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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui presentiamo un protocollo chirurgico nei conigli con l'obiettivo di valutare i materiali di sostituzione ossea in termini di capacità di rigenerazione ossea. Utilizzando cilindri PEEK fissati su teschi di coniglio, osteoconduzione, osteoinduzione, osteogenesi e vasculogenesi indotta dai materiali possono essere valutati su animali vivi o eutanasia.

Abstract

Il principio di base del modello calvariale del coniglio è quello di far crescere il nuovo tessuto osseo verticalmente sopra la parte corticale del cranio. Questo modello consente la valutazione dei materiali di sostituzione ossea per la rigenerazione ossea orale e craniofacciale in termini di crescita ossea e supporto neovascolare. Una volta che gli animali sono anestesizzati e ventilati (intubazione endotracheale), quattro cilindri in etere chetone (PEEK) sono avvitate sul cranio, su entrambi i lati delle suture mediane e coronali. Cinque fori intramedullari sono perforati all'interno dell'area ossea delimitata da ogni cilindro, consentendo l'afflusso di cellule del midollo osseo. I campioni di materiale vengono collocati nei cilindri che vengono poi chiusi. Infine, il sito chirurgico viene suturato e gli animali si risvegliano. La crescita ossea può essere valutata sugli animali vivi utilizzando la microtomografia. Una volta che gli animali sono eutanasia, la crescita ossea e la neovascolarizzazione possono essere valutate utilizzando microtomografia, immuno-istologia e immunofluorescenza. Poiché la valutazione di un materiale richiede la massima standardizzazione e calibrazione, il modello calvariale appare ideale. L'accesso è molto semplice, la calibrazione e la standardizzazione sono facilitate dall'uso di cilindri definiti e quattro campioni possono essere valutati simultaneamente. Inoltre, la tomografia viva può essere utilizzata e, in ultima analisi, si può prevedere una grande diminuzione degli animali da eutanasia.

Introduzione

Il modello calvariale di aumento osseo è stato sviluppato negli anni '90 con l'obiettivo di ottimizzare il concetto di rigenerazione ossea guidata (GBR) nel dominio chirurgico orale e craniofacciale. Il principio di base di questo modello è quello di far crescere il nuovo tessuto osseo verticalmente sopra la parte corticale del cranio. A tale scopo, un reattore (ad esempio, titanio -dome, -cilindro o -gabbia) è fissato sul cranio per proteggere la rigenerazione ossea condotta da un innesto (ad esempio, idrogel, sostituto osseo, ecc.). Con l'aiuto di questo modello, le gabbie in titanio o ceramica1,2,3,4,5,6, gbR membrane7,8,9 ,10, fattori osteogenici11,12,13,14,15,16,17, nuovo osso sostituisce12,16,17,18,19,20,21,22,23 , 24 Mi lasa' di , 25 mi lato , 26 del sistema di , 27 mi lapiùdel , 28 mi la più del 24 , 29 o il meccanismo di neovascolarizzazione durante il processo di rigenerazione ossea30.

Dal punto di vista traslazionale, il modello calvariale rappresenta un difetto di una parete che può essere paragonato a un difetto di classe IV nella mascella31. L'obiettivo è quello di far crescere un nuovo osso sopra un'area corticale, senza alcun supporto laterale da pareti ossee endogene. Il modello è quindi estremamente rigoroso e valuta il reale potenziale dell'osteoconduzione verticale sulla parte corticale dell'osso. Se il modello qui descritto è principalmente dedicato alla valutazione dell'osteoconduzione nei sostituti ossei, l'osteogenesi e/o l'osteoinduzione possono essere valutati, così come vasculogenesi1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30.

