نموذج كالفاري لتكبير العظام في الأرنب لتقييم نمو العظام والأوعية الدموية الجديدة في مواد استبدال العظام

Summary

هنا نقدم بروتوكول جراحي في الأرانب بهدف تقييم مواد استبدال العظام من حيث قدرات تجديد العظام. باستخدام اسطوانات نظرة خاطفة ثابتة على جماجم الأرانب، والتوصيل العظمي، وosteoinduction، وتكوّن العظام والتكوين الأوعية الدموية الناجمة عن المواد يمكن تقييمها إما على الحيوانات الحية أو القتل الرحيم.

Abstract

المبدأ الأساسي لنموذج كالفاريال الأرنب هو أن تنمو أنسجة العظام الجديدة عموديا على رأس الجزء القشري من الجمجمة. يسمح هذا النموذج بتقييم مواد استبدال العظام لتجديد العظام عن طريق الفم والوجه القحفي من حيث نمو العظام ودعم الأوعية الدموية الجديدة. مرة واحدة يتم التخدير الحيوانات والتهوية (التنبيب داخل الرغامى)، يتم مشدود أربع اسطوانات مصنوعة من كيتون الأثير متعدد الأثير (PEEK) على الجمجمة، على جانبي الغرز المتوسطة والإكليلية. يتم حفر خمسة ثقوب داخل النخاع داخل منطقة العظام المحددة من قبل كل اسطوانة، مما يسمح بتدفق خلايا نخاع العظام. يتم وضع عينات المواد في الاسطوانات التي يتم إغلاقها بعد ذلك. وأخيرا، يتم خياطة الموقع الجراحي، والحيوانات تستيقظ. يمكن تقييم نمو العظام على الحيوانات الحية باستخدام التصوير الميكروتومي. وبمجرد قتل الحيوانات، يمكن تقييم نمو العظام والأوعية الدموية الجديدة باستخدام التصوير المجهري، وعلم الأنسجة المناعية، والفلورة المناعية. وبما أن تقييم المادة يتطلب أقصى قدر من التوحيد القياسي والمعايرة، فإن النموذج الكالفاري يبدو مثالياً. والوصول سهل جدا، ويسهل المعايرة والتوحيد باستخدام اسطوانات محددة، ويمكن تقييم أربع عينات في وقت واحد. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام التصوير المقطعي الحي، وفي نهاية المطاف يمكن توقع حدوث انخفاض كبير في الحيوانات التي سيتم قتلها الرحيم.

Introduction

تم تطوير نموذج كالفاريل لتكبير العظام في التسعينات بهدف تحسين مفهوم تجديد العظام الموجه (GBR) في المجال الجراحي عن طريق الفم والوجه القحفي. المبدأ الأساسي لهذا النموذج هو زراعة أنسجة العظام الجديدة عموديا على رأس الجزء القشري من الجمجمة. وللقيام بذلك، يتم تثبيت مفاعل (مثل قبة التيتانيوم أو الاسطوانة أو القفص) على الجمجمة لحماية تجديد العظام الذي يتم بواسطة الكسب غير المشروع (على سبيل المثال، هيدروجيل، بديل العظام، وما إلى ذلك). مع المعونة من هذا النموذج،التيتانيوم أو أقفاص السيراميك 1،^{2،3،4،5،6،}GBR الأغشية^{7،8،9 ،10}، العوامل العظمية^{11،12،13،14،15،16،17}، العظام الجديدة البدائل^12و16و17^{و18و19و20و21و22و23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29} أو تم تقييم آلية الأوعية الدموية الجديدة خلال عملية تجديد العظام^30.

من وجهة نظر الترجمة، يمثل نموذج calvarial عيب جدار واحد التي يمكن مقارنتها بعيب الفئة الرابعة في الفك³¹. والهدف من ذلك هو زراعة عظام جديدة فوق منطقة القشرية، دون أي دعم جانبي من جدران العظام الذاتية. وبالتالي فإن النموذج صارم للغاية ويقيّم الإمكانات الحقيقية للموصل الرأسي للعظام فوق الجزء القشري من العظام. إذا كان النموذج الموضح هنا مخصص في المقام الأول لتقييم التوصيل العظمي في بدائل العظام، يمكن أيضا تقييم تكوين العظام و / أو الأوستيو، فضلا عن تكوين الأوعية الدموية^{1،2،3، 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ،14،15،16،17،18،19،20،21،22 ،23،24،25،26،27،28،29،30.}

