АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этом исследовании излагаются количественные измерения синаптических размеров и локализации, морфологии мышц и митохондриальной формы в C. elegans с использованием свободно доступных инструментов обработки изображений. Такой подход позволяет будущим исследованиям в C. elegans количественно сравнить степень структурных изменений тканей и органелл в результате генетических мутаций.

Аннотация

Определение клеточных механизмов, лежащих в основе болезни имеет важное значение для развития новых терапевтических препаратов. Стратегия, часто используемая для распутывания этих механизмов, заключается в внедрении мутаций в генах-кандидатах и качественном описании изменений в морфологии тканей и клеточных органелл. Однако качественные описания могут не фиксировать тонкие фенотипические различия, могут искажать фенотипические вариации между отдельными лицами в популяции и часто оцениваются субъективно. Здесь описаны количественные подходы для изучения морфологии тканей и органелл в нематоде Caenorhabditis elegans с помощью лазерного сканирования конфокальной микроскопии в сочетании с коммерчески доступным программным обеспечением для обработки биоизображений. Для понимания был проведен количественный анализ фенотипов, влияющих на целостность синапсов (размер и интегрированные уровни флуоресценции), развитие мышц (размер мышечной клетки и длина нити миозинов) и митохондриальную морфологию (круговость и размер) влияние генетических мутаций на эти клеточные структуры. Эти количественные подходы не ограничиваются описанными здесь приложениями, поскольку они могут легко использоваться для количественной оценки морфологии других тканей и органелл в нематоде, а также в других типовых организмах.

Введение

Нематод Caenorhabditis elegans (C. elegans) все чаще используется в качестве модели системы для выявления биологических и молекулярных процессов, участвующих в болезни человека. Взрослый нематод имеет длину тела чуть более 1 мм, и может производить большой выводок до 300 яиц1. После вылупления, C. elegans только требуется 3-4 дней, чтобы достичь совершеннолетия, и жить около 2 до 3 недель2. Из-за своей простоты культивирования, C. elegans в настоящее время является одним из самых востребованных моделей in vivo животных для проведения экономически эффективных, экспресс-скрининга наркотиков для выявления терапевтических средств для заболеваний человека. Кроме того, его генетическая консервация, четко определенные поведенческие парадигмы, прозрачное тело для флуоресценции или световой микроскопии, а также простота генетических манипуляций делают изучение клеточных и молекулярных последствий генетических мутаций легко достижимым 3. Геном C. elegans имеет около 60-80% оротологии с человеческими генами, и около 40% из этих генов, как известно, связаны с болезнью. Некоторые из человеческих заболеваний, которые были смоделированы и изучены в C. elegans включают нейродегенеративные расстройства (болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз, Шарко-Мари-Зубная болезнь), мышечные заболевания ( Мышечная дистрофия Дюшенна и метаболические заболевания(гипергликемия) 2,4. В большинстве человеческих расстройств происходят вызванные болезнями клеточные и органеллыи и морфологические изменения, которые легко оценить в модели нематод.

Флуоресцентные маркеры широко используются для обозначения тканей и органелл для динамической визуализации под микроскопом. Однако, в C. elegans, обычные методы, которые оценивают морфологические нарушения из-за генетических мутаций в значительной степени опирались на визуальные описания. В то время как качественные оценки могут охватывать более широкие диапазоны фенотипических описаний (синаптической морфологии, GFP слипания, конкретные аксональные формы, толщина мышечного волокна и т.д.) и обеспечить вид с высоты птичьего полета морфологических изменений, они менее хорошо подходят для сравнение небольших вариаций в разных группах. Кроме того, качественные оценки основаны на визуальной, субъективной оценке, которая может привести к чрезмерной или недооценке морфологических аномалий. Наконец, качественные наблюдения могут также сильно различаться между людьми, создавая трудности с репликацией данных.

