Modelo Calvarial de Aumento Óseo en Conejo para Evaluación del Crecimiento Óseo y Neovascularización en Materiales de Sustitución Ósea

Resumen

Aquí presentamos un protocolo quirúrgico en conejos con el objetivo de evaluar materiales de sustitución ósea en términos de capacidades de regeneración ósea. Mediante el uso de cilindros PEEK fijados en cráneos de conejo, osteoconducción, osteoinducción, osteogénesis y vasculogénesis inducidas por los materiales pueden evaluarse ya sea en animales vivos o eutanasiados.

Resumen

El principio básico del modelo calvarial de conejo es cultivar nuevo tejido óseo verticalmente en la parte superior de la parte cortical del cráneo. Este modelo permite la evaluación de materiales de sustitución ósea para la regeneración ósea oral y craneofacial en términos de crecimiento óseo y apoyo de neovascularización. Una vez que los animales son anestesiados y ventilados (intubación endotraqueal), cuatro cilindros de cetona de éter de poliéter (PEEK) se atornillan sobre el cráneo, a ambos lados de la mediana y coronal suturas. Se perforan cinco agujeros intramedulares dentro del área ósea delimitada por cada cilindro, lo que permite la afluencia de células de médula ósea. Las muestras de material se colocan en los cilindros que luego se cierran. Finalmente, se sutura el sitio quirúrgico, y los animales se despiertan. El crecimiento óseo puede evaluarse en animales vivos mediante microtomografía. Una vez que los animales son eutanasiados, el crecimiento óseo y la neovascularización pueden evaluarse mediante microtomografía, inmunohistología e inmunofluorescencia. Como la evaluación de un material requiere la máxima estandarización y calibración, el modelo calvarial parece ideal. El acceso es muy fácil, la calibración y la estandarización se facilitan mediante el uso de cilindros definidos y se pueden evaluar cuatro muestras simultáneamente. Además, se puede utilizar una tomografía viva y, en última instancia, se puede prever una gran disminución de animales a eutanasiar.

Introducción

El modelo calvarial de aumento óseo fue desarrollado en los años 90 con el objetivo de optimizar el concepto de regeneración ósea guiada (GBR) en el dominio quirúrgico oral y craneofacial. El principio básico de este modelo es cultivar nuevo tejido óseo verticalmente en la parte superior de la parte cortical del cráneo. Para ello, un reactor (por ejemplo, titanio -dome, -cilindro o -jaula) se fija en el cráneo para proteger la regeneración ósea llevada a cabo por un injerto (por ejemplo, hidrogel, sustituto óseo, etc.). Con la ayuda de este modelo, jaulas de titanio o cerámica^1,2,3,4,5,6, membranas GBR^{7,8,9 ,10}, factores osteogénicos^{11,12,13,14,15,16,17}, hueso nuevo suplentes^{12,16,17,18,19,20,21,22,23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29} o el mecanismo de neovascularización durante el proceso de regeneración ósea³⁰ se evaluaron.

Desde un punto de vista traslacional, el modelo calvarial representa un defecto de una pared que se puede comparar con un defecto de clase IV en la mandíbula^31. El objetivo es cultivar hueso nuevo por encima de una zona cortical, sin ningún apoyo lateral de las paredes óseas endógenas. Por lo tanto, el modelo es extremadamente estricto y evalúa el potencial real de la osteoconducción vertical sobre la parte cortical del hueso. Si el modelo descrito en el presente documento se dedica principalmente a la evaluación de la osteoconducción en sustitutos óseos, también se puede evaluar la osteogénesis y/o la osteoinducción, así como la vasculogénesis^{1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30}.

Esencialmente por razones éticas, prácticas y económicas, el modelo calvarial fue desarrollado en el conejo en el que el metabolismo óseo y la estructura son bastante relevantes en comparación con^{el humano 32.} De las 30 referencias citadas anteriormente, el 80% utilizó el conejo calvarial modelo^{1,2,3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13,14,15,17,22, 23,26,27,28,29,30,33}, demostrando así la relevancia de este modelo animal. En 2008, el grupo Busenlechner transfirió el modelo calvarial al cerdo, para permitir la comparación de ocho sustitutos óseos simultáneamente²⁰ (en comparación con dos sustitutos óseos con el conejo). Por otro lado, nuestro grupo transfirió el modelo calvarial de conejo a las ovejas. En resumen, las cúpulas de titanio se colocaron en cráneos de oveja para caracterizar la osteoconducción de un nuevo sustituto óseo impreso en 3D. Estos estudios nos permitieron desarrollar y dominar el modelo calvarial y su análisis^16,21.

