Modèle calvarial de l'augmentation osseuse dans le lapin pour l'évaluation de la croissance osseuse et la néovascularisation dans les matériaux de substitution osseuse

Laurine Marger; Antonio Barone; Carla  P. Martinelli-Kläy; Leandra Schaub; Malin Strasding; Mustapha Mekki; Irena Sailer; Susanne  S Scherrer; Stéphane Durual

doi:10.3791/59976

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Résumé

Ici, nous présentons un protocole chirurgical chez les lapins dans le but d'évaluer les matériaux de substitution osseuse en termes de capacités de régénération osseuse. En utilisant des cylindres PEEK fixés sur des crânes de lapin, l'ostéoconduction, l'ostéoinduction, l'ostéogenèse et la vasculogenèse induites par les matériaux peuvent être évalués soit sur des animaux vivants ou euthanasiés.

Résumé

Le principe de base du modèle calvarial de lapin est de cultiver de nouveaux tissus osseux verticalement au-dessus de la partie corticale du crâne. Ce modèle permet l'évaluation des matériaux de substitution d'os pour la régénération orale et craniofacial d'os en termes de croissance d'os et de soutien de neovascularization. Une fois que les animaux sont anesthésiés et ventilés (intubation endotrachéale), quatre cylindres faits de cétone d'éther de polyéther (PEEK) sont vissés sur le crâne, des deux côtés de la médiane et des sutures coronales. Cinq trous intramédullaires sont percés dans la zone osseuse délimitée par chaque cylindre, ce qui permet l'afflux de cellules de moelle osseuse. Les échantillons de matériaux sont placés dans les cylindres qui sont ensuite fermés. Enfin, le site chirurgical est suture, et les animaux sont réveillés. La croissance osseuse peut être évaluée sur des animaux vivants en utilisant la microtomographie. Une fois que les animaux sont euthanasiés, la croissance osseuse et la néovascularisation peuvent être évaluées en utilisant la microtomographie, l'histologie immunitaire et l'immunofluorescence. Comme l'évaluation d'un matériau nécessite une standardisation et un étalonnage maximaux, le modèle calvarial semble idéal. L'accès est très facile, l'étalonnage et la normalisation sont facilités par l'utilisation de cylindres définis et quatre échantillons peuvent être évalués simultanément. En outre, la tomographie vivante peut être utilisée et, en fin de compte, une forte diminution des animaux à euthanasier peut être anticipée.

Introduction

Le modèle calvarial de l'augmentation osseuse a été développé dans les années 90 dans le but d'optimiser le concept de régénération osseuse guidée (GBR) dans le domaine chirurgical oral et craniofacial. Le principe de base de ce modèle est de cultiver de nouveaux tissus osseux verticalement sur le dessus de la partie corticale du crâne. Pour ce faire, un réacteur (p. ex. titane-dôme, -cylindre ou cage) est fixé sur le crâne pour protéger la régénération osseuse effectuée par une greffe (p. ex. hydrogel, substitut osseux, etc.). A l'aide de ce modèle, cages en titane ou céramique¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶, GBR membranes⁷^,⁸^,⁹ ^,¹⁰, facteurs ostéogéniques¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷, nouvel os remplaçants¹²^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹^,²²^,²³ ^, ²⁴ Ans, états-unis ^, ²⁵ Annonces ^, ²⁶ Annonces ^, ^{27 Annonces} ^, ²⁸ Annonces ^, ²⁹ ou le mécanisme de la néovascularisation pendant le processus de régénération d'os³⁰ ont été évalués.

D'un point de vue translationnel, le modèle calvarial représente un défaut d'un mur qui peut être comparé à un défaut de classe IV dans la mâchoire³¹. L'objectif est de cultiver de nouveaux os au-dessus d'une zone corticale, sans aucun soutien latéral des parois osseuses endogènes. Le modèle est donc extrêmement rigoureux et évalue le potentiel réel de l'ostéoconduction verticale sur la partie corticale de l'os. Si le modèle décrit ci-dessus est principalement dédié à l'évaluation de l'ostéoconduction chez les substituts osseux, l'ostéogenèse et/ou l'ostéoinduction peuvent également être évalués, ainsi que la vasculogenèse¹^,2^,³^, ⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³ ^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹^,²² ^,²³^,²⁴^,²⁵^,²⁶^,²⁷^,²⁸^,²⁹^,³⁰.