В последние годы был разработан ряд удобных для пользователя вычислительных алгоритмов, которые могут количественно анализировать изображения. Тем не менее, использование такого программного обеспечения анализа изображений для некоторых морфологических исследований, особенно в отношении мышц стенки тела и митохондрий, в C. elegans исследования отстают. Для улучшения основных структурных анализов в C. elegans, некоторые из легко доступных, с открытым исходным кодом программного обеспечения анализа изображений были опробованы количественно сравнить влияние генетических мутаций на мышечные митохондрии, мышцы стены тела и синаптической Морфология. Эти экспериментальные процедуры подробно излагают, как эти программы (Фиджи, иластик, CellProfiler, СКВАСШ) могут быть использованы для оценки изменений в синаптических размерах и локализации синаптического белка, области мышц стены тела и длины клетчатки, а также митохондриальных размера и круговой связи в результате генетических мутаций в нематоде.

протокол

1. Рост и поддержание штаммов C. elegans

  1. Семена Nematode Рост Средний (NGM, см. Таблица материалов) агар пластины с 300 зл/дл медленно растущего штамма кишечной палочки OP50 в ламинарной шкафпотока.
  2. Оставьте NGM агар пластины в ламинарной шкаф потока, чтобы высохнуть.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В отсутствие ламинарного шкафа потока, пластины могут быть оставлены, чтобы высохнуть на скамейке, но они более склонны к загрязнению.
  3. Передача по крайней мере 20 животных для каждого из двух OP50-посеянных NGM агар пластины иметь рабочие запасы. Есть два основных способа передачи животных.
    1. Выбор: Аккуратно поднимите животных с помощью теплостерилизованного выбора. Этот метод эффективен для выбора отдельных или нескольких животных из агарпластинки. Имея небольшой царапины бактерий на кончике при сборе помогает передачи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выбрать состоит из небольшой кусок платины проволоки около 4 см в длину, которая встроена в стеклянный пипетка, с кончиком провода сплющенный быть "копье-как". Тепло-стерилизовать выбор между сбором для предотвращения перекрестного загрязнения.
    2. Chunking: Использование стерилизованного шпателя, вырезать небольшой квадрат агара, содержащий животных из одной тарелки и переданы вверх дном на новую тарелку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод, как правило, полезен для передачи большого количества червей, а также для удаления загрязнения из пластин через несколько раундов chunking не загрязненных агар. Избегайте перекрестного загрязнения, пылая шпатель в течение нескольких секунд и погружая шпатель в 100% этанол между передачами. Перенос из голодающих пластин не рекомендуется, так как голод и переполненность могут повлиять на здоровье и морфологию клеточных и субклеточных структур.
  4. Поддерживайте червей при стандартной температуре роста (20 градусов по Цельсию). Для обеспечения непрерывного снабжения сытых червей, перенесите червей на новые пластины, посеянные С СЕМЕНАми OP50, каждые 2-3 дня.

2. Возрастная синхронизация C. elegans

  1. Поддерживайте червей на 3-4 пластинах NGM до тех пор, пока популяция не будет переполнена, но не голодает.
  2. Аккуратно смойте червей с пластины NGM раствором M9. Яйца останутся на тарелке, так как они прилипают к E. coli OP50. Повторите с четырьмя дополнительными шагами мыть, чтобы удалить всех вылупившихся животных.
  3. Разрешить червей люк в течение 40 минут.
  4. Добавьте 1-2 мл раствора M9 к пластине и аккуратно закружайте, чтобы ослабить недавно вылупившихся червей.
  5. Соберите раствор M9 с недавно родившимися червями и перенесите раствор с червями на свежую пластину NGM.
  6. Разрешить раствор M9 испаряться, подвергая пластину NGM воздуху. Сделайте это рядом с открытым пламенем, чтобы избежать загрязнения пластины NGM.
  7. Выращивайте червей в течение 27 ч при 20 градусах Цельсия, чтобы позволить развитие в третью стадию личинок (L3). Для синхронизированных 3-дневных взрослых животных, черви собирают на личиночной стадии 4, и выращивается в течение еще 3 дней, чтобы достичь 3-дневного старого взрослого этапа.

