbecco באגירה (DPBS) כדי להעביר את התאים הנותרים.
2. לסנן את ההגון לתוך שפופרת 50 mL באמצעות מסננת של רשת ניילון 70 יקרומטר שינוי להסיר רקמות לא מתעכל. צנטריפוגה תאים מתוחים עבור 5 דקות ב 500 x g.
3. לדלל מאגר הליזה 10x RBC ב dH מעוקר₂O כדי להפוך פתרון עבודה 1x.
4. . ומכה את הסופרנטאנט לאחר מכן השהה מחדש את הגלולה ב-10 מ ל של מאגר הליזה 1 x RBC. דגירה עבור 5 דקות ב 37 ° c.
5. הוסף 20-25 mL של DPBS לנטרל את המאגר לפירוק RBC ולמזער את הליזה של תאים הרוק. צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 500 x g.
   הערה: לאחר הטיפול עם מאגר הליזה RBC, הגלולה צריכה להיות לבנה. צבע אדום בתוך הגלולה מציין כי לא כל RBC כבר במלואו. חזור על שלבים 4.4 עד 4.5 במידת הצורך עבור השלמות המלאה של כל RBC.
6. . ומכה את הסופרנטאנט השהה מחדש את הגלולה ב 1-2 מ ל של ברוטו לאחר מכן הניחו את התאים מחדש על בארות מצופות BMM. מודטה ב 37 ° c.
7. ברגע שהוא מצופה ב-BMM, התאים יוצרים מבנים כדוריים או "כדורי ערבה" במשך תקופה של 2-3 יום. תאים ניתן לשמור על כדורי הריר עבור כ 5-7 ימים לפני BMM מתחיל לבזות המאפשר את התאים כדי לגשת ולדבוק פלסטיק ולצמוח כמונאולייר.

5. העלאת כדורי הערבה ותחזוקתו ב-BMM

1. התקשורת מוחלק מבארות, ולאחר מכן להוסיף 1 מ ל של dispase/קולגן הפתרון לכל טוב ו-מודטה ב 37 ° צ' עבור ~ 15 דקות או עד BMM התפרקה בעיקר.
2. העבר תאים כדי 15 מ"ל שפופרת חרוט ולשטוף בארות פעם עם DPBS כדי להשיג את התאים הנותרים. צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 500 x g.
3. . ומכה את הסופרנטאנט השהה את הגלולה ב-2 מ ל של טריפסין ולאחר מכן דגירה ב 37 ° c עבור 15 דקות.
4. נטרל את הטריפסין באמצעות כל מדיה מלאה המכילה 10% סרום. צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 500 x g.
5. . ומכה את הסופרנטאנט השהה מחדש את התאים ב-DPBS כדי להסיר מדיה שיורית, טריפסין ונסיוב. צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 500 x g.
6. . ומכה את הסופרנטאנט השהה מחדש את התאים המושהים על מנות תרבות מצופות ב-BMM. ניתן גם לציפוי תאים שהושעו ישירות על תרבות התא שטופלו מנות להפצה כמונאולייר. לקבלת מידע נוסף אודות הצמיחה של תאי הרוק כמונאולייר, ראה סעיף 6. תאים גדלו על BMM או על פלסטיק יש להאכיל עם בז טרי מדי 2 – 3 ימים.
7. תרבות התאים בתוך מחולל לחות בחממה הנשמרת ב 37 ° c עם 5% CO₂.

6. שישה כדורי הערבה על מנות מטופלות של רקמה פלסטית

הערה: אם שמירה על תאים כמונאולייר על גבי פלסטיק, התחל בשלב זה. הפרוטוקול הבא חל על תאים הגדלים בצלחת 100 מ"מ.