Los tres últimos estudios citaron^16,20,21, junto con varias otras investigaciones^{12,17,18,19,22, 23,24,26,27,28,29}, confirmó el gran potencial del modelo calvarial como cribado y caracterización Modelo. Sin embargo, a pesar de que los resultados obtenidos fueron bastante satisfactorios, también señalaron algunas limitaciones: (1) El uso de cúpulas de titanio, que impidieron la difusión de rayos X y a su vez el uso vivo de micro-CT. Estos no pudieron ser eliminados antes del procesamiento histológico, obligando a los investigadores a incrustar las muestras en resina de poli(metilmetacrilato) (PMMA). Por lo tanto, los análisis resultantes se limitaron en gran medida a la topografía. (2) Altos costos financieros, especialmente debido al costo de los animales, y los costos relacionados con la logística, el mantenimiento y la cirugía de los animales. (3) Dificultades para obtener aprobaciones éticas para animales grandes.

26 mejoró en gran medida el modelo del conejo. Las cúpulas de titanio fueron reemplazadas por cilindros closables que podían llenarse con un volumen constante de material. Cuatro de estos cilindros fueron colocados en cráneos de conejo. Al finalizar, los cilindros podían retirarse para que las biopsias estuvieran libres de metales, introduciendo mucha más flexibilidad en cuanto al procesamiento de muestras. El modelo calvarial de conejo se volvió atractivo para pruebas simultáneas con menores costos, fácil manejo de animales y facilitación del procesamiento de muestras. Aprovechando estos desarrollos recientes, hemos mejorado aún más el modelo reemplazando el titanio por PEEK para producir cilindros, permitiendo así la difusión de rayos X y el uso de microtomografía en animales vivos.

En este artículo, describiremos los procesos de anestesia y cirugía y mostraremos ejemplos de salidas que se pueden obtener utilizando este protocolo, es decir, histología (inmuno), histomorfometría, microtomografía en vivo y ex vivo para evaluar los mecanismos del hueso regeneración y cuantificar la nueva síntesis ósea apoyada por materiales sustitutivos óseos.

Protocolo

De conformidad con los requisitos legales suizos, el protocolo fue aprobado por un comité académico y supervisado por las agencias veterinarias cantonales y federales (autorizaciones no GE/165/16 y GE/100/18).

1. Dispositivos y animales específicos

1. Cilindros
   1. Cilindros de máquina con pestañas estabilizadoras laterales de PEEK para tener un diámetro interior de 5 mm, diámetro exterior de 8 mm y una altura de 5 mm (Figura1).
   2. Tapas PEEK de la máquina con un diseño que permite sujetar con precisión en la parte superior del cilindro (espesor 1 mm).
   3. Esterilice los cilindros y tapas PEEK autoclaveantes antes de la cirugía.
2. Tornillos
   1. Utilice microtornillos autoperforantes (hechos de titanio puro comercial (grado 5)) para fijar los cilindros (1,2 mm de diámetro, 4 mm de longitud). Esterilice autoclave antes de la cirugía.
3. Animales
   1. Compra conejos blancos de Tres meses de edad de Nueva Zelanda (hombres o mujeres), con un peso de 2,5 kg cada uno.
      NOTA: Obtenemos conejos criando en la Universidad de Ginebra.