Essentiellement pour des raisons éthiques, pratiques et économiques, le modèle calvarial a été développé dans le lapin dans lequel le métabolisme osseux et la structure sont tout à fait pertinents par rapport à l'homme³². Sur les 30 références citées ci-dessus, 80% ont utilisé le modèle calvarial lapin¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,^{8 ,}⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁷^,²²^, ²³^,²⁶^,²⁷^,²⁸^,²⁹^,³⁰^,³³, démontrant ainsi la pertinence de ce modèle animal. En 2008, le groupe Busenlechner a transféré le modèle calvarial au porc, pour permettre la comparaison de huit substituts osseux simultanément²⁰ (par rapport à deux substituts osseux avec le lapin). D'autre part, notre groupe a transféré le modèle calvarial de lapin aux moutons. En bref, des dômes de titane ont été placés sur des crânes de mouton pour caractériser l'ostéoconduction d'un nouveau substitut d'os imprimé en 3D. Ces études nous ont permis de développer et de maîtriser le modèle calvarial et son analyse¹⁶^,²¹.

Les trois dernières études ont cité¹⁶^,²⁰^,²¹, ainsi que plusieurs autres enquêtes¹²^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²²^, ²³^,²⁴^,²⁶^,²⁷^,²⁸^,²⁹, a confirmé le grand potentiel du modèle calvarial comme un dépistage et la caractérisation modèle. Cependant, même si les résultats obtenus étaient assez satisfaisants, ils ont également souligné quelques limites : (1) L'utilisation de dômes de titane, qui empêchaient la diffusion des rayons X et, à leur tour, l'utilisation de micro-CT en direct. Ceux-ci ne pouvaient pas être enlevés avant le traitement histologique, forçant les chercheurs à intégrer les échantillons dans la résine poly (méthyle méthylique) (PMMA). Les analyses qui en ont résulté se sont donc largement limitées à la topographie. (2) Coûts financiers élevés, en particulier en raison du coût des animaux, et les coûts liés à la logistique, l'entretien et la chirurgie des animaux. (3) Difficultés à obtenir des approbations éthiques pour les grands animaux.

Une étude récente de Polo, et coll.²⁶ a largement amélioré le modèle sur le lapin. Les dômes en titane ont été remplacés par des cylindres closables qui pouvaient être remplis d'un volume constant de matériaux. Quatre de ces cylindres ont été placés sur des crânes de lapin. À l'achèvement, les cylindres pouvaient être enlevés de sorte que les biopsies étaient sans métal, introduisant beaucoup plus de flexibilité en ce qui concerne le traitement de l'échantillon. Le modèle calvarial de lapin est devenu attrayant pour l'essai simultané avec des coûts inférieurs, la manipulation facile d'animal et la facilitation du traitement d'échantillon. Profitant de ces développements récents, nous avons encore amélioré le modèle en remplaçant le titane par PEEK pour produire des cylindres, permettant ainsi la diffusion des rayons X et l'utilisation de la microtomographie sur les animaux vivants.

Dans cet article, nous décrivons les processus d'anesthésie et de chirurgie et montrerons des exemples de sorties qui peuvent être obtenues en utilisant ce protocole, c.-à-d., (immuno-) histomorphometry, microtomographie vivante et ex vivo pour évaluer les mécanismes de l'os la régénération et quantifient la nouvelle synthèse d'os soutenue par des matériaux de remplacement d'os.

Protocole

Conformément aux exigences légales suisses, le protocole a été approuvé par un comité académique et supervisé par les agences vétérinaires cantonales et fédérales (autorisations n'GE/165/16 et GE/100/18).

