المناهج الكمية لدراسة الهياكل الخلوية ومورفولوجيا الأعضاء في الكنورهابدية

Summary

توضح هذه الدراسة القياسات الكمية لحجم متشابك والتعريب، ومورفولوجيا العضلات، وشكل الميتوكوندريا في C. elegans باستخدام أدوات معالجة الصور المتاحة بحرية. يسمح هذا النهج للدراسات المستقبلية في C. elegans بمقارنة كمية مدى التغيرات الهيكلية للأنسجة والأعضاء نتيجة للطفرات الوراثية.

Abstract

تحديد الآليات الخلوية الكامنة وراء المرض أمر ضروري لتطوير علاجات جديدة. وتتمثل الاستراتيجية التي كثيرا ما تستخدم لكشف هذه الآليات في إدخال طفرات في الجينات المرشحة ووصف التغيرات النوعية في مورفولوجيا الأنسجة والعضيات الخلوية. ومع ذلك، قد لا تلتقط الأوصاف النوعية اختلافات فينوتيبيك خفية، وقد تشوه الاختلافات الفينوتية عبر الأفراد في مجموعة سكانية، وكثيراً ما يتم تقييمها ذاتياً. هنا، يتم وصف النهج الكمية لدراسة مورفولوجيا الأنسجة والعضيات في الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans باستخدام المسح الضوئي بالليزر المجهرية البؤرية جنبا إلى جنب مع برامج معالجة الصور الحيوية المتاحة تجاريا. تم إجراء تحليل كمي للأنماط الظاهرية التي تؤثر على سلامة المشبك (الحجم ومستويات الفلورة المتكاملة)، وتنمية العضلات (حجم خلية العضلات وطول خيوط الميوسين)، ومورفولوجيا الميتوكوندريا (التعميم والحجم) لفهم آثار الطفرات الوراثية على هذه الهياكل الخلوية. ولا تقتصر هذه النُهج الكمية على التطبيقات الموصوفة هنا، حيث يمكن استخدامها بسهولة لتقييم شكل الأنسجة والعضيات الأخرى في الديدان الخيطية، وكذلك في الكائنات الحية النموذجية الأخرى.

Introduction

يستخدم على نحو متزايد الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans (C. elegans) كنظام نموذجي للكشف عن العمليات البيولوجية والجزيئية التي تنطوي عليها الأمراض البشرية. الديدان الخيطية الكبار لديه طول الجسم من ما يزيد قليلا على 1 ملم، ويمكنأن تنتج الحضنة كبيرة تصل إلى 300 بيضة 1. بعد الفقس، C. elegans تتطلب فقط 3-4 أيام للوصول إلى مرحلة البلوغ، ويعيش لحوالي 2 إلى 3 أسابيع². نظرا لسهولة الزراعة، C. elegans هو حاليا واحدة من النماذج الحيوانية الأكثر رواجا في الجسم الحي لإجراء فحص فعال من حيث التكلفة والسريع للمخدرات لتحديد العلاجات للأمراض البشرية. بالإضافة إلى ذلك، فإن الحفاظ على الوراثة، والنماذج السلوكية المحددة جيدا، والجسم الشفاف للفلورة أو الفحص المجهري الخفيف، وسهولة التلاعب الجيني تجعل دراسة العواقب الخلوية والجزيئية للطفرات الوراثية قابلة لتحقيقها بسهولة ^3. وC. elegans الجينوم يشارك ما يقرب من 60-80٪ علم الأنسجة مع الجينات البشرية، وحوالي 40٪ من تلك الجينات ومن المعروف أن تكون ذات صلة بالأمراض. بعض الأمراض البشرية التي تم نمذجة ودراسة في C. elegans تشمل الاضطرابات العصبية (مرض الزهايمر، مرض باركنسون، التصلب الجانبي الضموري، مرض شاركو ماري الأسنان)، الأمراض المرتبطة بالعضلات ( ضمور العضلات دوشين)، والأمراض الأيضية (فرط السكر في الدم)^2،4. في معظم الاضطرابات البشرية، تحدث التعريب الخلوي والأعضاء الناجم عن الأمراض والتغيرات المورفولوجية، والتي يمكن تقييمها بسهولة في نموذج الديدان الخيطية.

وقد استخدمت علامات الفلورسنت على نطاق واسع لتسمية الأنسجة والعضيات للتصور الديناميكي تحت المجهر. ومع ذلك، في C. elegans، اعتمدت الأساليب التقليدية التي تقيّم المخالفات المورفولوجية بسبب الطفرات الوراثية إلى حد كبير على الأوصاف البصرية. في حين أن التقييمات النوعية يمكن أن تغطي نطاقات أوسع من الأوصاف الفينوتية (مورفولوجيا متشابك، تكتل GFP، شكل بديهي محدد، سمك الألياف العضلية، وما إلى ذلك) وتوفير وجهة نظر الطيور العين من التغيرات المورفولوجية، فهي أقل ملاءمة لل مقارنة الاختلافات الصغيرة عبر مجموعات مختلفة. وعلاوة على ذلك، تستند التقييمات النوعية إلى تقييم بصري وذاتي، مما قد يؤدي إلى تقدير التشوهات المورفولوجية تقديرا ً مفرطاً أو ناقصاً. وأخيرا، يمكن أن تختلف الملاحظات النوعية أيضا اختلافا كبيرا بين الأفراد، مما يخلق صعوبات في تكرار البيانات.