3. Подготовка слайдов для визуализации

  1. Приготовьте 3-4% w/v агарозного бульона в микроволновой безбезопасной бутылке (3-4 г в 100 мл ультрачистой воды).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Агар может быть использован вместо агарозы в той же концентрации.
  2. Растопить агарозу тщательно в микроволновой печи, заботясь, чтобы не перекипятить, пока вся агароза не растворится (чистый раствор). Держите раствор при 70 градусах По Цельсию, чтобы предотвратить затвердевание.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Агарозный запас можно использовать несколько раз. Разогреть перед использованием, если агароз затвердевается.
  3. Используя пипетку Pasteur, поместите каплю расплавленной агарозы на слайд микроскопа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте пузырьков воздуха в капле агара, поскольку они нарушают целостность колодки.
  4. Немедленно нажмите вниз капли агарозы с другой слайд микроскопа, мягко уплощение агароуз в площадку между двумя слайдами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Любые оставшиеся пузыри должны быть удалены на этом этапе. Если нет, новые слайды должны быть сделаны, как животные могут легко застрять в пузырьках. Избегайте переполнения агара в сторону при нажатии на слайд.
  5. Оставьте агарозу высохнуть в течение 1 мин.
  6. Тщательно разделите два слайда, чтобы избежать повреждения агарозы, оставляя затвердевную площадку на одном из слайдов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Слайды с агарозными прокладками всегда должны быть подготовлены свежими непосредственно перед экспериментом, поскольку они могут высохнуть. Убедитесь, что агароуз площадку имеет последовательную толщину. В колодке не должно быть пузырьков или трещин, так как это может помешать визуализации.
  7. Добавьте небольшое падение (5-10 л) 0,05% гидрохлорид тетрамизола (анестезии) в центр агарозной площадки.
  8. Используя теплостерилизованный подбор, быстро перенесите около 10 - 15 животных из бульонной пластины в анестетик капли, прежде чем раствор высохнет. Избегайте передачи слишком много бактерий OP50, как это делает решение облачно, что может помешать визуализации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если обезболететический раствор высыхает во время сбора, просто пипетка второе падение 0,05% тетрамизол гидрохлорид на животных. В обезвреженом растворе животные, как правило, лежат на боковой стороне.
  9. Применить coverslip, позиционируя его чуть выше агарозной площадки и осторожно снижается его вниз. Это предотвратит образование пузырьков. Не применяйте давление на покрывало, так как это может раздавить животных.
  10. Наклейте на этикетку слайды с именем деформации.

4. Оценка синаптической морфологии

ПРИМЕЧАНИЕ: Влияние MEC-17 переэкспрессии на целостность синапсов в задней боковой микротрубочки (PLM) сенсорные рецепторы нейронов были изучены путем количественной визуализации синаптических размеров и локализации с помощью линии сканирования конфокальной микроскопии. Нейроны PLM (включая синаптические области) были визуализированы с помощью transgene uIs115 (Pmec-17:tagRFP) (напряжение: TU40655)и синаптический регион был специально помечен jsIs37 (Pmec-7::snb-1:GFP) (напряжение: NM664) 6) . Данное исследование проводилось в синхронных L3 нетрансгенных и трансгенных животных экстрахромосомального штамма переэкспрессии MEC-17 BXN507 иcjnEx036 (Pmec-4::mec-17, Pmyo-2::mCherry); jsIs37; uIs115. Полный список штаммов, используемых в данном исследовании, включен в таблицу 1.

