מודל calvarial של הגדלת עצם בארנב להערכת צמיחת העצם ונינובאסקולריזציה בחומרים החלפת עצם

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול כירורגי ארנבים עם המטרה להעריך חומרים החלפת עצם במונחים של יכולות התחדשות העצם. על-ידי שימוש בגלילים הצצה הקבועים על גולגלות הארנבים, האוסטאופהלוגיה, אוסטורגנזה, אוסטג'נסיס וביוקולוגנזה הנגרמת על ידי החומרים עשויים להיות מוערכים על בעלי חיים חיים או מורדמים.

Abstract

העיקרון הבסיסי של מודל כיפת ארנב הוא לגדל רקמת עצם חדשה אנכית על גבי החלק של קליפת המוח של הגולגולת. מודל זה מאפשר הערכה של חומרים החלפת עצם עבור התחדשות העצם אוראלי הגולגולת במונחים של צמיחת העצם ו ניאוואסקולריזציה תמיכה. לאחר בעלי חיים הם מורדם ומאוורר (אנציקנה צנרור), ארבעה צילינדרים עשוי פוליאטר אתר קטון (מבט חטוף) הם דפקו על הגולגולת, משני צידי החציון ותפרים ילתית. חמש החורים הפנימי הם קדח בתוך אזור העצם מופרדים על ידי כל גליל, המאפשר זרם של תאים מח עצם. דגימות החומר ממוקמות לתוך הצילינדרים שנסגרו לאחר מכן. לבסוף, האתר הכירורגי משמים, ובעלי חיים הם להתעורר. צמיחת עצם עשויה להיות מוערך על חיות חיים באמצעות microtomography. לאחר בעלי חיים מורדמים, צמיחה עצם ו ניאוואסקולריזציה ניתן להעריך באמצעות microtomography, היסטולוגיה-החיסונית ו immunofluorescence. כאשר הערכה של חומר דורשת סטנדרטיזציה מקסימלית וכיול, מודל כיפת מופיע אידיאלי. Access קל מאוד, כיול וסטנדרטיזציה הם הקלה על ידי שימוש של צילינדרים מוגדרים ארבע דגימות ניתן להעריך בו. יתרה מזאת, ניתן להשתמש בטומוגרפיה חיה ובסופו של דבר ירידה גדולה בבעלי חיים מורדמים.

Introduction

מודל כיפת של הגדלת העצם פותחה בשנת 90 עם המטרה כדי לייעל את הרעיון של התחדשות עצם מודרך (gbr) בתחום כירורגי אוראלי הגולגולת. העיקרון הבסיסי של המודל הזה הוא לגדל רקמת עצם חדשה אנכית על גבי החלק של קליפת המוח של הגולגולת. כדי לעשות זאת, כור (למשל, טיטניום כיפה,-גליל או כלוב) הוא קבוע על הגולגולת כדי להגן על התחדשות העצם שנערך על ידי השתל (למשל, הידרוג'ל, עצם תחליף, וכו '). בעזרת מודל זה, טיטניום או כלובים קרמיים^1,2,3,4,5,6, ממברנות gbr^{7,8,9 ,10}, גורמים אוסטגניים^{11,12,13,14,15,16,17}, עצם חדש מחליפים^{12,16,17,18,19,20,21,22,23 ,} בת ^{24 ,} מיכל בן ^{25 ,} מיכל בן ^{26 ,} בן ^{27 ,} מיכל בן ^{28 , 29} או המנגנון של ניאוואסקולריזציה במהלך תהליך התחדשות העצם³⁰ העריכו.

מנקודת מבט טרנסלבית, מודל הקאלוריון מייצג פגם בקיר אחד שניתן להשוותו לפגם בדרגה הרביעית בלסת³¹. המטרה היא לגדל עצם חדש מעל אזור קורטיקלית, ללא תמיכה לרוחב של קירות עצם אנדוגניים. המודל הוא ולכן מחמיר מאוד ומעריך את הפוטנציאל האמיתי של אוסטאנהולכה אנכית על החלק הקורטיקלי של העצם. אם המודל המתואר בזאת מוקדש בעיקר להערכת האוסטאופת בתחליפי עצמות, ניתן להעריך גם אוסטגנזה ו/או אוסטיואינדוקציה, כמו גם ואסיקולוגנזה^{1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11},¹²,^{13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24},^{25,26,27,28,29,30}.