Essenzialmente per motivi etici, pratici ed economici, il modello calvariale è stato sviluppato nel coniglio in cui il metabolismo osseo e la struttura sono abbastanza rilevanti rispetto all'uomo32. Dei 30 riferimenti citati in precedenza, l'80% ha utilizzato il modello calvariale del coniglio1,2,3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13,14,15,17,22, 23,26,27,28,29,30,33, dimostrando così la rilevanza di questo modello animale. Nel 2008, il gruppo Busenlechner ha trasferito il modello calvariale al maiale, per consentire il confronto di otto sostituti ossei contemporaneamente20 (rispetto a due sostituti ossei con il coniglio). D'altra parte, il nostro gruppo ha trasferito il modello calvarialdi del coniglio alle pecore. In breve, le cupole di titanio sono state poste su teschi di pecora per caratterizzare l'osteoconduzione di un nuovo sostituto osseo stampato in 3D. Questi studi ci hanno permesso di sviluppare e padroneggiare il modello calvariale e la sua analisi16,21.

Gli ultimi tre studi citi16,20,21, insieme a diverse altre indagini12,17,18,19,22, 23,24,26,27,28,29, ha confermato il grande potenziale del modello calvariale come screening e caratterizzazione modellino. Tuttavia, anche se i risultati ottenuti sono stati abbastanza soddisfacenti, hanno anche evidenziato alcune limitazioni: (1) L'uso di cupole di titanio, che hanno impedito la diffusione dei raggi X e, a sua volta, l'uso di micro-CT dal vivo. Questi non potevano essere rimossi prima dell'elaborazione istologica, costringendo i ricercatori a incorporare i campioni nella resina poliettica (methacrita) di metiliato (PMMA). Le analisi risultanti sono state quindi in gran parte limitate alla topografia. (2) Costi finanziari elevati soprattutto a causa del costo degli animali e dei costi legati alla logistica, alla manutenzione e alla chirurgia degli animali. (3) Difficoltà nell'ottenere approvazioni etiche per gli animali di grandi dimensioni.

Un recente studio di Polo, et al.26 ha ampiamente migliorato il modello sul coniglio. Le cupole di titanio sono state sostituite da cilindri closable che potevano essere riempiti con un volume costante di materiale. Quattro di questi cilindri sono stati posizionati su teschi di coniglio. Al termine, i cilindri potevano essere rimossi in modo che le biopsie fossero prive di metalli, introducendo molta più flessibilità per quanto riguarda la lavorazione dei campioni. Il modello calvariale del coniglio è diventato interessante per i test simultanei con costi inferiori, facile gestione degli animali e facilitazione della lavorazione del campione. Approfittando di questi recenti sviluppi, abbiamo ulteriormente migliorato il modello sostituendo il titanio con PEEK per produrre cilindri, consentendo così la diffusione dei raggi X e l'uso della microtomografia su animali vivi.

In questo articolo, descriveremo i processi di anestesia e chirurgia e mostreremo esempi di uscite che possono essere ottenute utilizzando questo protocollo, cioè istologia (immuno-), istomorfometria, microtomografia viva ed ex vivo per valutare i meccanismi dell'osso rigenerazione e quantificare la nuova sintesi ossea supportata da materiali sostitutivi ossei.

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Protocollo

In linea con i requisiti giuridici svizzeri, il protocollo è stato approvato da un comitato accademico e supervisionato dalle agenzie veterinarie cantonali e federali (autorizzazioni n. GE/165/16 e GE/100/18).

1. Dispositivi e animali specifici

  1. Cilindri
    1. Cilindri di macchina con linguette di stabilizzazione laterale fuori peek per avere diametro interno di 5 mm, diametro esterno di 8 mm e un'altezza di 5 mm (Figura 1).
    2. Tappi PEEK macchina con un design che permette di agganciare con precisione sulla parte superiore del cilindro (spessore 1 mm).
    3. Sterilizzare i cilindri e i tappi PEEK automatizzando l'autoclaving prima dell'intervento chirurgico.
  2. Viti
    1. Utilizzare microviti autoforanti (realizzati in titanio puro commerciale (grado 5)) per fissare i cilindri (1,2 mm di diametro, 4 mm di lunghezza). Sterilizzare da autoclaving prima dell'intervento chirurgico.
  3. Animali
    1. Acquistare conigli bianchi della Nuova èelanda di tre mesi (maschio o femmina), del peso di 2,5 kg ciascuno.
      NOTA: Abbiamo ottenuto conigli allevando presso l'Università di Ginevra.