أساسا لأسباب أخلاقية وعملية واقتصادية، تم تطوير نموذج calvarial في الأرنب الذي التمثيل الغذائي للعظام والهيكل هي ذات الصلة تماما بالمقارنة مع الإنسان³². من بين 30 مرجعاالمذكورة أعلاه، 80٪تستخدم نموذج كالفاريال الأرنب 1،^{2،3،4،5،6،7،8 ,9,10,11,12,13,14,15,17,22, 23،26،27،28،29،30،33،}مما يدل على أهمية هذا النموذج الحيواني. في 2008, [بوسّنلشنر] نقل المجموعة النموذج [كلفريل] إلى الخنزير, أن يسمح المقارنة من ثمانية عظمة بدائل في وقت واحد²⁰ (يقارن إلى اثنان عظم ة بديلة مع الأرنبة). من ناحية أخرى، نقلت مجموعتنا نموذج الأرنب كالفاريال إلى الأغنام. وباختصار، تم وضع قباب التيتانيوم على جماجم الأغنام لتوصيف التوصيل العظمي لبديل عظام جديد مطبوع ثلاثي الأبعاد. هذه الدراسات سمحت لنا بتطوير وإتقان نموذج الكالفارية وتحليلها^16،21.

وذكرت الدراسات الثلاث الأخيرة^16،20،21، جنبا إلى جنب مع العديد من التحقيقات الأخرى^{12،17،18،19،22، 23،24،26،27،28،29،}وأكد الإمكانات الكبيرة لنموذج كالفاريال كفحص وتوصيف نموذج. ومع ذلك، على الرغم من أن النتائج التي تم الحصول عليها كانت مرضية جدا، وأشاروا أيضا إلى بعض القيود: (1) استخدام قباب التيتانيوم، التي منعت انتشار الأشعة السينية وبالتالي العيش استخدام الأشعة المقطعية الدقيقة. لا يمكن إزالة هذه قبل المعالجة النسيجية، مما اضطر الباحثين إلى تضمين العينات في بولي (ميثيل ميثاكريلات) الراتنج (PMMA). ولذلك اقتصرت التحليلات الناتجة إلى حد كبير على الطوبوغرافيا. (2) ارتفاع التكاليف المالية خاصة بسبب تكلفة الحيوانات، والتكاليف المتعلقة باللوجستيات والصيانة والجراحة للالحيوانات. (3) صعوبات الحصول على الموافقات الأخلاقية للالحيوانات الكبيرة.

دراسة حديثة من قبل بولو، وآخرون²⁶ تحسنت إلى حد كبير النموذج على الأرنب. تم استبدال القباب التيتانيوم باسطوانات closable التي يمكن ملؤها مع حجم ثابت من المواد. وقد وضعت أربع من هذه الاسطوانات على جماجم الأرانب. وعند الانتهاء، يمكن إزالة الاسطوانات بحيث تكون الخزعات خالية من المعادن، مما يوفر مرونة أكبر بكثير فيما يتعلق بمعالجة العينات. أصبح نموذج كالفاريال الأرنب جذابة للاختبار في وقت واحد مع انخفاض التكاليف، وسهولة التعامل مع الحيوانات وتسهيل معالجة العينات. وبالاستفادة من هذه التطورات الأخيرة، قمنا بزيادة تحسين النموذج عن طريق استبدال التيتانيوم بـ PEEK لإنتاج اسطوانات، مما يسمح بنشر الأشعة السينية واستخدام التصوير المقطعي المجهري على الحيوانات الحية.

في هذه المقالة، سوف نقوم بوصف عمليات التخدير والجراحة وعرض أمثلة على المخرجات التي يمكن الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول، أي علم الأنسجة (المناعية)، ودراسة الأنسجة، والتصوير المجهري الحي والجسم الحي من الخارج لتقييم آليات العظام تجديد وتحديد كمية تخليق العظام الجديدة التي تدعمها المواد البديلة للعظام.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

وتمشياً مع المتطلبات القانونية السويسرية، وافقت لجنة أكاديمية على البروتوكول وأشرفت عليه الوكالات البيطرية الكانتونية والاتحادية (الترخيصان رقم GE/165/16 وGE/100/18).