למעשה עבור מסיבות אתיות, מעשיות וכלכליות, מודל כיפת פותחה בארנב שבו חילוף החומרים ומבנה העצם הם רלוונטיים בהשוואה לאדם³²אנושי. של 30 ההפניות המצוטטות לעיל, 80% השתמשו במודל הארנב^{1,2,3,4,5,6,7},^{8 ,9,10},^{11, 12,13,14,15,17,22}, ^{23,26,27,28,29},^30,33, ובכך מדגימים את הרלוונטיות של דגם בעל חיים זה. בשנת 2008, הקבוצה של בוסקנר העבירה את מודל כיפת לחזיר, כדי לאפשר השוואה של שמונה תחליפי עצמות בו זמנית²⁰ (בהשוואה לשתי תחליפי עצמות עם הארנב). מצד שני, הקבוצה שלנו העבירה את המודל הקלוריון של הארנב לכבשים. בקצרה, כיפות טיטניום הונחו על גולגלות כבשים כדי לאפיין את אוסטאנההולכה של תחליף העצם המודפס החדש 3D. מחקרים אלה אפשרו לנו לפתח ולשלוט במודל הקלוריון ובניתוח^16,21.

שלושת המחקרים האחרונים ציינו^16,20,21, יחד עם מספר חקירות נוספות^{12,17,18,19,22}, ²³,^24,26,27,28,²⁹, אישר את הפוטנציאל הגדול של מודל כיפת כהקרנה ואפיון ודל. עם זאת, למרות שהתוצאות התקבלו היו די מספקות, הם גם הצביעו על כמה מגבלות: (1) השימוש של כיפות טיטניום, אשר מנעו דיפוזיה רנטגן ו בתורו חי מיקרו-CT שימוש. אלה לא ניתן להסיר לפני עיבוד היסטולוגית, לאלץ את החוקרים להטביע את הדגימות ב-שרף (מתיל מתיונין) (PMMA). לפיכך, הניתוחים שהתקבלו היו מוגבלים במידה רבה לטופוגרפיה. (2) עלויות פיננסיות גבוהות במיוחד בשל העלות של בעלי החיים, והעלויות הקשורות ללוגיסטיקה, אחזקה וניתוח בעלי החיים. (3) קשיים להשיג אישורים אתיים לבעלי חיים גדולים.

מחקר שנערך לאחרונה על ידי פולו, ואח '²⁶ שיפרה במידה רבה את המודל על הארנב. כיפות טיטניום הוחלפו על ידי צילינדרים קלובל כי יכול להיות מלא בנפח קבוע של חומר. ארבעה מהצילינדרים האלה. הושמו על גולגולות ארנבים בסיום, ניתן להסיר את הגלילים כך שביופסיות יהיו חופשיות מתכת, המציגים גמישות רבה יותר בנוגע לעיבוד המדגם. מודל כיפת הארנב הפך אטרקטיבי עבור בדיקות סימולטני עם עלויות נמוכות יותר, בעלי חיים קלים טיפול והקלה על עיבוד לדוגמה. ניצול ההתפתחויות האחרונות, יש לנו שיפור נוסף המודל על ידי החלפת טיטניום עם מבט לייצר צילינדרים, ובכך לאפשר דיפוזיה רנטגן ושימוש microtomography על חיות חיים.

במאמר זה, ניתן לתאר את תהליכי ההרדמה וניתוח ולהראות דוגמאות של תפוקות שניתן להשיג באמצעות פרוטוקול זה, כלומר, (אימונו-) היסטולוגיה, histomorphometry, לחיות ולשעבר vivo מיקרוטומוגרפיה כדי להעריך את מנגנוני העצם התחדשות ומכמת את סינתזה העצם החדש נתמך על ידי חומרים תחליף עצם.

Protocol

בקנה אחד עם דרישות משפטיות שוויצריות, הפרוטוקול אושר על ידי ועדה אקדמית ובפיקוח על ידי סוכנויות וטרינרי הפדרלי של הקנטונים (האישורים n ° GE/165/16 ו-GE/100/18).