2. Chirurgia

  1. Vassoio chirurgico
    1. Tenere bisturi, forbici, due pinze, ascensore periosteal, siringhe (1, 2, 5, 50 mL), motore chirurgico, borchie chirurgiche rotonde (0,8 mm di diametro), aghi, sterile salina, quattro cilindri, otto viti e cacciavite pronto.
  2. Trattamento preclinico
    1. Acclimatare gli animali una settimana prima dell'intervento.
    2. Fornire un antibiotico profilattico al giorno (5-10 mg/kg per bocca (PO)) a partire 2 h prima dell'intervento chirurgico fino a 3 giorni dopo l'intervento chirurgico.
  3. Anestesia e intubazione
    1. Sedano gli animali mediante iniezione intramuscolare (IM) di ketamina (25 mg/kg, 50 mg/mL, 0,5 mL/kg) - xylazin (3 mg/kg, 20 mg/mL, 0,15 mL/kg). Aspetta 20 min perché gli animali dormano
      profondamente (completa atonia muscolare).
      NOTA: Questa premedicazione consentirà un processo di intubazione semplice, veloce e indolore. L'analgesia profonda e l'anestesia sono indotte come descritto al punto 2.3.8.
    2. Inserire una cannula endovenosa (IV) nella vena marginale dall'orecchio e tenerla chiusa fino al completamento dell'intubazione.
      NOTA: Questa linea IV servirà a perfondere fentanil e propofol per analgesia profonda e anestesia, rispettivamente (vedere il passo 2.3.8).
    3. Mantenere l'anestesia fornendo il 5% di sevoflurane in ossigeno puro fino a quando non viene eseguita l'intubazione.
      NOTA: Questo passaggio è necessario solo se l'animale mostra segni di risveglio (movimenti oculari, contrazioni muscolari).
    4. Anestesizzare la trachea localmente spruzzando il 10% di lidocaina. Posizionare il coniglio in posizione prona e mantenere la testa in estensione verticale.
    5. Far scorrere il primo tubo endotracheale di piccolo diametro (2,5 mm) nella trachea del coniglio fino a quando il flusso d'aria non può essere udito nel tubo. Questo aprirà la larynx e faciliterà l'inserimento del tubo definitivo.
    6. Inserire una guida (catetere di intubazione) nel tubo per fissare la posizione del tubo nella trachea. Rimuovere il tubo di piccolo diametro e far scorrere il tubo endotracheale definitivo (4,9 mm) sulla guida.
    7. Rimuovere la guida e gonfiare il palloncino alla fine del tubo endotracheale per sigillare e bloccare il dispositivo nella trachea. Il tubo rimarrà in posizione, ma può essere fissato utilizzando un pizzo legato intorno alla fronte.  Ventilare immediatamente (7 mL/kg, frequenza di 40/min) l'animale con il 3% di sevoflurane in ossigeno puro.
    8. Perfusi (vena dell'orecchio) fentanil (0,01 mg/mL, 2–4 mL/h) per indurre analgesia, 2-4 mg/kg di (2%) propofol (20 mg/mL, 4-8 mL/h) per indurre l'anestesia e 4 mL/kg/h dell'acetato di Ringer per mantenere le condizioni iso-volumetriche.
    9. Posizionare una sonda di temperatura rettale. Monitorare anche la funzione cardiaca, temperatura e saturazione di ossigeno durante l'intero processo.
    10. Controllare la profondità dell'anestesia monitorando la respirazione autonoma; se l'animale mostra segni di respirazione autonoma, dispensa un piccolo bolo di propofol e fentanil.
  4. Preparazione del sito
    1. Posizionare il coniglio su un cuscinetto riscaldato (39 gradi centigradi) coperto da un materasso (per evitare ustioni) sul tavolo dell'intervento. Rasa il cuoio capelluto.