وفي السنوات الأخيرة، تم وضع عدد من الخوارزميات الحسابية السهلة الاستعمال والمتاحة بسهولة التي يمكنأن تحلل الصور كميا. ومع ذلك، فإن استخدام مثل هذه البرمجيات تحليل الصور لبعض الدراسات المورفولوجية، وخاصة فيما يتعلق عضلات جدار الجسم والميتوكوندريا، في C. elegans البحوث قد تخلفت. لتحسين التحليل الهيكلي الأساسي في C. elegans, تم تجريب بعض من البرمجيات المتاحة بسهولة, تحليل الصور مفتوحة المصدر لمقارنة كمية آثار الطفرات الوراثية على الميتوكوندريا العضلات, عضلة جدار الجسم ومتشابك مورفولوجيا. هذه الإجراءات التجريبية الخطوط العريضة بالتفصيل كيف يمكن استخدام هذه البرامج (فيجي، ilastik، CellProfiler، SQUASSH) لتقييم التغيرات في حجم متشابك وتوطين البروتين متشابك، منطقة العضلات جدار الجسم وطول الألياف، وحجم الميتوكوندريا وحجم الميتوكوندريا و التعميم نتيجة للطفرات الوراثية في الديدان الخيطية.

Protocol

1- نمو وصيانة سلالات C. elegans

1. بذور نيماتود النمو المتوسط (NGM، انظر جدولالمواد) لوحات أجار مع 300 درجة مئوية من سلالة القولونية بطيئة النمو OP50 في مجلس الوزراء تدفق اللامينار.
2. اترك لوحات أجار NGM في خزانة تدفق اللامينار لتجف.
   ملاحظة: في غياب مجلس الوزراء تدفق laminar، لوحات يمكن أن تترك لتجف على مقاعد البدلاء لكنها أكثر عرضة للتلوث.
3. نقل ما لا يقل عن 20 الحيوانات إلى كل من اثنين من OP50 المصنفة NGM أجار لوحات أن يكون مخزون العمل. هناك طريقتان رئيسيتان لنقل الحيوانات.
   1. الانتقاء: ارفع الحيوانات بلطف باستخدام اختيار معقم حراري. هذه الطريقة فعالة لاختيار الحيوانات الفردية أو متعددة من لوحة أجار. وجود كشط صغير من البكتيريا في الطرف عند قطف يساعد على نقل.
      ملاحظة: يتم اختيار قطعة صغيرة من الأسلاك البلاتين حوالي 4 سم طويلة التي هي جزءا لا يتجزأ من ماصة زجاجية، مع طرف سلك بالارض لتكون 'مثل الرمح'. تعقيم الحرارة اختيار بين اختيار لمنع التلوث المتبادل.
   2. القطع: باستخدام ملعقة معقمة، وقطع مربع صغير من أجار تحتوي على الحيوانات من لوحة واحدة ونقل رأسا على عقب إلى لوحة جديدة.
      ملاحظات: هذه الطريقة مفيدة عموما لنقل أعداد كبيرة من الديدان، وإزالة التلوث من لوحات من خلال جولات متعددة من قطع أجار غير الملوثة. تجنب التلوث المتبادل عن طريق إشعال ملعقة لبضع ثوان وغمر ملعقة في الإيثانول 100٪ بين عمليات النقل. لا ينصح بالانتقال من الصفائح المتعطشة لأن المجاعة والاكتظاظ يمكن أن يؤثرا على صحة ومورفولوجيا الهياكل الخلوية ودون الخلوية.
4. الحفاظ على الديدان في درجة حرارة النمو القياسية (20 درجة مئوية). لضمان استمرار إمدادات الديدان التي تتغذى بشكل جيد، نقل الديدان إلى لوحات جديدة OP50 البذور كل 2 إلى 3 أيام.

2. العمر -- مزامنة C. elegans

1. الحفاظ على الديدان على لوحات NGM 3-4 حتى السكان مزدحمة ولكن لا تتضور جوعا.
2. غسل بلطف الديدان قبالة لوحة NGM مع حل M9. سيبقى البيض على اللوحة بما أنّ هم يلتصقون إلى ال [إ.كل] [أب50]. كرر مع أربع خطوات غسل إضافية لإزالة جميع الحيوانات فقست.
3. السماح للالديدان يفقس لمدة 40 دقيقة.
4. إضافة 1-2 مل من محلول M9 إلى لوحة ودوامة بلطف لتخفيف الديدان فقست مؤخرا.
5. جمع الحل M9 مع الديدان ولدت مؤخرا ونقل الحل مع الديدان إلى لوحة NGM جديدة.
6. السماح للحل M9 لتبخر عن طريق تعريض لوحة NGM في الهواء. القيام بذلك المتاخمة لهب مفتوح لتجنب تلوث لوحة NGM.
7. تنمو الديدان لمدة 27 ساعة في 20 درجة مئوية للسماح بالتطور في المرحلة الثالثة من اليرقات (L3). بالنسبة للالحيوانات البالغة البالغة البالغة 3 أيام، يتم اختيار الديدان في المرحلة الرابعة من اليرقات، وتزرع لمدة 3 أيام أخرى للوصول إلى مرحلة البالغين البالغة البالغة 3 أيام.