1. התקנים ובעלי מפרט ספציפיים

1. צילינדרים
   1. צילינדרים מכונות עם כרטיסיות ייצוב לרוחב מתוך הצצה יש קוטר פנימי של 5 מ"מ, קוטר החיצוני של 8 מ"מ גובה של 5 מ"מ (איור 1).
   2. מכונת הצצה עם עיצוב המאפשר חיתוך בדיוק על החלק העליון של גליל (עובי 1 מ"מ).
   3. לעקר צילינדרים הצצה וכובעים על ידי אוטוקלינג לפני הניתוח.
2. ברגים
   1. השימוש עצמית קידוח מיקרו ברגים (עשוי טיטניום טהור מסחרי (כיתה 5)) כדי לתקן את צילינדרים (1.2 מ"מ קוטר, 4 מ"מ אורך). לחטא על ידי אוטוקלינג. לפני הניתוח
3. חיות
   1. רכישת שלושה חודשים-בן ניו זילנד לבן ארנבים (זכר או נקבה), שוקל ~ 2.5 ק ג כל אחד.
      הערה: הצלחנו להשיג ארנבים באמצעות הרבייה באוניברסיטת ז'נבה.

2. כירורגיה

1. מגש כירורגי
   1. לשמור על אזמל, מספריים, שני מלקחיים, מעלית הקרום, מזרקים (1, 2, 5, 50 mL), כירורגי מנוע, עגול כירורגי burs (0.8 מ"מ קוטר), מחטים, תמיסת מלח סטרילי, ארבעה צילינדרים, שמונה ברגים, ו מברג מוכן.
2. טיפול טרום-קליני
   1. Acclimate את החיות שבוע לפני הניתוח.
   2. לספק אנטיביוטיקה מניעתי יומית (5 – 10 מ"ג/ק"ג לפי פה (PO)) החל 2 h לפני הניתוח עד 3 ימים לאחר הניתוח.
3. הרדמה וצנרור
   1. הרגעה בעלי חיים על ידי הזרקה (IM) הזרקת של קטמין (25 מ"ג/ק"ג, 50 mg/mL, 0.5 mL/ק"ג) + xylazin (3 מ"ג/ק"ג, 20 מ"ג/mL, 0.15 מ ל/ק"ג). לחכות ~ 20 דקות לחיות לישון
      עמוק (atony שרירי להשלים).
      הערה: תרופות מקדימות אלה יאפשרו תהליך של צנרור פשוט, מהיר ונטול כאבים. כאבים עמוקים והרדמה נגרמת כמתואר בשלב 2.3.8.
   2. הניחו צינורית ורידי לתוך הווריד השולי מהאוזן ושמרו אותה סגורה עד להשלמת הצנרור.
      הערה: קו IV זה ישמש לעשות פנטניל ולהצעת משככי כאבים עמוקים והרדמה, בהתאמה (ראה שלב 2.3.8).
   3. לשמור על ההרדמה על ידי אספקת 5% סבלאנה חמצן טהור עד הצנרור מבוצע.
      הערה: שלב זה הכרחי רק אם בעל החיים מראה סימנים של התעוררות (תנועות עיניים, התכווצויות שרירים).
   4. . על-ידי ריסוס של 10% לידוקאין מניחים את הארנב בתנוחה מועדת ושומרים על ראשו בשלוחה אנכית.
   5. החלק את הצינור האנדוקנה הראשון של קוטר קטן (2.5 מ"מ) לתוך קנה הנשימה של הארנב עד שניתן יהיה לשמוע את זרימת האוויר בשפופרת. זה יפתח את הגרון ויקל על החדרת הצינור הסופי.
   6. הוסף מדריך (קטטר צנרור) בצינור כדי לתקן את המיקום של הצינור לתוך קנה הנשימה. הסר את שפופרת בקוטר קטן להחליק את צינור האנדוקנה הסופי (4.9 מ"מ) על המדריך.
   7. הסר את המדריך ולנפח את הבלון בסוף הצינור האנדוקנה כדי לאטום ולחסום את המכשיר לתוך קנה הנשימה. הצינורית תישאר במקומה, אך היא עשויה להיות מאובטחת באמצעות תחרה הקשור סביב המצח.  מייד האוויר (7 מ"ל/ק"ג, תדירות של 40/דקות) בעל החיים עם 3% סבלאנה בחמצן טהור.
   8. באופן רציף (וריד האוזן) פנטניל (0.01 mg/mL, 2 – 4 מ"ל/h) כדי לגרום לחוסר כאבים, 2 – 4 מ"ג/ק"ג של (2%) ההצעת (20 מ"ג/mL, 4 – 8 מ ל/ח) כדי לגרום להרדמה, ו 4 מ ל/ק"ג/h של אצטט של צלצול לשמור על iso-נפחי תנאים.