1- أجهزة وحيواناتهم محددة

1. اسطوانات
   1. اسطوانات آلة مع علامات التبويب استقرار الجانبية من نظرة خاطفة أن يكون القطر الداخلي من5 ملم، القطر الخارجي من 8 ملم وارتفاع 5 ملم (الشكل 1).
   2. قبعات نظرة خاطفة آلة مع تصميم يسمح لكليب على وجه التحديد على الجزء العلوي من الاسطوانة (سمك 1 ملم).
   3. تعقيم اسطوانات نظرة خاطفة وقبعات عن طريق الأوتوكلاف قبل الجراحة.
2. مسامير
   1. استخدام الذاتي الحفر مسامير صغيرة (مصنوعة من التيتانيوم النقي التجاري (الصف 5)) لإصلاح اسطوانات (1.2 ملم في القطر، 4 ملم في الطول). تعقيم عن طريق الأوتوكلاف قبل الجراحة.
3. الحيوانات
   1. شراء الأرانب البيضاء النيوزيلندية البالغة من العمر ثلاثة أشهر (ذكر أو أنثى)، وزنها حوالي 2.5 كجم لكل منها.
      ملاحظة: حصلنا على الأرانب عن طريق تربية في جامعة جنيف.

2. الجراحة

1. صينية جراحية
   1. الحفاظ على مشرط، مقص، اثنين ملقط، مصعد periosteal، المحاقن (1، 2، 5، 50 مل)، المحرك الجراحي، الجحور الجراحية المستديرة (قطر 0.8 ملم)، والإبر، المالحة المعقمة، وأربع اسطوانات، وثمانية مسامير، ومفك جاهزة.
2. العلاج قبل السريرية
   1. تكييف الحيوانات قبل أسبوع واحد من الجراحة.
   2. توفير مضاد حيوي وقائي يوميًا (5-10 ملغم/كغم عن طريق الفم)) يبدأ 2 ساعة قبل الجراحة حتى 3 أيام بعد الجراحة.
3. التخدير والتنبيب
   1. تُسْدِع الحيوانات عن طريق حقن الكيتامين العضلي (IM) (25 ملغم/كغم، 50 ملغم/مل، 0.5 مل/كغ) + إكسلازين (3 ملغم/كغم، 20 ملغم/مل، 0.15 مل/كغم). انتظر ~ 20 دقيقة للالحيوانات للنوم
      بعمق (كامل العضلات الحجرية).
      ملاحظة: سيسمح هذا الدواء المسبق بعملية تنبيب بسيطة وسريعة وغير مؤلمة. يتم حث التسكين العميق والتخدير كما هو موضح في الخطوة 2.3.8.
   2. ضع قنية عن طريق الوريد (IV) في الوريد الهامشي من الأذن وأبقيها مغلقة حتى يكتمل التنبيب.
      ملاحظة: هذا الخط الرابع سوف تعمل على perfuse الفنتانيل وبروبوفول للتسكين العميق والتخدير، على التوالي (انظر الخطوة 2.3.8).
   3. الحفاظ على التخدير عن طريق توفير 5٪ سيفوفلوران في الأكسجين النقي حتى يتم إجراء التنبيب.
      ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية فقط إذا كان الحيوان يظهر علامات الصحوة (حركات العين، وتقلصات العضلات).
   4. التخدير القصبة الهوائية محليا عن طريق رش 10٪ ليدوكائين. وضع الأرنب في موقف عرضة والحفاظ على رأسه في تمديد عمودي.
   5. حرك الأنبوب الرغامى الأول من قطر صغير (2.5 مم) في القصبة الهوائية للأرنب حتى يمكن سماع تدفق الهواء في الأنبوب. وهذا فتح الحنجرة وتسهيل إدخال الأنبوب النهائي.
   6. أدخل دليلًا (قسطرة التنبيب) في الأنبوب لإصلاح موضع الأنبوب في القصبة الهوائية. إزالة أنبوب قطرها الصغير وحرك أنبوب الرغامى النهائي (4.9 مم) على الدليل.
   7. إزالة الدليل وتضخيم البالون في نهاية الأنبوب داخل الرغامى لختم ومنع الجهاز في القصبة الهوائية. سيبقى الأنبوب في مكانه ولكن قد يتم تأمينه باستخدام الدانتيل المربوط حول الجبين.  تهوية على الفور (7 مل / كغ، تردد 40/min) الحيوان مع 3٪ سيفوفلوران في الأكسجين النقي.
   8. الفنتانيل المستمر (وريد الأذن) الفنتانيل (0.01 ملغم/مل، 2-4 مل/ساعة) للحث على التسكين، 2-4 ملغم/كغم من (2٪) بروبوفول (20 ملغ / مل، 4-8 مل / ساعة) للحث على التخدير، و 4 مل / كغ / ساعة من خلات رينجر للحفاظ على ظروف متساوي الحجم.