3. إعداد الشرائح للتصوير

1. إعداد 3-4٪ ث / الخامس الأوجاروز الأسهم في زجاجة آمنة الميكروويف (3-4 غرام في 100 مل من المياه النقية).
   ملاحظة: يمكن استخدام أجار بدلا من أجاروز في نفس التركيز.
2. إذابة الأجروز بعناية في فرن ميكروويف، مع الحرص على عدم الغليان، حتى يذوب كل الأجاروز (حل واضح). الحفاظ على الحل عند 70 درجة مئوية لمنع التصلب.
   ملاحظة: يمكن استخدام مخزون أغاروز عدة مرات. يُسخّن قبل الاستخدام إذا كان الأجاروز قد توطد.
3. باستخدام ماصة باستور، ضع قطرة من الأجروز المذاب على شريحة المجهر.
   ملاحظة: تجنب وجود فقاعات الهواء في قطرة من أجار وهذه تعطل سلامة وسادة.
4. اضغط على الفور أسفل قطرات أغاروز مع شريحة المجهر آخر، وتسطيح بلطف الأجاروز في لوحة بين الشرائح اثنين.
   ملاحظة: يجب إزالة أي فقاعات بقايا في هذه المرحلة. إذا لم يكن كذلك، ينبغي إجراء شرائح جديدة كما الحيوانات يمكن أن تتعثر بسهولة في فقاعات. تجنب تجاوز أجار إلى الجانب عند الضغط على الشريحة.
5. يترك الأجاروز ليجف لمدة دقيقة واحدة.
6. افصل الشرائح بعناية لتجنب تلف الأجاروز، مع ترك الوسادة الموطّرة على إحدى الشرائح.
   ملاحظة: يجب دائما ً أن تكون الشرائح مع منصات أغاروز جاهزة طازجة قبل التجربة كما يمكن أن تجف. تأكد من أن لوحة أغاروز لديها سمك ثابت. يجب أن يكون هناك أي فقاعات الهواء أو الشقوق في وسادة لأن هذا قد تتداخل مع التصوير.
7. إضافة قطرة صغيرة (5-10 درجة مئوية) من 0.05٪ هيدروكلوريد رباعي الجوانب (مخدر) إلى مركز وسادة أغاروز.
8. باستخدام اختيار معقمة الحرارة، نقل بسرعة حوالي 10 - 15 الحيوانات من لوحة الأسهم إلى قطرات مخدر قبل أن يجف الحل. تجنب نقل الكثير من البكتيريا OP50 لأن هذا يجعل الحل غائم، والتي يمكن أن تتداخل مع التصوير.
   ملاحظة: إذا كان محلول التخدير يجف أثناء الانتقاء، ببساطة ماصة قطرة ثانية من 0.05٪ هيدروكلوريد تيتراميسال على الحيوانات. الحيوانات تميل إلى وضع على الجانب الجانبي في محلول التخدير.
9. تطبيق غطاء عن طريق وضعه فقط فوق لوحة أغاروز وإسقاط بلطف عليه. وهذا سوف يمنع تشكيل فقاعات. لا تمارس الضغط على غطاء لأن هذا قد يسحق الحيوانات.
10. تسمية الشرائح مع اسم السلالة.

4. تقييم مورفولوجيا متشابك

ملاحظة: تم دراسة آثار MEC-17 الإفراط في التعبير على سلامة متشابك في الخلايا العصبية مستقبلات اللمس الجانبية الجانبية الخلفية (PLM) من خلال قياس حجم متشابك والتوطين باستخدام خط المسح الضوئي المجهري البؤري. تم تصور الخلايا العصبية للحركة الشعبية لتحرير السودان (بما في ذلك المناطق متشابك) باستخدام uIs115 (Pmec-17::tagRFP) transgene (سلالة: TU4065⁵⁾وتسمية منطقة متشابك على وجه التحديد مع jsIs37 (Pmec-7::snb-1::GFP) (سلالة: NM664) ⁶⁾ . أجريت هذه الدراسة في الحيوانات المتزامنة L3 غير المعدلة وراثيا والمعدلة وراثيا من سلالة MEC-17 خارج الكروموسوم ة التعبير المفرط BXN507 [cjnEx036 (Pmec-4::mec-17, Pmyo-2::mCherry); jsIs37; uIs115]⁷. وترد في الجدول 1قائمة كاملة بالسلالات المستخدمة في هذه الدراسة.