2. Cirugía

1. Bandeja quirúrgica
   1. Mantenga los bisturíes, tijeras, dos fórceps, el elevador periosteal, jeringas (1, 2, 5, 50 ml), motor quirúrgico, fresas quirúrgicas redondas (0,8 mm de diámetro), agujas, solución salina estéril, cuatro cilindros, ocho tornillos y destornillador listo.
2. Tratamiento preclínico
   1. Aclimatar a los animales una semana antes de la cirugía.
   2. Proporcionar un antibiótico profiláctico diariamente (5-10 mg/kg por vía oral (PO)) a partir de 2 h antes de la cirugía hasta 3 días después de la cirugía.
3. Anestesia e intubación
   1. Sedar a los animales mediante inyección intramuscular (IM) de ketamina (25 mg/kg, 50 mg/ml, 0,5 ml/kg) + xilazina (3 mg/kg, 20 mg/ml, 0,15 ml/kg). Espere 20 minutos para que los animales duerman
      profundamente (atonía muscular completa).
      NOTA: Esta premedicación permitirá un proceso de intubación simple, rápido e indoloro. La analgesia profunda y la anestesia se inducen como se describe en el paso 2.3.8.
   2. Coloque una cánula intravenosa (IV) en la vena marginal del oído y manténgala cerrada hasta que se complete la intubación.
      NOTA: Esta línea IV servirá para perfumar fentanilo y propofol para la analgesia profunda y la anestesia, respectivamente (ver paso 2.3.8).
   3. Mantener la anestesia suministrando 5% de sevoflurano en oxígeno puro hasta que se realice la intubación.
      NOTA: Este paso es necesario sólo si el animal muestra signos de despertar (movimientos oculares, contracciones musculares).
   4. Anestetiza la tráquea localmente pulverizando 10% lidocaína. Coloque el conejo en posición propensa y mantenga su cabeza en extensión vertical.
   5. Deslice el primer tubo endotraqueal de pequeño diámetro (2,5 mm) en la tráquea del conejo hasta que se pueda oír el flujo de aire en el tubo. Esto abrirá la laringe y facilitará la inserción del tubo definitivo.
   6. Inserte una guía (catéter de intubación) en el tubo para fijar la posición del tubo en la tráquea. Retire el tubo de diámetro pequeño y deslice el tubo endotraqueal definitivo (4,9 mm) en la guía.
   7. Retire la guía e infle el globo al final del tubo endotraqueal para sellar y bloquear el dispositivo en la tráquea. El tubo permanecerá en su lugar, pero se puede asegurar mediante el uso de un cordón atado alrededor de la frente.  Ventilar inmediatamente (7 ml/kg, frecuencia de 40/min) al animal con 3% de sevoflurano en oxígeno puro.
   8. Perfumar continuamente (vena del oído) fentanilo (0,01 mg/ml, 2-4 ml/h) para inducir analgesia, 2-4 mg/kg de (2%) propofol (20 mg/ml, 4-8 mL/h) para inducir anestesia, y 4 ml/kg/h de acetato de Ringer para mantener afecciones isovolumétricas.
   9. Coloque una sonda de temperatura rectal. También monitorear la función cardíaca, la temperatura y la saturación de oxígeno durante todo el proceso.
   10. Controlar la profundidad de la anestesia mediante el control de la respiración autónoma; si el animal muestra signos de respiración autónoma, dispensar un pequeño bolo de propofol y fentanilo.
4. Preparación del sitio
   1. Coloque el conejo sobre una almohadilla calentada (39 oC) cubierta por una almohadilla de colchón (para evitar quemaduras) en la mesa de cirugía. Afeitar el cuero cabelludo.
   2. Aplicar un gel lubricante sobre los ojos para evitar la irritación y la sequedad. Desinfectar el sitio frotando la piel con yodo povidona (10%). A continuación, cubrir el conejo con una cortina quirúrgica estéril y cortar un área de acceso para el cráneo.
   3. Desinfectar el sitio quirúrgico con yodo povidona (10%) por segunda vez. Aplicar un gel lubricante sobre los ojos para evitar la irritación y la sequedad.
   4. Prepare una mesa cubierta (cortina estéril) en la que colocar la bandeja quirúrgica completa.
5. Apertura del sitio quirúrgico
   1. Anestetiza localmente con una inyección subcutánea (SC) de lidocaína 2% (1 ml) en el cráneo.
   2. Incise a través de la piel (con un bisturí) a lo largo de la línea sagital calvarial, desde las órbitas hasta la protuberancia occipital externa (4 cm de longitud). Asegúrese de que el periosteum esté inciso.
   3. Elevar suavemente el periiosteum (con un elevador periosteal) a ambos lados de la incisión. Enjuague el sitio con solución salina estéril.
6. Colocación del cilindro
   1. Localice las suturas medianas y coronales en el cráneo (Figura2A,B). Tenga en cuenta que estas líneas anatómicas forman una cruz. Los cilindros se colocarán en cada uno de los cuadrantes definidos por la cruz, asegurando que el borde del cilindro no esté sobre la sutura (Figura2C).
   2. Coloque el primer cilindro en el cuadrante superior izquierdo (hueso frontal izquierdo) e intente colocar el dispositivo plano. Fijar en la posición con fuerte presión de la mano y atornillar un micro-tornillo, hasta que se sienta la resistencia. Asegúrese de que el cabezal del tornillo esté al ras con la superficie de la pestaña del cilindro.
   3. Repita el mismo procedimiento en la otra pestaña para fijar el cilindro firmemente en el cráneo. Asegúrese de que el cilindro esté fijado herméticamente al hueso.
   4. Repita el procedimiento en el cuarto superior derecho (hueso frontal derecho), el cuarto inferior izquierdo (hueso parietal izquierdo) y el cuarto inferior derecho (hueso parietal derecho).
7. Perforación ósea de 5 agujeros intramedulares dentro del área circunscrita por los cilindros (Figura 1)
   1. Taladre un agujero intramedular bajo riego salino (0,8 mm de diámetro, 1 mm de profundidad) con una fresa redonda en el hueso, en el centro del área circunscrita por el cilindro. Asegúrese de que aparezca sangrado.
   2. Taladre dos agujeros intramedulares más a lo largo del eje pasando a través de los dos tornillos de pestaña, en los bordes internos del cilindro. A lo largo del hacha perpendicular, taladre dos agujeros intramedulares más en los bordes internos del cilindro. Asegúrese de que aparezca sangrado.
   3. Repita la operación dentro de los otros tres cilindros.
8. Cilindros de llenado con muestras de material y tapón (Figura 3)
   1. Prepare el material sustitutivo óseo deseado de acuerdo con las instrucciones del fabricante o las especificaciones del material.
   2. Llene el primer cilindro hasta el borde con la muestra de material y cierre el cilindro ajustando la tapa. Repita el proceso en los otros 3 cilindros.
9. Cierre del sitio quirúrgico
   1. Cierre la piel por encima de los cilindros con una sutura intermitente no resorbable.
   2. Aplique un apósito pulverizable sobre la herida.