   9. . מניחים לווין בטמפרטורה רקטלית כמו כן, לפקח על תפקוד הלב, טמפרטורה ורווית חמצן במהלך התהליך כולו.
   10. שלוט בעומק ההרדמה על ידי ניטור הנשימה האוטונומית; אם בעל החיים מראה סימנים של נשימה אוטונומית, מוותר על מנת להיפטר ממנה קטנה של הסדר והפנטניל.
4. הכנת האתר
   1. מניחים את הארנב על משטח מחומם (39 ° c) מכוסה על ידי כרית מזרן (כדי למנוע כוויות) על שולחן הניתוח. . תגלח את הקרקפת
   2. החלת ג'ל סיכה על העיניים כדי למנוע גירוי ויובש. לחטא את האתר על ידי קרצוף העור עם יוד povidone (10%). ואז לעטוף את הארנב עם העטוף כירורגי סטרילי לחתוך את אזור הגישה לגולגולת.
   3. לחטא את האתר כירורגי עם יוד povidone (10%) בפעם השנייה החלת ג'ל סיכה על העיניים כדי למנוע גירוי ויובש.
   4. הכינו שולחן עטוף (עטוף סטרילי) שעליו למקם את המגש הכירורגי המלא.
5. פתיחת אתר כירורגי
   1. להרדמה מקומית עם הזרקת תת עורית (SC) של לידוקאין 2% (1 mL) על הגולגולת.
   2. מעבר דרך העור (עם אזמל) לאורך קו משונן כיפת, מן המסלולים לכיוון העורף החיצוני (~ 4 ס מ אורך). ודא כי הקרום מונצח.
   3. העלה בעדינות את הקרום (עם מעלית הקרום) משני צידי החתך. שטפו את האתר בתמיסת מלח סטרילית.
6. מיקום צילינדר
   1. אתר את התפר החציוני ואת התפרים הקורואליות על הגולגולת (איור 2A, B). שימו לב כי קווים אנטומיים אלה יוצרים צלב. הגלילים ימוקמו בכל אחד מהרביעים המוגדרים על ידי הצלב, ויבטיח ששולי הגליל לא יהיו מעל לתפר (איור 2C).
   2. מניחים את הגליל הראשון על הרביע העליון השמאלי (העצם הקדמית שמאל), ולנסות להניח את המכשיר שטוח. לתקן את המיקום עם לחץ ידיים חזק להרוס מיקרו בורג, עד התנגדות הוא הרגיש. ודא שראש הבורג מיושר עם פני השטח של לשונית הצילינדר.
   3. חזור על אותו ההליך בכרטיסיה האחרת כדי לתקן את הצילינדר בחוזקה על הגולגולת. ודא כי הצילינדר הוא רמטית קבוע לעצם.
   4. חזור על ההליך ברבעון העליון הימני (עצם הקדמית הימנית), הרבעון התחתון השמאלי (עצם הקודקוד השמאלי) והחלק הימני התחתון (עצם הקודקוד הימני).
7. קידוח עצם של 5 חורים מתוך מדולרי באזור להקיף את צילינדרים (איור 1)
   1. מקדחה חור מתוך מדולרי תחת השקיה מלוחים (0.8 מ"מ בקוטר, ~ 1 מ"מ לעומק) עם סיבוב מעוגל על העצם, במרכז האזור להקיף את הגליל. ודא שהדימום מופיע.
   2. לקדוח שני חורים למטה עוד מדולרי לאורך הציר עובר דרך שני ברגים כרטיסיה, בקצוות הפנימיים של הצילינדר. לאורך הגרזן הניצב, לקדוח שני חורים יותר מתוך מדולרי בקצוות הפנימיים של הגליל. ודא שהדימום מופיע.
   3. חזור על הפעולה בתוך שלושת הצילינדרים האחרים.
8. מילוי צילינדרים בדגימות חומר וסימתי (איור 3)
   1. הכן את חומר תחליף העצם הרצוי על פי הוראות היצרן או מפרט חומרים.
   2. ממלאים את הצילינדר הראשון עד הסוף עם דגימת החומר ולסגור את הגליל על ידי התאמת כובע. חזור על התהליך ב 3 צילינדרים אחרים.
9. סגירת אתר כירורגית
   1. סגרו את העור מעל הצילינדרים עם תפר שאינו נספג לסירוגין.
   2. למרוח תחבושת על הפצע.