1. التصوير البؤري لنقاط الاشتباك العصبي لمستقبلات اللمس
   1. لتصوير المناطق متشابك، واستخدام خط المسح المجهر البؤري إلى جانب 488 نانومتر و 552 نانومتر ضخ بصريا ليزر الصمام الثنائي شبه موصل ومجهزة برنامج التقاط الصور.
   2. حدد موقع الديدان باستخدام التكبير الأدنى.
   3. عندما يتم وضع الحيوانات بنجاح، انتقل إلى التكبير 40X وتطبيق وسيطة الغمر (في هذه الدراسة: تم استخدام هدف 40X/1.10 HC PL APO CS2 متعددة غامرة مع غمر المياه).
   4. تصور منطقة متشابك من قبل مثيرة الفلوروفور مع ليزر 488 نانومتر (2٪ قوة) لفلوروفور GFP و 552 نانومتر (1٪ السلطة) لالفلوروفور tagRFP.
   5. تحديد الإطار الأمثل س وy لالتقاط منطقة متشابك بأكمله. تأكد من مراعاة حجم البكسل الأمثل عند تحديد الإطار. في هذه الدراسة، تم الحصول على حجم بكسل متسقة من 56 نانومتر.
   6. التقاط الصور باستخدام كاشف الصور الهجين وتعيين المكاسب لمنع التعرض المفرط للفلوروفور (100٪ ل488 نانومتر الإثارة و 15٪ ل552 نانومتر الإثارة).
   7. جمع الصور z-كومة لتغطية متشابك كامل، وذلك باستخدام حجم الخطوة z الأمثل اعتمادا على الهدف المحدد المستخدم. في هذه الدراسة, تم استخدام حجم الخطوة z الأمثل من 0.211 نانومتر.
      ملاحظة: تأكد من أن جميع الصور يتم التقاطها في ظل شرط صارم للسماح بالقياس الكمي والمقارنة المتكاملين للفلورة. ويمكن القيام بذلك عن طريق الحفاظ على معلمات الفحص الدقيق متطابقة عبر جميع الصور التي تم التقاطها (أي إعدادات الليزر وكاشف، وحجم البكسل، وسرعة المسح الضوئي، والحجم الأمثل لخطوة z). تعتمد الإعدادات المثلى على الهدف ويمكن حسابها باستخدام برامج المعلوماتية الحيوية التي يمكن الوصول إليها، مثل حاسبة Nyquist (https://svi.nl/NyquistCalculator). تسمية الصور بشكل منهجي، وهذا سيكون مفيدا عند استخدام برامج المعلوماتية الحيوية التي سيتم تنظيم ومعالجة الملفات على أساس اسم الملف.
2. التحديد الكمي لمنطقة متشابك
   1. لتحليل منطقة متشابك، قم بتصدير الصور كملفات TIFF. جافا القائم على برامج معالجة التصوير مثل ImageJ، يمكن استخدامها (في هذه الدراسة، تم استخدام ماكرو تحويل صورة التصوير بالرنين المغناطيسي في ImageJ).
   2. تم قياس حجم ومستويات كثافة الفلورة المتكاملة من نقاط الاشتباك العصبي من كثافة مجموع المداخن z التي تم الحصول عليها مع CellProfiler-3.1.5. قم بتحميل الصور في برنامج CellProfiler3.1.5. إذا لزم الأمر، يمكن تصفية الصور استنادًا إلى أسماء ملفات الصور.
   3. قم بإعداد الوحدة النمطية الاسم والنوع. بشكل اختياري، قم باستخراج بيانات التعريف من تسمية الصورة لتنظيم البيانات المحسوبة وفقًا لذلك.
   4. تحديد منطقة متشابك عن طريق تعريف يدوي لهذه المنطقة باستخدام tagRFP منتشر أعرب من uIs115 (Pmec-17::tagRFP) transgene. يمكن القيام بذلك عن طريق إضافة الوحدة النمطية بخصوص إلى خط أنابيب CellProfiler-3.1.5.
   5. لقياس حجم وفلورة المشبك المعرفة باليد، أضف قياس حجم الكائن وشكله ووحدة كثافة الكائن إلى خط الأنابيب.
   6. حساب كثافة الفلورة المتكاملة النسبية عن طريق إضافة الوحدة النمطية حساب الرياضيات. تقسيم وحدات الكثافة المتكاملة التي تم الحصول عليها من jsIs37 (Pmec-7::snb-1::GFP) من قبل الوحدات المتكاملة التي تم الحصول عليها لuIs115 (Pmec-17::tagRFP).
   7. قياسات التصدير والحسابات.