  1. Конфокальная визуализация синапсов нейронов сенсорных рецепторов
    1. Для изображения синаптических областей используйте линейный сканирующий конфокальный микроскоп в сочетании с 488 нм и 552 нм оптически накачкой полупроводникового диодного лазера и оснащенного программным обеспечением для захвата изображений.
    2. Найдите червей, используя самое низкое увеличение.
    3. Когда животные успешно расположены, переключитесь на 40X увеличение и применить погружение среды (в этом исследовании: 40X/1.10 HC PL APO CS2 мульти-погружения цель с погружением воды был использован).
    4. Визуализируйте синаптический регион, возбуждая фторофоры с 488 нм лазером (2% мощности) для фторофора GFP и 552 нм (1% мощности) для фторофора tagRFP.
    5. Определите оптимальный х и у кадр для захвата всей синаптической области. Убедитесь в том, чтобы учитывать оптимальный размер пикселей при выборе кадра. В этом исследовании был получен последовательный размер пикселей 56 нм.
    6. Захват изображений с помощью гибридного фото-детектора и установить выгоды для предотвращения передержки фторофоров (100% для 488 нм возбуждение и 15% для 552 нм возбуждения).
    7. Соберите изображения z-stack, чтобы охватить весь синапс, используя оптимальный размер z-шага в зависимости от конкретной используемой цели. В этом исследовании был использован оптимальный размер z-шаг 0,211 нм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что все изображения принимаются в строгом состоянии, чтобы позволить интегрированной флуоресценции количественной оценки и сравнения. Это можно сделать, сохраняя параметры микроскопии идентичными на всех захваченных изображениях (нат., наиболее, лазерных и детекторных настроек, размера пикселей, скорости сканирования и оптимального размера z-шага). Оптимальные настройки зависят от цели и могут быть рассчитаны с помощью доступных программ биоинформатики, таких как калькулятор Nyquist (https://svi.nl/NyquistCalculator). Этикетка изображения систематически, это будет полезно при использовании биоинформатики программного обеспечения, которое будет организовывать и обрабатывать файлы на основе имени файла.
  2. Количественная оценка синапического региона
    1. Чтобы проанализировать синаптический регион, экспортируйте изображения в файлы TIFF. Программное обеспечение для обработки изображений на основе Java, такое как ImageJ, может быть использовано (в данном исследовании использовался макрос преобразования мрт-изображений в ImageJ).
    2. Размер и интегрированные уровни интенсивности флуоресценции синапсов измерялись по интенсивности сумм полученных z-стеков с помощью CellProfiler-3.1.5. Загрузите изображения в программное обеспечение CellProfiler3.1.5. При необходимости изображения могут быть отфильтрованы на основе имен файлов изображений.
    3. Настройка модуля «Имя и тип». Дополнительно извлеките метаданные из метки изображений, чтобы организовать расчетные данные соответствующим образом.
    4. Определите синаптическую область вручную определение этого региона с помощью диффузного tagRFP, выраженного из трансгена uIs115 (Pmec-17::tagRFP). Это можно сделать, добавив относительно модуль в конвейер CellProfiler-3.1.5.
    5. Чтобы измерить размер и флуоресценцию определяемого синапса руки, добавьте в конвейер размер объекта и форму измерения и измеряйте интенсивность объекта.
    6. Рассчитайте относительную интенсивность интегрированной флуоресценции, добавив модуль Calculate Math. Разделите интегрированные единицы интенсивности, полученные от jsIs37 (Pmec-7::snb-1::GFP) интегрированными единицами, полученными для uIs115 (Pmec-17:tagRFP).
    7. Измерения экспорта и расчеты.