   9. وضع مسبار درجة حرارة المستقيم. أيضا رصد وظيفة القلب، ودرجة الحرارة وتشبع الأكسجين خلال العملية بأكملها.
   10. السيطرة على عمق التخدير عن طريق رصد التنفس الذاتي. إذا كان الحيوان يظهر علامات التنفس الذاتي، الاستغناء عن بولوس صغيرة من البروبوفول والفينتانيل.
4. إعداد الموقع
   1. ضع الأرنب على وسادة ساخنة (39 درجة مئوية) مغطاة بوسادة فراش (لتجنب الحروق) على طاولة الجراحة. اذيك فروة الرأس
   2. تطبيق هلام التشحيم على العينين لتجنب تهيج وجفاف. تطهير الموقع عن طريق تنقية الجلد مع اليود البوفيدون (10٪). ثم تغطية الأرنب مع الستائر الجراحية المعقمة وقطع منطقة الوصول للجمجمة.
   3. تطهير الموقع الجراحي باليود البوفيدون (10٪) للمرة الثانية. تطبيق هلام التشحيم على العينين لتجنب تهيج وجفاف.
   4. إعداد طاولة رايات (الستائر المعقمة) التي لوضع علبة جراحية كاملة.
5. افتتاح موقع العمليات الجراحية
   1. التخدير محليا مع حقن تحت الجلد (SC) من ليدوكائين 2٪ (1 مل) على الجمجمة.
   2. يُقطع عن طريق الجلد (مع مشرط) على طول خط الكالفاري المترهل، من المدارات إلى البذير الخارجية (حوالي 4 سم في الطول). تأكد من أن periosteum هو قاطعة.
   3. رفع بلطف periosteum (مع مصعد periosteal) على كلا الجانبين من الشق. شطف الموقع مع المالحة معقمة.
6. وضع اسطوانة
   1. تحديد موقع الغرز المتوسطة والإكليلية على الجمجمة (الشكل2A،B). لاحظ أن هذه الخطوط التشريحية تشكل صليباً. سيتم وضع الاسطوانات في كل من الأرباع التي يحددها الصليب، وضمان أن حافة الاسطوانة ليست على خياطة (الشكل2C).
   2. ضع الاسطوانة الأولى على الربع العلوي الأيسر (العظام الأمامية اليسرى)، وحاول وضع الجهاز مسطحًا. إصلاح في الموقف مع ضغط اليد قوية والمسمار المسمار الصغير، حتى يشعر المقاومة. تأكد من أن رأس المسمار هو دافق مع سطح علامة التبويب اسطوانة.
   3. كرر نفس الإجراء في علامة التبويب الأخرى لإصلاح الاسطوانة بإحكام على الجمجمة. تأكد من أن الاسطوانة ثابتة بإحكام إلى العظام.
   4. كرر الإجراء في الربع العلوي الأيمن (العظام الأمامية اليمنى)، الربع السفلي الأيسر (العظام الجدارية اليسرى اليسرى) والربع السفلي الأيمن (العظام الجدارية اليمنى).
7. حفر العظام من 5 ثقوب داخل النخاع داخل المنطقة المحاطة بالاسطوانات (الشكل 1)
   1. حفر حفرة داخل النخاع تحت الري المالحة (0.8 ملم في القطر، ~ 1 ملم في العمق) مع جحر جولة على العظام، في وسط المنطقة التي تحصرها الاسطوانة. تأكد من أن النزيف يظهر.
   2. حفر اثنين من الثقوب داخل أكثر على طول المحور يمر من خلال مسامير علامة التبويب اثنين، في الحواف الداخلية للاسطوانة. على طول الفأس عمودي، حفر اثنين من الثقوب داخل النخاع أكثر في الحواف الداخلية للاسطوانة. تأكد من أن النزيف يظهر.
   3. كرر العملية داخل الاسطوانات الثلاث الأخرى.
8. اسطوانات تعبئة مع عينات المواد والسد (الشكل 3)
   1. إعداد المواد البديلة العظام المطلوب وفقا لتعليمات الشركة المصنعة أو مواصفات المواد.
   2. ملء الاسطوانة الأولى إلى حافة مع عينة المواد وإغلاق الاسطوانة عن طريق تركيب الغطاء. كرر العملية في 3 اسطوانات أخرى.
9. إغلاق المواقع الجراحية
   1. أغلق الجلد فوق الأسطوانات بخياطة متقطعة غير قابلة للإعادة.
   2. تطبيق خلع الملابس القابلة للرش على الجرح.