1. Dispositifs et animaux spécifiques

Cylindres
1. Cylindres de machine avec onglets stabilisateurs latéraux hors de PEEK pour avoir un diamètre intérieur de 5 mm, un diamètre extérieur de 8 mm et une hauteur de 5 mm (Figure 1).
2. Casquettes PEEK de machine avec une conception permettant de clip précisément sur le dessus du cylindre (épaisseur 1 mm).
3. Stériliser les cylindres et les bouchons PEEK en autoclantant avant la chirurgie.
Vis
1. Utiliser des vis micro-perforantes (faites de titane pur commercial (catégorie 5)) pour fixer les cylindres (1,2 mm de diamètre, 4 mm de longueur). Stériliser en autoclant avant la chirurgie.
Animaux
1. Achetez des lapins blancs néo-zélandais de trois mois (mâles ou femelles), pesant 2,5 kg chacun.
  REMARQUE : Nous avons obtenu des lapins en nous reproduisant à l'Université de Genève.

2. Chirurgie

Plateau chirurgical
1. Gardez les scalpels, les ciseaux, deux forceps, l'ascenseur périosteal, les seringues (1, 2, 5, 50 ml), le moteur chirurgical, les burs chirurgicaux ronds (0,8 mm de diamètre), les aiguilles, la saline stérile, quatre cylindres, huit vis et le tournevis.
Traitement préclinique
1. Acclimater les animaux une semaine avant la chirurgie.
2. Fournir un antibiotique prophylactique tous les jours (5 à 10 mg/kg par la bouche (PO)) à partir de 2 h avant la chirurgie jusqu'à 3 jours après la chirurgie.
Anesthésie et intubation
1. Sédatez les animaux par injection intramusculaire (IM) de kétamine (25 mg/kg, 50 mg/mL, 0,5 ml/kg) - xylazin (3 mg/kg, 20 mg/mL, 0,15 ml/kg). Attendez 20 min pour que les animaux dorment
  profondément (atonie musculaire complète).
  REMARQUE : Cette prémédication permettra un processus d'intubation simple, rapide et indolore. L'analgésie profonde et l'anesthésie sont induites comme décrit dans l'étape 2.3.8.
2. Placez une canule intraveineuse (IV) dans la veine marginale de l'oreille et gardez-la fermée jusqu'à ce que l'intubation soit terminée.
  REMARQUE : Cette ligne IV servira à perséminer le fentanyl et le propofol pour l'analgésie profonde et l'anesthésie, respectivement (voir l'étape 2.3.8).
3. Maintenir l'anesthésie en fournissant 5% de sevoflurane en oxygène pur jusqu'à ce que l'intubation soit effectuée.
  REMARQUE : Cette étape n'est nécessaire que si l'animal montre des signes d'éveil (mouvements oculaires, contractions musculaires).
4. Anesthésiez la trachée localement en pulvérisant 10% de lidocaïne. Placez le lapin en position couchée et maintenez sa tête en extension verticale.
5. Faites glisser le premier tube endotrachéal de petit diamètre (2,5 mm) dans la trachée du lapin jusqu'à ce que le flux d'air puisse être entendu dans le tube. Cela ouvrira le larynx et facilitera l'insertion du tube définitif.
6. Insérer un guide (cathéter d'intubation) dans le tube pour fixer la position du tube dans la trachée. Retirez le tube de petit diamètre et faites glisser le tube endotrachéal définitif (4,9 mm) sur le guide.
7. Retirez le guide et gonflez le ballon à l'extrémité du tube endotrachéal pour sceller et bloquer l'appareil dans la trachée. Le tube restera en place, mais il peut être sécurisé en utilisant une dentelle attachée autour du front. Immédiatement ventiler (7 mL/kg, fréquence de 40/min) l'animal avec 3% de sevoflurane en oxygène pur.
8. Perfil en continu (veine d'oreille) fentanyl (0,01 mg/mL, 2 x 4 ml/h) pour induire une analgésie, 2 à 4 mg/kg de (2 %) propofol (20 mg/mL, 4 à 8 ml/h) pour induire une anesthésie, et 4 mL/kg/h d'acétate de Ringer pour maintenir des conditions iso-volumetriques.
9. Placez une sonde de température rectale. Surveillez également la fonction cardiaque, la température et la saturation en oxygène pendant tout le processus.