5. قياس هيكل العضلات جدار الجسم

1. تصوير الفلورة لهيكل عضلة جدار الجسم
   1. الحصول على سلالة (على سبيل المثال، RW1596) تحمل stEx30 transgene (Pmyo-3::gfp::myo-3 + rol-6 (su1006))⁸، الذي تسميات ألياف ميوسين مع GFP.
      ملاحظة: يمكن تحقيق إدخال الترانسجين في الحيوانات إما عن طريق عبور سلالة من الاهتمام مع الحيوانات التي تعبر بالفعل عن الترانسجين، أو حقن الحمض النووي في الذراع البعيدة للغوناد. النمط الظاهري "المتداول" الناجم عن طفرة رول-6 في هذا الترانسجين يسهل تصور العضلات. عضلات جدار الجسم تعمل على طول الجانبين الظهري والبطني التي عادة ما تمنع من عرض في الحيوانات البرية من النوع لأنها تقع عادة على واحد من الجانبين الجانبي. الرول-6 (su1006) أليل يحفز التواء الحيوانات، وبالتالي تعريض بعض خلايا العضلات للتصوير.
   2. صورة الحيوانات باستخدام مجهر الفلورة إلى جانب عالية الدقة مشحونة كاميرا الجهاز المقترنة (CCD)، 40X الهدف أو أعلى، GFP تصفية واقتناء البرمجيات.
   3. ضبط وقت التعرض وكثافة الإضاءة لمنع الصور المشبعة.
   4. التقاط وحفظ الصور من العضلات (400X التكبير) من قسم من الحيوان يحتوي على واحد على الأقل خلية العضلات المائلة مرئية كاملة. تجنب المناطق التي تحتوي على خلية عضلة واحدة غير مكتملة أو مقاطع غير موجودة خارج نطاق التركيز. كما استبعد الصور من المناطق الأمامية والخلفية المتطرفة، والمناطق المجاورة للفرج.
      ملاحظة: إذا لم يكن لدى الحيوان خلية عضلة كاملة مرئية واحدة، حرك بلطف غطاء لتحويل الحيوان وذلك لفضح خلية كاملة.
2. قياس منطقة خلايا العضلات
   1. افتح الصورة في برنامج Fiji⁹ (تم استخدام الإصدار 2.0.0 في هذه الدراسة).
   2. استخدام اختيار المضلع لتتبع بعناية حول خلية العضلات المائلة واحدة. ضبط خط المضلع في النهاية عن طريق سحب نقطة الارتساء لتحسين التتبع.
   3. انتقل إلى علامة التبويب تحليل في الجزء العلوي من البرنامج وانقر على قياس لحساب مساحة التحديد. وسيُعرض جدول نتائج منفصل يحتوي على المنطقة وقياسات أخرى. إذا كان قياس المنطقة مفقوداً من جدول النتائج، انتقل إلى تعيين قياسات ضمن علامة التبويب تحليل وتحقق من وضع علامة على مربع المنطقة. وبالمثل، قم بإلغاء تحديد القياسات الأخرى التي لا تحتاج إليها.
   4. بالنسبة لخلايا العضلات ذات المنطقة المنحلة/المفقودة، تتبع المنطقة المفقودة باستخدام أداة تحديد المضلع وانقر فوق قياس مرة أخرى. إذا كان هناك فجوات متعددة داخل الخلية، تتبع كل فجوة على حدة.
   5. حساب نسبة منطقة الفجوة إلى كامل خلية العضلات واحدة. نسبة عالية تشير إلى مدى أعلى من انحطاط العضلات بسبب الفجوات الكبيرة داخل الخلية. وإذا لم تكن هناك مناطق مفقودة، كما يُرى عادة في الحيوانات البرية، فإن النسبة ستحسب على أنها صفر.
      ملاحظة: كعنصر تحكم، درجة أيضا لعيوب هيكل العضلات بصريا ومقارنة النتائج مع القياس الكمي. وهذا مفيد بشكل خاص إذا كان يتم دراسة سلالة لأول مرة في المختبر. لتسجيل phenotypic، وتقييم الحيوانات كما معيبة أو غير معيبة على أساس سلامة خيوط. على سبيل المثال، سيتم تسجيل الحيوانات التي تعاني من فقدان خيوط تشققات متميزة، أو تكتل GFP، أو فجوات داخل خلايا العضلات بسبب الانهيار الهيكلي، على أنها معيبة.
3. تجزئة وتكميم طول ألياف الموسين
   1. إذا لزم الأمر، قم أولاً بتحويل الملفات إلى . tif باستخدام فيجي أو حزمة برامج أخرى. حفظ ملفات TIFF في الموقع المطلوب.
   2. فتح ilastik¹⁰ (البرمجيات الحرة، الإصدار 1.3.2 يمكن تحميلها من https://www.ilastik.org/).
   3. مرة واحدة في ilastik، اختر تصنيف بكسل ضمن إنشاء مشروع جديد . سيطالب البرنامج بحفظ المشروع. إعادة تسمية المشروع وحفظ إلى موقع المطلوب.