5. Количественная структура мышц стенки тела

  1. Флуоресценция изображения структуры мышц стенки тела
    1. Получить штамм (например, RW1596), перевозящих трансгена stEx30 (Pmyo-3::gfp::myo-3 и rol-6 (su1006))8, который этикетки миозин волокон с GFP.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Введение трансгена в животных может быть достигнуто либо пересечения штамм ажиотажа с животными, которые уже выражают трансгена, или микроинъекционных ДНК в дистальную руку гонад. «Катящийся» фенотип, индуцированный мутацией rol-6 в этом трансгене, облегчает визуализацию мышц. Мышцы стенки тела проходят вдоль пресных и брюшных сторон, которые обычно исключаются из поля зрения у диких животных, потому что они обычно лежат на одной из боковых сторон. Rol-6 (su1006) аллель индуцирует скручивание животных, тем самым подвергая некоторые клетки мышц для визуализации.
    2. Изображение животных с помощью флуоресцентного микроскопа в сочетании с высоким разрешением заряженной камерой устройства (CCD), 40X цель или выше, GFP фильтр и приобретение программного обеспечения.
    3. Отрегулируйте время экспозиции и интенсивность освещения, чтобы предотвратить перенасыщенные изображения.
    4. Захват и сохранение изображений мышц (400X увеличение) из раздела животного, содержащего по крайней мере один полный видимых косой мышечной клетки. Избегайте регионов с одной мышечной клетки, которая является неполной или разделы, которые находятся вне фокуса. Также исключить изображения из экстремальных передних и задних областей, а также регионов, прилегающих к вульве.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если животное не имеет ни одной видимой полной мышечной клетки, осторожно сдвиньте крышку, чтобы превратить животное, чтобы разоблачить полную клетку.
  2. Измерение области мышечных клеток
    1. Откройте изображение в программном обеспечении Фиджи9 (версия 2.0.0 была использована в данном исследовании).
    2. Используйте выбор полигона, чтобы тщательно проследить вокруг одной косой мышечной клетки. Отрегулируйте линию полигона в конце, перетащив якорную точку, чтобы улучшить трассировку.
    3. Перейдите к вкладке «Анализ» в верхней части программного обеспечения и нажмите «Мера», чтобы рассчитать область выделения. Будет показана отдельная таблица результатов, содержащая область и другие измерения. Если измерение области отсутствует в таблице результатов, перейдите в Set Measurements под вкладкой «Анализ» и проверьте, что поле области галочкой. Аналогичным образом, отодвить другие измерения, которые не нужны.
    4. Для мышечных клеток с вырожденным/пропавшим регионом проследите недостающую область с помощью инструмента выбора полигона и нажмите «Мера» снова. Если в ячейке имеется несколько пробелов, проследите каждый пробел по отдельности.
    5. Рассчитайте отношение площади разрыва ко всей одной мышечной клетке. Высокое соотношение указывает на более высокую степень дегенерации мышц из-за больших зазоров внутри клетки. Если отсутствующих регионов нет, как это обычно встречается у диких животных, это соотношение будет рассчитано как ноль.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как контроль, оценка также для дефектов мышечной структуры визуально и сравнить результаты с количественным измерением. Это особенно полезно, если штамм изучается в первый раз в лаборатории. Для фенотипического скоринга оцените животных как дефектных или недефектных на основе целостности нитей. Например, животные с потерей различных нитей striations, GFP слипания, или пробелы в мышечных клетках из-за структурного распада, будут засчитаны как дефектные.
  3. Сегментация и количественная оценка длины миозина
    1. При необходимости сначала преобразуйте файлы в . tif с использованием Фиджи или другого пакета программного обеспечения. Сохранить файлы TIFF в нужном месте.
    2. Open ilastik10 (бесплатное программное обеспечение, версия 1.3.2 можно скачать с https://www.ilastik.org/).