    2. Applicare un gel lubrificante sugli occhi per evitare irritazioni e secchezza. Disinfettare il sito strofinando la pelle con iodio povidone (10%). Quindi drappeggiare il coniglio con un drappo chirurgico sterile e ritagliare un'area di accesso per il cranio.
    3. Disinfettare il sito chirurgico con iodio povidone (10%) per la seconda volta. Applicare un gel lubrificante sugli occhi per evitare irritazioni e secchezza.
    4. Preparare un tavolo drappeggiato (drappo sterile) su cui posizionare il vassoio chirurgico completo.
  5. Apertura del sito chirurgico
    1. Anestesizzare localmente con un'iniezione sottocutanea (SC) di lidocaina 2% (1 mL) sul cranio.
    2. Incise attraverso la pelle (con un bisturi) lungo la linea sagittale calvariale, dalle orbite alla protuberanza occipitale esterna (lunghezza 4 cm). Assicurarsi che il periosteo sia inciso.
    3. Elevare delicatamente il periosteo (con un ascensore periosteal) su entrambi i lati dell'incisione. Risciacquare il sito con salina sterile.
  6. Posizionamento cilindro
    1. Individuare le suture mediane e coronali sul cranio (Figura 2A, B). Si noti che queste linee anatomiche formano una croce. I cilindri saranno posizionati in ciascuno dei quadranti definiti dalla croce, assicurando che il bordo del cilindro non sia sopra la sutura (Figura 2C).
    2. Posizionare il primo cilindro sul quadrante superiore sinistro (osso frontale sinistro) e provare a appoggiare il dispositivo. Fissare in posizione con una forte pressione della mano e avvitare un micro-vite, fino a quando la resistenza è sentito. Assicurarsi che la testa della vite sia a filo con la superficie della linguetta del cilindro.
    3. Ripetere la stessa procedura sull'altra linguetta per fissare il cilindro saldamente sul cranio. Assicurarsi che il cilindro sia fissato ermeticamente all'osso.
    4. Ripetere la procedura sul quarto superiore destro (osso frontale destro), nel quarto inferiore sinistro (osso parietale sinistro) e nel quarto inferiore destro (osso parietale destro).
  7. Foratura ossea di 5 fori intramedullari all'interno dell'area circoscritta dai cilindri (Figura 1)
    1. Forare un foro intramedullare sotto l'irrigazione salina (0,8 mm di diametro, 1 mm di profondità) con un bur rotondo sull'osso, al centro dell'area circoscritta dal cilindro. Assicurarsi che comanda un'emorragia.
    2. Forare altri due fori intramedullari lungo l'asse passando attraverso le due viti di tabulazione, ai bordi interni del cilindro. Lungo l'ascia perpendicolare, praticare altri due fori intramedullari ai bordi interni del cilindro. Assicurarsi che comanda un'emorragia.
    3. Ripetere l'operazione all'interno degli altri tre cilindri.
  8. Cilindri di riempimento con campioni di materiale e tamponatura (Figura 3)
    1. Preparare il materiale sostitutivo osseo desiderato secondo le istruzioni del produttore o le specifiche del materiale.
    2. Riempire il primo cilindro fino all'orlo con il campione di materiale e chiudere il cilindro montando il tappo. Ripetere il processo negli altri 3 cilindri.
  9. Chiusura di un sito chirurgico
    1. Chiudere la pelle sopra i cilindri con una sutura intermittente non riassorbibile.
    2. Applicare una medicazione spruzzabile sulla ferita.