      ملاحظة: مشروع جديد يحتاج فقط إلى إنشاء مرة واحدة. يمكن إجراء التجزئة اللاحقة باستخدام نفس المشروع. لاستخدام نفس إعدادات المشروع، انتقل إلى علامة التبويب المشروع في الجزء العلوي، وانقر فوق فتح المشروع للوصول إلى ملف المشروع.
   4. يجب أن يكون هناك 5 علامات التبويب على اللوحة اليسرى (بيانات الإدخال، واختيار الميزات، والتدريب، وتصدير التنبؤ ومعالجة الدفعات). في علامة التبويب بيانات الإدخال، انقر فوق إضافة جديد ثم أضف صورة منفصلة (صور). قم بتوجيه الإطار المنبثق إلى المجلد الذي يحتوي على ملفات TIFF وحدد الصورة المراد فتحها.
   5. في علامة التبويب التالية أدناه ( تحديدالميزة)، انقر على تحديد الميزات لتحديد جميع ميزات البكسل، المشار إليها من قبل مربعات وضع علامة خضراء. يتم استخدام تحديد البكسل في هذه الخطوة لتمييز فئات البكسل المختلفة في الخطوة التالية.
      ملاحظة: تحديد ميزة بكسل يعتمد على دقة الصورة. وبالتالي، يقترح المطورون تحديد كافة أو أكبر عدد ممكن من الميزات، إذا كانت قوة المعالجة والوقت يسمحان بذلك.
   6. تسمح لوحة التدريب التالية بتصنيف فئات الكائنات المختلفة استناداً إلى وحدات البكسل. في هذه الحالة، وفئتين هي الفردية GFP التعبير عن خيوط myosin والخلفية غير المرغوب فيها أو حواف ضبابية. انقر على إضافة تسمية للحصول على التسمية الأولى. الزحف على عدد من خيوط لبدء التدريب المصنف.
      ملاحظة: النقر المزدوج فوق التسمية يسمح بتغيير الاسم (على سبيل المثال، إعادة تسمية 'التسمية 1' إلى 'خيوط'). النقر المزدوج فوق المربع الملون يسمح بتغيير ألوان العرض الرسم والاحتمال. الحجم الافتراضي لفرشاة الطلاء هو 1، على الرغم من أن الحجم يمكن زيادة إلى 61. إذا تم رسم البكسل الخطأ، ببساطة استخدم أداة الممحاة لإزالة الرسم. يمكن استخدام عناصر تحكم لوحة المفاتيح (-) و (Shift +) للتكبير والتصغير للصورة، على التوالي. يتم استخدام مفاتيح الأسهم للتنقل حول الصورة.
   7. إضافة تسمية ثانية وإعادة تسميتها إلى الخلفية. الزحف على الخلفيات والمسافات غير المرغوب فيها بين خيوط.
   8. انقر على تحديث مباشر وتأكد من أن التصنيف قد تم من قبل البرنامج بشكل صحيح. إضافة المزيد من الزحف وصقل التدريب إذا لزم الأمر.
      ملاحظة: من المهم إبقاء العين للألياف المدمجة وحواف ضبابية (مثل خط الجسم) في هذه الخطوة. تحسين التنبؤ هنا قدر الإمكان لزيادة دقة القياسات. دقة التنبؤ يعتمد أيضا على دقة الصورة، كما بكسل في الصور ذات جودة منخفضة هي أكثر صعوبة لندف بعيدا. كما أنه اختياري ولكن من المستحسن تشغيل "أسلوب التصفية" في الدالة "اقتراح ميزات" بجانب عنصر تحكم "تحديث مباشر".
   9. بمجرد إجراء تدريب مصنف بشكل كاف، انتقل إلى لوحة التنبؤ التصدير. انقر على اختيار تصدير إعدادات الصورة مع الاحتمالات كمصدر.
   10. استخدم الإعدادات التالية. قطع المنطقة دون الإقليمية x و y تكتك، و c unticked. يجب أن تكون قيم البدء والتوقف لـ c 0 و 1 على التوالي. ضع علامة على نوع البيانات في التحويلات إلى 8 بت غير موقعة، واعادة التطبيع [الحد الأدنى والحد الأقصى] واستخدم القيم الافتراضية. تغيير تنسيق فيديو ملف الإخراج إلى PNG ثم إعادة تسمية الملف والدليل كما هو مطلوب.
   11. أغلق إطار إعدادات التصدير وقم بتصدير الصورة المحددة التي تم تقسيمها للتو.
   12. افتح صورة PNG المحفوظة في برنامج Fiji. يجب أن تظهر الصورة بالأبيض والأسود.
   13. ضبط عتبة الصورة باستخدام الإعدادات الافتراضية.
   14. تطبيق البرنامج المساعد الهيكل العظمي (الهيكل العظمي 2D / 3D، ومن ثم تحليل الهيكل العظمي). سيتم عرض جدول منفصل للنتائج، والذي يتضمن طول الفرع. طول الفرع يمثل طول الألياف. ويمكن أن تكون البيانات الأخرى في النتائج مفيدة أيضا، مثل المسافة الإقليدية.
       ملاحظة: حذف الألياف مع أطوال 0 ميكرومتر أو أكثر من 250 ميكرومتر، لأن هذه الأحجام ليست ممكنة من الناحية الفسيولوجية.