    3. Оказавшись в ilastik, выберите пиксельклассификации под создание нового проекта. Программное обеспечение подскажет для проекта, который будет сохранен. Переименуй проект и сэкономьте в нужном месте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Новый проект должен быть создан только один раз. Последующая сегментация может быть выполнена с помощью одного и того же проекта. Чтобы использовать те же настройки проекта, перейдите на вкладку Project в верхней части и нажмите на Open Project, чтобы получить доступ к файлу проекта.
    4. На левой панели должно быть 5 вкладок (входные данные, выбор функций, обучение, экспорт прогнозирования и обработка пакетов). Во вкладке Вводданные данные нажмите на Добавить новое, а затем добавьте отдельное изображение (ы). Направьте всплывающее окно в папку, содержащую файлы TIFF, и выберите для открытия изображение.
    5. В следующей вкладке ниже (Выборфункций ), нажмите на Выберите особенности, чтобы выбрать все объекты пикселей, указанные зелеными галочкой коробки. Выбор пикселей на этом этапе используется для различения различных классов пикселей на следующем этапе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор функции Pixel зависит от разрешения изображения. Поэтому разработчики предлагают выбрать все или как можно больше функций, если позволяют вычислительная мощность и время.
    6. Следующая панель обучения позволяет классифицировать различные классы объектов на основе пикселей. В этом случае эти два класса представляют индивидуальные GFP-выражения миозиновых нитей и нежелательные фоны или размытые края. Нажмите на добавленную этикетку, чтобы иметь первую метку. Наполните ряд нитей, чтобы начать обучение классификатора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Двойное нажатие на этикетку позволяет изменить имя (например, переименование 'ярлык 1' в 'filament'). Двойное нажатие цветной коробки позволяет изменять цвета для рисования и вероятностные дисплеи. По умолчанию размер кисти составляет 1, хотя размер может быть увеличен до 61. Если неправильный пиксель был нарисован, просто используйте инструмент ластика для удаления чертежа. Элементы управления клавиатурой (--) и (Shift) могут использоваться для увеличения и из изображения, соответственно. Клавиши стрелки используются для навигации по изображению.
    7. Добавьте вторую метку и переназначьте ее в background. Наполните нежелательные фоны и пробелы между нитями.
    8. Нажмите на Live Update и убедитесь, что классификация была сделана программное обеспечение правильно. Добавить больше каракули и тонкой настройки подготовки, если это необходимо.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно следить за слитые волокна и размытые края (например, линия тела) в этом шаге. Улучшить прогноз здесь как можно больше, чтобы увеличить точность измерений. Точность прогнозирования также зависит от разрешения изображения, так как пиксели в изображениях низкого качества труднее дразнить друг от друга. Кроме того, рекомендуется запускать метод фильтра в функции Предложения функции рядом с управлением Live Update.
    9. После того, как классификатор обучения был надлежащим образом выполнен, перейдите на панель прогнозного экспорта. Нажмите на выберите настройки экспортных изображений с вероятностью в качестве источника.
    10. Используйте следующие настройки. Вырез субрегиона х и у галочкой, и c unticked. Значения старта и стопа для c должны сосучиться 0 и 1 соответственно. Тик и преобразуйте тип данных в Преобразованиях в неподписанные 8-битные, тик ренормализируют «мин, макс» и используйте значения по умолчанию. Измените формат видео вывода файла на PNG и переименуйте файл и каталог по желанию.
    11. Закройте окно параметров экспорта и экспортируйте только что сегментированное изображение.
    12. Откройте сохраненное изображение PNG в программном обеспечении Фиджи. Изображение должно отображаться в черно-белом цвете.
    13. Отрегулируйте порог изображения с помощью настроек по умолчанию.
    14. Нанесите плагин скелетизации (Skeletonize 2D/3D, а затем проанализируйте скелет). Будет отображаться отдельная таблица результатов, которая включает длину ветви. Длина ветви представляет длину волокна. Другие данные, состоячие в результатах, также могут быть полезными, например, евклидовская дистанция.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Омит волокон с длиной 0 мкм или более 250 мкм, так как эти размеры не физиологически возможно.