3. טיפול לאחר ניתוח

1. הפסיקו את המחסור בחוסר כאבים ובהרדמה (מעצר הרדמה ופנטניל) ובדקו את ההתאוששות של הנשימה האוטונומית.
2. הפסיקו את האוורור ברגע. שהחיה התאוששה מנשימות אוטונומיות שמרו על החיה תחת חמצן טהור לפני התעוררות מוחלטת.
3. הכנס בופרנורפין הידרוכלוריד SC (0.02 מ"ג/ק"ג, 0.03 mg/mL, 0.67 mL/ק"ג) ולחזור על הזריקה כל 6 h עבור 3 ימים כאבים שלאחר ניתוח.
4. להעביר את החיה לתוך הדיור הרגיל שלה עם מים והאכלה מלאה.
5. להסיר את התפרים לאחר כ 10 ימים של ריפוי בפצע.

תוצאות

המודל המתואר להלן מוקדש להערכת אוסטאליה בתחליפי עצמות. אוסטגנזה ו-או אוסטד של תחליפי עצם או (טרום) תאית או טעון עם מולקולות אקטיביים יכול להיות גם מוערך, כמו גם vasculogenesis^1,2,3,4, מיכל ^{5 ,...}

Discussion

המודל המתואר בזאת הוא פשוט ויש לפתח בקלות רבה כל עוד הצעדים מיועדים והציוד מתאים. כאשר הפרוטוקול המתואר הוא שיטה כירורגית, כל השלבים נראים קריטיים ויש לעקוב כראוי. זה קריטי להיות מאומן עבור ניסויים בבעלי חיים, במיוחד בטיפול בארנבים והרדמה. אל תהססו לבקש עזרה ההרדמה מקצועית והוטרינר. חשוב ל...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drugs
Enrofloxacine Baytril 10%	Bayer		Antibiotic
Fentanyl	Bischel		For analgesia
Ketalar 50mg/ml	Pfizer		Ketamine for anesthesia
Lidohex	Bichsel		Lubricating gel for the eyes
Opsite	Smith and Nephew	66004978	Sprayable dressing
Povidone iodine 10%, Betadine	Mundipharma		anti-infective agent
Propofol 2%	Braun	3538710	For anesthesia
Rapidocain 2%	sintetica		Local anesthesia
Ringer-acetate	Fresenius Kabi		Volume compensation
Rompun 2%	Bayer		Xylazin for anesthesia
Sevoflurane 5%	Abbvie		For anesthesia
Sterile saline	Sintetica
Temgesic	Reckitt Benckiser		Buprenorphine hydrochloride, analgesia
Thiopental Inresa	Ospediala		For anesthesia
Xylocaine 10% spray	Astra Zeneca		For intubation
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Fresenius Vial pilot C	Imexmed		Infusion pump
Heated pad	Harvard Apparatus
Suction dominant 50	Medela
Suction tubing Optimus	Promedical	80342.2
Surgical motor	Schick dental	Qube	Drilling of intramedullary holes
Ventilation	Maquet Servo1
Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
Cylinders and caps	Boutyplast	Customized	composition: PEEK (poly ether ether ketone)
Manual self-retaining shaft	GlobalD	ACT1K
Mobile handle for self-retaining shaft	GlobalD	MTM
Self- drilling screws	GlobalD	VA1.2KL4	cross-drive screws composed by Titanium grade5, ISO 5832-3
Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical tray
Endotracheal tube Shiley diameter 2,5mm	Covidien	86233	For intubation
Endotracheal tube Shiley diameter 4,9mm	Covidien	107-35G	For intubation
Ethicon prolene 4-0	Ehticon	8581H	Non-resorbable suture
Forceps	Marcel Blanc	BD027R	145 mm
Intubation catheter	Cook medical		Guide for intubation
Needlle holder	Marcel Blanc	BM008R
Needles BD Microlance3	Becton Dickinson	300300/304622	26G; 18G
Periosteal	HU-Friedy	P9X
Round surgical burs	Patterson	78000	0.8 mm in diameter, Drilling of intramedullary holes
Scalpel	Swann-Morton		n°10 and n°15
Scissors	Marcel Blanc	00657	180 mm
Syringes Omnifix	Braun	4616057V	5ml, 10ml and 50ml
Venflon G22	Braun	42690985-01	Vasofix safety for the ear iv line