6. قياس مورفولوجيا الميتوكوندريا

ملاحظة: للحصول على كمية من مورفولوجيا الميتوكوندريا، استخدمت هذه الدراسة سلالة BXN038⁷ التي تحتوي على uIs115 (Pmec-17::tagRFP)⁵ transgene لتصور الخلايا العصبية PLM وjsIs609 (Pmec-4::MLS::GFP)¹¹ لتصور الميتوكوندريا على وجه التحديد داخل الخلايا العصبية PLM. أجريت هذه الدراسة في متزامنة 3 أيام الديدان الكبار القديمة، ولكن تم تنفيذها بنجاح في أعمار أخرى، وكذلك في الأنسجة الأخرى⁷.

1. تصوير الفلوركون داخل الخلايا العصبية للحركة الشعبية لتحرير السودان
   1. لقياس حجم وشكل التغيرات في الميتوكوندريا داخل الخلايا العصبية PLM، تصور كل من الخلايا العصبية الخلفية والميتوكوندريا باستخدام الجينات الفلورية.
   2. لتصوير الخلايا العصبية PLM، استخدم مجهر ًا بؤريًا مقترنًا بـ 488 نانومتر و552 نانومتر تم ضخه ضوئيًا بالليزر الثنائي شبه موصل ومجهز ًا ببرامج التقاط الصور.
   3. صورة الدودة وفقا للخطوات 4.1.1-4.1.4 أعلاه، وضمان ظروف التعرض غير المشبعة.
   4. من أجل تصور الخلايا العصبية بأكملها، قد تكون هناك حاجة إلى صورة متجانبة. لتحقيق ذلك، استخدم برنامج مع خيار فحص البلاط لتحديد موقع وإسقاط علامة في زاوية واحدة من الخلايا العصبية ومن ثم تحديد موقع الطرف الآخر وإسقاط علامة أخرى. سيقوم البرنامج بحساب العدد الأمثل من البلاط اللازمة لالتقاط المنطقة المطلوبة.
      ملاحظة: لتقليل وقت المسح الضوئي، غالباً ما يكون من الأسهل تحديد موقع الخلايا العصبية التي تتبع مستوى واحد، مما يؤدي إلى عدد أقل من البلاط.
   5. لاقتران فحص التجانب بمكدس Z، قم بتعيين الحدود السفلية والعليا قبل بدء فحص التجانب، وتأكد من تعيين حجم الشريحة الأمثل.
   6. تأكد من تحسين الدقة، حيث سيتم تحسين التقسيم بدقة أعلى (هنا، تم استخدام دقة 3224 × 3224 بكسل).
      ملاحظة: في حين يتم استخدام uIs115 (Pmec-17::tagRFP) transgene لوضع الحركة الشعبية لتحرير السودان ووضع الكاميرا بنجاح، فإنه لا يحتاج بالضرورة إلى أن يتم تصويرها بسبب الفلورة الخلفية طفيفة لوحظ من jsIs609 (Pmec-4::MLS::GFP) [ترنسجن] ضمن ال [بلم] [أإكسون] نفسه. وهكذا، يمكن تقليل وقت المسح الضوئي والتصوير عن طريق إزالة مرشح 552 نانومتر من التجربة.
2. تجزئة الكائن باستخدام SQUASSH
   1. تحويل ملفات الصور إلى صور .tiff وتوليد التوقعات كثافة قصوى من مكدسات Z باستخدام برنامج التصوير فيجي. اقتصاص الصور إلى الحد الأدنى من الحجم في حين لا تزال تحتوي على الخلايا العصبية كاملة للحد من الحمل الحسابي والحد من الضوضاء الخلفية.
      ملاحظة: للحصول على النتائج التمثيلية، تم النظر فقط الميتوكوندريا داخل العمليات الإبطية طويلة، لذلك تم استبعاد الجسم الخلوي وأي الميتوكوندريا داخل من كل صورة.
   2. باستخدام الماكرو SQUASSH جناح الفسيفساء لImageJ، قم بإجراء تقسيم Bregman^{المقطع 12} على الإسقاطات القصوى. يتوفر دليل مفصل لتركيب وتطبيق هذا الماكرو على موقع موزاييك (http://mosaic.mpi-cbg.de/) ووصفه رزق وآخرون. ويرد أدناه وصف لعملية تجزئة الصور.
      ملاحظة: يعرّف هذا التجزئة الكائنات (في هذه الحالة mitochondrion الفردية) فوق عتبة كثافة الفلورة، مما يسمح بقياس دقيق لكل حجم وشكل الكائنات الفردية.
   3. إزالة الضوضاء الخلفية من صورة باستخدام طريقة الكرة المتداول، حيث نافذة معرفة من قبل المستخدم يتحرك عبر الصورة، وحساب تقدير كثافة الخلفية المحلية من الكثافة الأكثر تكرارا في كل نافذة. يؤدي هذا إلى تصحيح كثافة الخلفية غير المتساوية.
   4. استخدم اكتشاف الكائن للبحث تقريبًا عن مناطق الصورة التي تحتوي على كائنات (ميتوكوندريا) ذات أهمية، استنادًا إلى كثافة الفلورة وعدد وحدات البكسل. المعلمات التي تحكم هذه الخطوة هي التسوية والحد الأدنى لكثافة الكائن.
      ملاحظة: يتم استخدام التسوية لتجنب تقسيم الكثافة الصغيرة، والقمم الناجمة عن الضوضاء، وعتبة كثافة الكائن الأدنى يساعد على تحديد العضيات دون الخلوية من الفلورة الأنسجة الخلفية. هذه هي المعلمات الرئيسية التي يتم التلاعب بها للعثور على تجزئة الأمثل من الميتوكوندريا، وعملية التحسين يميل إلى أن تكون التجربة والخطأ من المعلمات المختلفة لصورة الاختبار، تليها التفتيش اليدوي.
   5. استخدم البرنامج لتقدير كثافة الخلفية المحلية حول كل كائن للمساعدة في حساب التقسيم الأمثل.
   6. قياس الكائنات الفردية لحجم، محيط، طول عن طريق عدد بكسل، فضلا عن كثافة إشارة وx / y الموقع على الصورة. لحساب القياسات في الحجم (نانومتر)، عامل في حجم بكسل الصورة الأصلية.
      ملاحظة: لكل تجربة، يجب أولاً حساب المعلمات المثلى. لضمان دقة التجزئة، من المستحسن إجراء تحليل SQUASSH على صورة اختبار وفحص دقة التجزئة يدويًا. يوفر الماكرو ملفات الإخراج التي تعرض الكائنات الفردية التي تم تعريفها على الصورة الأصلية، وفحص هذه المعلمات عن كثب وضبطها لتناسب سوف يضمن تجزئة دقيقة. ثم يجب استخدام المعلمات المحددة للتجربة بأكملها للمقارنة. وترد البارامترات المستخدمة في النتائج التمثيلية في الجدول2.
   7. افتح برنامج تحليل فيجي أو ImageJ، وانتقل إلى حاوية ماكرو الفسيفساء وافتح قائمة SQUASSH.
      1. افتح القائمة الفرعية للطرح في الخلفية وتأكد من إزالة الخلفية؟ الافتراضي لحجم الإطار هو 10.
      2. تعيين التسوية المطلوبة والحد الأدنى لكثافة الكائن، قيم القناة 1 لتعريف الكائنات ومقطعها على أفضل وجه (راجع الخطوة 6.2.4). قيم القناة 2 ليست ضرورية للكائنات التي تم وضع علامة عليها باستخدام transgene واحد.
      3. انقر فوق تقدير PSF من الخصائص الموضوعية لتقدير وظيفة انتشار النقطة استنادًا إلى خصائص المجهر. يساعد هذا على تجزئة الكائنات الموجودة بشكل وثيق عن طريق حساب تأثير كل بكسل على بكسل المجاورة.
         ملاحظة: لم يتم استخدام تجزئة Subpixel في هذه التجربة بسبب زيادة الحمل على طاقة معالجة الكمبيوتر. كما لم يتم استخدام أقنعة الخلية كما يتم تعريف محور عصبي بسهولة. هذه الإعدادات مفيدة للأنسجة أكثر تعقيداً ولتعريف الكائنات على أساس خلية.
      4. بالنسبة لخيارات المرئيات، تأكد من تحديد حدود الكائن وخصائص الكائن والصورة. للاستخدام في وقت لاحق في الرسومات والبرامج الإحصائية، تأكد من أن العدد الصحيح من الشروط هي الإدخال.
   8. حدد موقع المجلد مع صور .tiff ثم قم بتشغيل الماكرو. يمكن تنفيذ هذه العملية على صورة فردية أو على مجموعة من الصور لكل نمط جيني موجود داخل مجلد. سيتم وضع ملفات الإخراج في المجلد مع الصور الأصلية.
3. تحليل وقياسات الشكل
   1. استخدم الإخراج من SQUASSH لتوفير ملف .csv بيانات كائن مفصل، والذي يوفر كل كائن فردي لكل صف بما في ذلك قياساته كما هو موضح أعلاه.
      ملاحظة: أثناء عملية الماكرو هذه أتمتة قياسات الكائن من المهم دائماً التحقق يدوياً من صور الإخراج بعد تجزئة SQUASSH للتأكد من أن الماكرو قد تم تعريف الميتوكوندريا بشكل صحيح.
   2. لتحليل شكل كل الميتوكوندريا ، استخدم مقياسثنائي الأبعاد للفحل ، التعميم، لتقدير انحراف الكائن عن دائرة مثالية.
      ملاحظة: التعميم هو وظيفة من المنطقة ومحيط (التعميم = (4 ×) س (المنطقة / محيط 2) حيث 1 = دائرة مثالية و 0 = خط مستقيم. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام صيغة في الرسومات والبرامج الإحصائية.
   3. لتحديد التباين في الحجم والشكل عبر مجموعة من الميتوكوندريا، حساب الرسوم البيانية وتوزيع غاوسي المجهزة باستخدام الرسومات والبرامج الإحصائية، مع صناديق من 0.2 ميكرومتر لحجم الميتوكوندريا و 0.05 للدائرية الميتوكوندريا.