3. Tratamiento postquirúrgico

1. Detener el suministro de analgesia y anestesia (propofol y fentanilo detención de perfusión) y comprobar la recuperación de la respiración autónoma.
2. Detenga la ventilación una vez que el animal haya recuperado la respiración autónoma. Mantenga al animal bajo oxígeno puro antes de despertar completo.
3. Inyectar clorhidrato de buprenorfina SC (0,02 mg/kg, 0,03 mg/ml, 0,67 ml/kg) y repetir la inyección cada 6 h durante 3 días como analgesia postquirúrgica.
4. Transfiera al animal a su alojamiento habitual con agua y alimentación completa.
5. Retire las suturas después de unos 10 días de cicatrización de heridas.

Resultados

El modelo descrito en este documento está dedicado a la evaluación de la osteoconducción en sustitutos óseos. También se puede evaluar la osteogénesis y la osteoinducción de los sustitutos óseos (pre-)celularizados o cargados con moléculas bioactivas, así como la vasculogénesis^{1,2,3,4, 5 ,}

Discusión

El modelo descrito en este documento es simple y debe desarrollarse con bastante facilidad siempre y cuando se sigan todos los pasos y el equipo sea adecuado. Como el protocolo descrito es un método quirúrgico, todos los pasos parecen críticos y deben seguirse correctamente. Es fundamental ser entrenado para experimentos con animales, especialmente en el manejo de conejos y la anestesia. No dude en pedir ayuda anestesista y veterinaria profesional. Es fundamental insistir en el monitoreo visual diario de los animales ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drugs
Enrofloxacine Baytril 10%	Bayer		Antibiotic
Fentanyl	Bischel		For analgesia
Ketalar 50mg/ml	Pfizer		Ketamine for anesthesia
Lidohex	Bichsel		Lubricating gel for the eyes
Opsite	Smith and Nephew	66004978	Sprayable dressing
Povidone iodine 10%, Betadine	Mundipharma		anti-infective agent
Propofol 2%	Braun	3538710	For anesthesia
Rapidocain 2%	sintetica		Local anesthesia
Ringer-acetate	Fresenius Kabi		Volume compensation
Rompun 2%	Bayer		Xylazin for anesthesia
Sevoflurane 5%	Abbvie		For anesthesia
Sterile saline	Sintetica
Temgesic	Reckitt Benckiser		Buprenorphine hydrochloride, analgesia
Thiopental Inresa	Ospediala		For anesthesia
Xylocaine 10% spray	Astra Zeneca		For intubation
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Fresenius Vial pilot C	Imexmed		Infusion pump
Heated pad	Harvard Apparatus
Suction dominant 50	Medela
Suction tubing Optimus	Promedical	80342.2
Surgical motor	Schick dental	Qube	Drilling of intramedullary holes
Ventilation	Maquet Servo1
Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
Cylinders and caps	Boutyplast	Customized	composition: PEEK (poly ether ether ketone)
Manual self-retaining shaft	GlobalD	ACT1K
Mobile handle for self-retaining shaft	GlobalD	MTM
Self- drilling screws	GlobalD	VA1.2KL4	cross-drive screws composed by Titanium grade5, ISO 5832-3
Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical tray
Endotracheal tube Shiley diameter 2,5mm	Covidien	86233	For intubation
Endotracheal tube Shiley diameter 4,9mm	Covidien	107-35G	For intubation
Ethicon prolene 4-0	Ehticon	8581H	Non-resorbable suture
Forceps	Marcel Blanc	BD027R	145 mm
Intubation catheter	Cook medical		Guide for intubation
Needlle holder	Marcel Blanc	BM008R
Needles BD Microlance3	Becton Dickinson	300300/304622	26G; 18G
Periosteal	HU-Friedy	P9X
Round surgical burs	Patterson	78000	0.8 mm in diameter, Drilling of intramedullary holes
Scalpel	Swann-Morton		n°10 and n°15
Scissors	Marcel Blanc	00657	180 mm
Syringes Omnifix	Braun	4616057V	5ml, 10ml and 50ml
Venflon G22	Braun	42690985-01	Vasofix safety for the ear iv line