3. Trattamento post-chirurgico

  1. Fermare l'analgesia e l'anestesia (propofol e fentanil perfusione arresto) e controllare il recupero della respirazione autonoma.
  2. Fermare la ventilazione una volta che l'animale ha recuperato la respirazione autonoma. Mantenere l'animale sotto ossigeno puro prima del risveglio completo.
  3. Iniettare buprenorfina cloridrica SC (0,02 mg/kg, 0,03 mg/mL, 0,67 mL/kg) e ripetere l'iniezione ogni 6 h per 3 giorni come analgesia post-chirurgica.
  4. Trasferire l'animale nella sua solita custodia con acqua e alimentazione completa.
  5. Rimuovere le suture dopo circa 10 giorni di guarigione della ferita.

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Risultati

Il modello qui descritto è dedicato alla valutazione dell'osteoconduzione nei sostituti ossei. Possono essere valutate anche l'osteogenesi e/osteoinduzione di sostituti ossei (pre)cellularizzati o caricati con molecole bioattive, nonché vascologenesi1,2,3,4, 5 Del numero 3( , 6 È possibile:...

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Discussione

Il modello qui descritto è semplice e deve essere sviluppato abbastanza facilmente fino a quando tutti i passaggi sono seguiti e l'attrezzatura è adatta. Come il protocollo descritto è un metodo chirurgico, tutti i passaggi appaiono critici e devono essere seguiti correttamente. È fondamentale essere addestrati per esperimenti sugli animali, soprattutto nella manipolazione del coniglio e nell'anestesia. Non esitate a chiedere aiuto anestesista e veterinario professionale. È fondamentale insistere sul monitoraggio vi...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Gli autori sono in debito con Geistlich AG (Wolhusen, CH) e la fondazione di Osteologia (Lucerna, CH) (grant n.18-049) per il loro sostegno, così come Global D (Brignais, FR) per la fornitura delle viti. Un ringraziamento particolare va al dottor B. Schaefer di Geistlich. Siamo anche grati a Eliane Dubois e Claire Herrmann per la loro eccellente elaborazione istologica e i loro preziosi consigli. Infine, riconosciamo calorosamente Xavier Belin, Sylvie Roulet e l'intero team di Pr Walid Habre, "chirurgia sperimentale Dpt", per la loro notevole assistenza tecnica.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Drugs
Enrofloxacine Baytril 10%BayerAntibiotic
FentanylBischelFor analgesia
Ketalar 50mg/mlPfizerKetamine for anesthesia
LidohexBichselLubricating gel for the eyes
OpsiteSmith and Nephew66004978Sprayable dressing
Povidone iodine 10%, BetadineMundipharmaanti-infective agent
Propofol 2%Braun3538710For anesthesia
Rapidocain 2%sinteticaLocal anesthesia
Ringer-acetateFresenius KabiVolume compensation
Rompun 2%BayerXylazin for anesthesia
Sevoflurane 5%AbbvieFor anesthesia
Sterile salineSintetica
TemgesicReckitt BenckiserBuprenorphine hydrochloride, analgesia
Thiopental InresaOspedialaFor anesthesia
Xylocaine 10% sprayAstra ZenecaFor intubation
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
Fresenius Vial pilot CImexmedInfusion pump
Heated padHarvard Apparatus
Suction dominant 50Medela
Suction tubing OptimusPromedical80342.2
Surgical motorSchick dentalQubeDrilling of intramedullary holes
VentilationMaquet Servo1
NameCompanyCatalog NumberComments
Material
Cylinders and capsBoutyplastCustomizedcomposition: PEEK (poly ether ether ketone)
Manual self-retaining shaftGlobalDACT1K
Mobile handle for self-retaining shaftGlobalDMTM
Self- drilling screwsGlobalDVA1.2KL4cross-drive screws composed by Titanium grade5, ISO 5832-3
NameCompanyCatalog NumberComments
Surgical tray
Endotracheal tube Shiley diameter 2,5mmCovidien86233For intubation
Endotracheal tube Shiley diameter 4,9mmCovidien107-35GFor intubation
Ethicon prolene 4-0Ehticon8581HNon-resorbable suture
ForcepsMarcel BlancBD027R145 mm
Intubation catheterCook medicalGuide for intubation
Needlle holderMarcel BlancBM008R
Needles BD Microlance3Becton Dickinson300300/30462226G; 18G
PeriostealHU-FriedyP9X
Round surgical bursPatterson780000.8 mm in diameter, Drilling of intramedullary holes
ScalpelSwann-Mortonn°10 and n°15
ScissorsMarcel Blanc00657180 mm
Syringes OmnifixBraun4616057V5ml, 10ml and 50ml
Venflon G22Braun42690985-01Vasofix safety for the ear iv line

Riferimenti

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