3. العلاج بعد الجراحة

1. وقف التسكين والتخدير (بروبوفول والفينتانيل التسريب اعتقال) العرض والتحقق من انتعاش التنفس الذاتي.
2. إيقاف التهوية بمجرد أن يتعافى الحيوان من التنفس المستقل. الحفاظ على الحيوان تحت الأكسجين النقي قبل الصحوة الكاملة.
3. حقن البوبرينورفين هيدروكلوريد SC (0.02 ملغ / كغ، 0.03 ملغ / مل، 0.67 مل / كغ) وتكرار الحقن كل 6 ساعة لمدة 3 أيام كما التسكين بعد الجراحة.
4. نقل الحيوان إلى مسكنه المعتاد مع الماء والتغذية الكاملة.
5. إزالة الغرز بعد حوالي 10 أيام من التئام الجروح.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

النموذج الموضح هنا مخصص لتقييم التوصيل العظمي في بدائل العظام. ويمكن أيضا تقييم تكوين العظام وأو العظام من بدائل العظام إما (قبل) الخلوية أو محملة الجزيئات النشطة بيولوجيا، فضلا عن تكوين الأوعية الدموية^1،2،3،

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

النموذج الموضح هنا بسيط وينبغي تطويره بسهولة تامة طالما يتم اتباع جميع الخطوات والمعدات المناسبة. كما وصف البروتوكول هو طريقة جراحية، جميع الخطوات تبدو حاسمة ويجب اتباعها بشكل صحيح. من المهم أن يتم تدريبنا على التجارب الحيوانية، وخاصة في التعامل مع الأرانب والتخدير. لا تتردد في طلب التخد...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drugs
Enrofloxacine Baytril 10%	Bayer		Antibiotic
Fentanyl	Bischel		For analgesia
Ketalar 50mg/ml	Pfizer		Ketamine for anesthesia
Lidohex	Bichsel		Lubricating gel for the eyes
Opsite	Smith and Nephew	66004978	Sprayable dressing
Povidone iodine 10%, Betadine	Mundipharma		anti-infective agent
Propofol 2%	Braun	3538710	For anesthesia
Rapidocain 2%	sintetica		Local anesthesia
Ringer-acetate	Fresenius Kabi		Volume compensation
Rompun 2%	Bayer		Xylazin for anesthesia
Sevoflurane 5%	Abbvie		For anesthesia
Sterile saline	Sintetica
Temgesic	Reckitt Benckiser		Buprenorphine hydrochloride, analgesia
Thiopental Inresa	Ospediala		For anesthesia
Xylocaine 10% spray	Astra Zeneca		For intubation
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Fresenius Vial pilot C	Imexmed		Infusion pump
Heated pad	Harvard Apparatus
Suction dominant 50	Medela
Suction tubing Optimus	Promedical	80342.2
Surgical motor	Schick dental	Qube	Drilling of intramedullary holes
Ventilation	Maquet Servo1
Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
Cylinders and caps	Boutyplast	Customized	composition: PEEK (poly ether ether ketone)
Manual self-retaining shaft	GlobalD	ACT1K
Mobile handle for self-retaining shaft	GlobalD	MTM
Self- drilling screws	GlobalD	VA1.2KL4	cross-drive screws composed by Titanium grade5, ISO 5832-3
Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical tray
Endotracheal tube Shiley diameter 2,5mm	Covidien	86233	For intubation
Endotracheal tube Shiley diameter 4,9mm	Covidien	107-35G	For intubation
Ethicon prolene 4-0	Ehticon	8581H	Non-resorbable suture
Forceps	Marcel Blanc	BD027R	145 mm
Intubation catheter	Cook medical		Guide for intubation
Needlle holder	Marcel Blanc	BM008R
Needles BD Microlance3	Becton Dickinson	300300/304622	26G; 18G
Periosteal	HU-Friedy	P9X
Round surgical burs	Patterson	78000	0.8 mm in diameter, Drilling of intramedullary holes
Scalpel	Swann-Morton		n°10 and n°15
Scissors	Marcel Blanc	00657	180 mm
Syringes Omnifix	Braun	4616057V	5ml, 10ml and 50ml
Venflon G22	Braun	42690985-01	Vasofix safety for the ear iv line