1. . מרוב את התקשורת שטוף פעם אחת עם DPBS כדי להסיר מדיה שיורית.
2. הוסיפו 2 מ ג של טריפסין לאחר מכן ב-37 מעלות צלזיוס עבור 15 דקות, או עד שהתאים מנותקים לחלוטין.
3. נטרל טריפסין באמצעות 4 מ ל של כל מדיה מלאה המכילה 10% סרום. העבר תאים לשפופרת חרוט בעלת 15 מ"ל.
4. לשטוף את הצלחת פעם אחת עם כ 5 מ ל של DPBS לאסוף את התאים הנותרים. צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 500 x g.
5. . ומכה את הסופרנטאנט השהה תאים מחדש ב-6-10 mL של DPBS כדי להסיר מדיה שיורית.
6. צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 500 x g.
7. . והשעיה מחדש בבמ תאי לוחית על מטופלים. בתרבית רקמה מפלסטיק להאכיל עם בז טרי מדי 2-3 ימים.
8. תרבות התאים בתוך מחולל לחות בחממה הנשמרת ב 37 ° c עם 5% CO₂.

7. קריוגנית של תאים

הערה: ניתן לבצע הקפאה של תאים מתוך השעיית תא בודד שמקורם בתאי הערבה או התאים הגדלים במונאולייר.

1. ספור את התאים במטציטוטומטר כדי לחשב את הכמות הכוללת של התאים הנוכחים.
2. צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 500 x g.
3. . ומכה את הסופרנטאנט השהה מחדש את הגלולה ב-באגמ עם 10% diמתיל סולפוקסיד (DMSO). ריכוז של תאים צריך להיות 2 x 10⁶ תאים/ml כדי 10 x 10⁶ תאים/ml.
4. . תאים מחלקים לצינורות אחסון קריוגניים מניחים את הצינורות בתוך מדף קצף מבודדים ו-דגירה ב-80 ° c בלילה כדי להקפיא באיטיות את התאים.
5. ביום למחרת, מניחים צינורות בחנקן נוזלי לאחסון ארוך טווח.
   הערה: יש להפשיר את התאים במהירות 37 ° c. עם הפשרה, תאים צריך להיות מחורץ ב 500 x g ואת המדיה המכילה dmso להסיר לפני ציפוי.

תוצאות

שניים-שלושה ימים לאחר הציפוי התאים מרקמות מתעכל על BMM, תאים בקלות טופס אשכולות קטנים שימשיכו להרחיב בגודל של עד 15-20 תאים לכל אשכול (איור 2A). פסולת סלולרית ותאים מתים מנותקים נראים בדרך כלל ויש להסירו על ידי מועך ומחדש עם מדיה טרייה. תאים ימשיכו להתרבות כמו כ?...

Discussion

תפקוד הרוק מייצג דאגה לאיכות החיים עבור אלה הסובלים מתסמונת sjöגרנה, כמו גם אלה שעברו טיפול הקרנות סרטן בסמוך לבלוטות הרוק^3,4,5, . ^{שישה עשרה} אחד הציע טיפול כדי לטפל בחולים אלה היא לגדל תאים גזע הרוק פונקציונלי או אורגנואיד?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm culture dishes	Thermo Scientific	172931
15 mL conical tubes	Thermo Scientific	339651
50 mL conical tubes	Thermo Scientific	339653
Bronchial Epithelial Cell Growth Media	Lonza	CC-3171	Add bullet kit as per manufacturer's instructions. Supplement with 20 mL of charcoal stripped serum.
Cell strainer 70 µm nylon mesh	Fisher	22-363-548
Charcoal stripped fetal bovine serum	Gibco	12676-029
Collagenase type III	Worthington	LS004182	Store at 4 °C.
Cryogenic Tube	Fisher	5000-0020
Dispase	Cell Applications	07923	Dissolve collagenase to make a 0.15% (w/v) stock. Filter sterilize then store at -20 °C.
Dissecting scissors	Fisher	08-940
Dulbecco phosphate buffered saline	Corning	55-031-PC
General Chemicals	Sigma
PathClear Basement membrane extract	Cultrex	3432-005-01	Thaw at 4 °C at least 24 hr prior to use. Always handle on ice.
Six-well culture dishes	Falcon	353046
Surgical forceps	Fisher	22-079-742
Trypsin-EDTA solution	Corning	25-052-CI