10. Contrôler la profondeur de l'anesthésie en surveillant la respiration autonome; si l'animal montre des signes de respiration autonome, distribuez un petit bolus de propofol et de fentanyl.
Préparation du site
1. Placer le lapin sur un coussinchal chauffé (39 oC) recouvert d'un matelas (pour éviter les brûlures) sur la table de chirurgie. Raser le cuir chevelu.
2. Appliquer un gel lubrifiant sur les yeux pour éviter l'irritation et la sécheresse. Désinfecter le site en frottant la peau avec de l'iode de povidone (10%). Ensuite, drapez le lapin avec un drapé chirurgical stérile et découpez une zone d'accès pour le crâne.
3. Désinfecter le site chirurgical avec de l'iode de povidone (10%) pour la deuxième fois. Appliquer un gel lubrifiant sur les yeux pour éviter l'irritation et la sécheresse.
4. Préparer une table drapée (drapé stérile) sur laquelle placer le plateau chirurgical complet.
Ouverture du site chirurgical
1. Anesthésiez localement avec une injection sous-cutanée (SC) de lidocaïne 2% (1 mL) sur le crâne.
2. Inciser à travers la peau (avec un scalpel) le long de la ligne sagittale calvariale, des orbites à la protubérance occipitale externe (4 cm de longueur). Assurez-vous que le périosteume est incisé.
3. Élever doucement le périosteume (avec un ascenseur périosteal) des deux côtés de l'incision. Rincer le site avec saline stérile.
Placement de cylindre
1. Localiser les sutures médianes et coronaux sur le crâne (Figure 2A, B). Notez que ces lignes anatomiques forment une croix. Les cylindres seront placés dans chacun des quadrants définis par la croix, en veillant à ce que le bord du cylindre ne soit pas au-dessus de la suture (Figure 2C).
2. Placez le premier cylindre sur le quadrant supérieur gauche (os frontal gauche) et essayez de poser l'appareil à plat. Fixez-le en position avec une forte pression de la main et visez une microvis, jusqu'à ce que la résistance soit ressentie. Assurez-vous que la tête de vis est rincée avec la surface de l'onglet cylindre.
3. Répétez la même procédure sur l'autre onglet pour fixer le cylindre fermement sur le crâne. Assurez-vous que le cylindre est hermétiquement fixé à l'os.
4. Répétez la procédure sur le quart supérieur droit (os frontal droit), le quart inférieur gauche (os pariétal gauche) et le quart inférieur droit (os pariétal droit).
Forage osseux de 5 trous intramédullaires dans la zone circonscrite par les cylindres (Figure 1)
1. Percer un trou intramédullaire sous irrigation saline (0,8 mm de diamètre, 1 mm de profondeur) avec une bur ronde sur l'os, au centre de la zone circonscrite par le cylindre. Assurez-vous que le saignement apparaît.
2. Percer deux autres trous intramédullaires le long de l'axe en passant par les deux vis d'onglet, aux bords intérieurs du cylindre. Le long de la hache perpendiculaire, percer deux autres trous intramédullaires aux bords intérieurs du cylindre. Assurez-vous que le saignement apparaît.
3. Répétez l'opération dans les trois autres cylindres.
Cylindres de remplissage avec des échantillons de matériaux et plafonnement (figure 3)
1. Préparer le matériau de substitution osseux désiré selon les instructions du fabricant ou les spécifications du matériau.
2. Remplissez le premier cylindre à ras bord avec l'échantillon de matériau et fermez le cylindre en ajustant le bouchon. Répétez le processus dans les 3 autres cylindres.
Fermeture du site chirurgical
1. Fermez la peau au-dessus des cylindres à l'aide d'une suture intermittente non résorbable.
2. Appliquer un pansement pulvérisable sur la plaie.