النتائج

C. elegans هو كائن نموذجي مثالي لدراسة مورفولوجيا الأنسجة والعضيات المختلفة بسبب بساطته، والنسب الخلية المعروفة، والشفافية، والأدوات المتاحة. هنا، نحن نقدم النهج الكمية لدراسة العضيات (على سبيل المثال، الميتوكوندريا) والأنسجة، بما في ذلك نقاط الاشتباك العصبي والعضلا?...

Discussion

وكثيرا ً ما يتم تقييم الاختلافات المورفولوجية من خلال العد اليدوي للاختلافات الملحوظة أو باستخدام عتبات تعسفية لتحديد العيوب مقارنة بالنمط الظاهري الظاهري. ولكن في الآونة الأخيرة، استخدمت أساليب كمية للدراسات المقارنة للمورفولوجيا لقياس التغيرات على مستوى الخلايا ودون الخلوية ووصفها ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar-agar	Merck	1.01614.1000
Agarose	Invitrogen	16500-500
Confocal microscope	Leica	TCS SP8	Inverted platform
Fluorescence microscope	Carl Zeiss AG	Zeiss Axio Imager M2
Glass coverslips #1	Thermo scientifique	MENCS22221GP
Glass coverslips #1.5	Zeiss	474030-9000-000	Made by SCHOTT
Glass slides	Thermo scientifique	MENS41104A/40
Light LED	Schott	KL 300 LED
Stereo Microscope	Olympus	SZ51
Tryptone (Peptone from casein)	Merck	107213	Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium
Yeast Extract	Merck	103753	Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium
Sodium chloride	Merck	106404	Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium
Peptone (Peptone from meat)	Merck	107214	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Agar	Sigma	A1296	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Sodium chloride	Merck	106404	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Cholesterol	Sigma	C8667-25G	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Calcium chloride	Merck	102382	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Magnesium sulfate	Merck	105886	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Dipotassium phosphate	Merck	105101	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Potassium dihydrogen phosphate	Merck	104873	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Disodium phosphate	Merck	106586	Ingredients for M9 buffer
Sodium chloride	Merck	106404	Ingredients for M9 buffer
Potassium dihydrogen phosphate	Merck	104873	Ingredients for M9 buffer
Magnesium sulfate	Merck	105886	Ingredients for M9 buffer
Pasteur pipette	Corning	CLS7095D5X-200EA
Petri dishes	Corning	CLS430589-500EA
Platinum wire	Sigma	267201-2G
Spatula	Met-app	2616
Tetramisole hydrochloride	Sigma	L9756-5G