3. Traitement post-chirurgical

Arrêtez l'analgésie et l'anesthésie (arrêt de perfusion de propofol et de fentanyl) et vérifiez la récupération de la respiration autonome.
Arrêtez la ventilation une fois que l'animal a retrouvé une respiration autonome. Maintenir l'animal sous oxygène pur avant le réveil complet.
Injecter de la buprénorphine hydrochlorure SC (0,02 mg/kg, 0,03 mg/mL, 0,67 ml/kg) et répéter l'injection toutes les 6 h pendant 3 jours comme analgésie post-chirurgicale.
Transférer l'animal dans son logement habituel avec de l'eau et une alimentation complète.
Enlever les sutures après environ 10 jours de cicatrisation de la plaie.

Résultats

Le modèle décrit ci-dessus est consacré à l'évaluation de l'ostéoconduction chez les substituts osseux. L'ostéogenèse et l'ostéoinduction de substituts osseux (pré-)cellulaires ou chargés de molécules bioactives peuvent également être évaluées, ainsi que la vasculogenèse¹^,²^,³^,⁴^, ^{5 Annonces} ^,

Discussion

Le modèle décrit ci-contre est simple et doit être développé assez facilement tant que toutes les étapes sont suivies et que l'équipement est adapté. Comme le protocole décrit est une méthode chirurgicale, toutes les étapes semblent critiques et doivent être suivies correctement. Il est essentiel d'être formé pour des expériences animales, en particulier dans la manipulation du lapin et l'anesthésie. N'hésitez pas à demander de l'aide professionnelle d'anesthésiste et vétérinaire. Il est essentiel d'...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Les auteurs sont redevables à Geistlich AG (Wolhusen, CH) et à la Fondation d'Ostéologie (Lucerne, CH) (subvention n '18-049) pour leur soutien, ainsi que Global D (Brignais, FR) pour la fourniture des vis. Un merci particulier au Dr B. Schaefer de Geistlich. Nous remercions également Eliane Dubois et Claire Herrmann pour leur excellent traitement histologique et leurs précieux conseils. Enfin, nous remercions chaleureusement Xavier Belin, Sylvie Roulet et toute l'équipe du Pr Walid Habre, "chirurgie expérimentale Dpt", pour leur remarquable assistance technique.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drugs
Enrofloxacine Baytril 10%	Bayer		Antibiotic
Fentanyl	Bischel		For analgesia
Ketalar 50mg/ml	Pfizer		Ketamine for anesthesia
Lidohex	Bichsel		Lubricating gel for the eyes
Opsite	Smith and Nephew	66004978	Sprayable dressing
Povidone iodine 10%, Betadine	Mundipharma		anti-infective agent
Propofol 2%	Braun	3538710	For anesthesia
Rapidocain 2%	sintetica		Local anesthesia
Ringer-acetate	Fresenius Kabi		Volume compensation
Rompun 2%	Bayer		Xylazin for anesthesia
Sevoflurane 5%	Abbvie		For anesthesia
Sterile saline	Sintetica
Temgesic	Reckitt Benckiser		Buprenorphine hydrochloride, analgesia
Thiopental Inresa	Ospediala		For anesthesia
Xylocaine 10% spray	Astra Zeneca		For intubation
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Fresenius Vial pilot C	Imexmed		Infusion pump
Heated pad	Harvard Apparatus
Suction dominant 50	Medela
Suction tubing Optimus	Promedical	80342.2
Surgical motor	Schick dental	Qube	Drilling of intramedullary holes
Ventilation	Maquet Servo1
Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
Cylinders and caps	Boutyplast	Customized	composition: PEEK (poly ether ether ketone)
Manual self-retaining shaft	GlobalD	ACT1K
Mobile handle for self-retaining shaft	GlobalD	MTM
Self- drilling screws	GlobalD	VA1.2KL4	cross-drive screws composed by Titanium grade5, ISO 5832-3
Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical tray
Endotracheal tube Shiley diameter 2,5mm	Covidien	86233	For intubation
Endotracheal tube Shiley diameter 4,9mm	Covidien	107-35G	For intubation
Ethicon prolene 4-0	Ehticon	8581H	Non-resorbable suture
Forceps	Marcel Blanc	BD027R	145 mm
Intubation catheter	Cook medical		Guide for intubation
Needlle holder	Marcel Blanc	BM008R
Needles BD Microlance3	Becton Dickinson	300300/304622	26G; 18G
Periosteal	HU-Friedy	P9X
Round surgical burs	Patterson	78000	0.8 mm in diameter, Drilling of intramedullary holes
Scalpel	Swann-Morton		n°10 and n°15
Scissors	Marcel Blanc	00657	180 mm
Syringes Omnifix	Braun	4616057V	5ml, 10ml and 50ml
Venflon G22	Braun	42690985-01	Vasofix safety for the ear iv line

Références

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