6. Количественная митохондриальная морфология

ПРИМЕЧАНИЕ: Для количественной оценки митохондриальной морфологии, это исследование использовало штамм BXN038 7, содержащий uIs115 (Pmec-17:tagRFP)5 трансгенов для визуализации нейронов PLM и jsIs609 (Pmec-4:MLS::GFP)11 визуализировать митохондрии специально в PLM нейронов. Это исследование проводилось в синхронизированных 3-дневных взрослых червей, но успешно проводилось в других возрастных группах, а также в других тканях7.

  1. Флуоресценция митохондрий в PLM нейронов
    1. Для измерения размера и формы изменений митохондрий в plM нейронов, визуализировать как фон нейронов и митохондрий с помощью флуоресцентных трансгенов.
    2. Для изображения plM нейрона, использовать конфокальный микроскоп в сочетании с 488 нм и 552 нм оптически накачкой полупроводниковый диодный лазер и оснащен ы захвата программного обеспечения.
    3. Изображение червя в виде шагов 4.1.1-4.1.4 выше, обеспечивая условия ненасыщения воздействия.
    4. Для того, чтобы визуализировать весь нейрон, черепиченое изображение может быть необходимо. Для достижения этой цели, использовать программное обеспечение с плиткой сканирования вариант, чтобы найти и падение маркера в одном углу нейрона, а затем найти противоположный конец и падение другого маркера. Программное обеспечение будет вычислять оптимальное количество плиток, необходимых для захвата требуемой области.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы уменьшить время сканирования, часто легче найти нейроны, которые следуют за одной плоской планки, в результате чего меньше плитки.
    5. Чтобы свести сканирование плитки с стеком, установите нижние и верхние пределы перед началом сканирования плитки и убедитесь, что оптимальный размер среза установлен.
    6. Убедитесь, что разрешение оптимизировано, так как сегментация будет более изысканной с более высоким разрешением (здесь использовалось разрешение 3224 х 3224 пикселей).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как uIs115 (Pmec-17::tagRFP) трансген используется для обозначения PLM и успешного размещения камеры, это не обязательно должно быть изображено из-за небольшой фоновой флуоресценции наблюдается из jsIs609 (Pmec-4:MLS::GFP) трансген в пределах самого аксона PLM. Таким образом, время сканирования и визуализации может быть уменьшено путем удаления фильтра 552 нм из эксперимента.
  2. Сегментация объектов с использованием СКВАС
    1. Преобразуйте файлы изображений в изображения .tiff и генерируют проекции максимальной интенсивности с помощью программного обеспечения для визуализации Фиджи. Урожай изображения до минимального размера, сохраняя при этом полный нейрон, чтобы уменьшить вычислительную нагрузку и уменьшить фоновый шум.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для репрезентативных результатов, только митохондрии в течение длительных аксональных процессов были рассмотрены, так что тело клетки и любые митохондрии внутри были исключены из каждого изображения.
    2. Используя макрос Mosaic Suite для ImageJ, выполните сегментацию Сплит Брегмана12 на максимальных проекциях. Подробное руководство по установке и применению этого макроса доступно на веб-сайте Mosaic (http://mosaic.mpi-cbg.de/) и описано Rizk et al. 201413. Процесс сегментации изображений описан в кратком виде ниже.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта сегментация определяет объекты (в данном случае отдельные митохондрии) над порогом интенсивности флуоресценции, что позволяет точно измерить размер и форму каждого отдельного объекта.
    3. Удалите фоновый шум с изображения с помощью метода подвижного шара, в котором пользователь, определяемый окно, перемещается по изображению, вовливая локальную оценку интенсивности фона из наиболее часто встречающейся интенсивности в каждом окне. Это исправляет неравномерную фоновую интенсивность.
    4. Используйте обнаружение объектов, чтобы примерно найти области изображения, которые содержат объекты (митохондрии) интерес, на основе интенсивности флуоресценции и количества пикселей. Параметры, которые регулируют этот шаг, являются упорядочением и минимальной интенсивностью объекта.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Регуляризация используется для предотвращения сегментирования небольшой интенсивности, шумоизоляции пиков, и минимальный порог интенсивности объекта помогает определить субклеточные органеллы от флуоресценции фоновой ткани. Это основные два параметра, которыми манипулируют, чтобы найти оптимальную сегментацию митохондрий, и процесс оптимизации, как правило, является пробным методом и ошибкой различных параметров для тестового изображения, за которым следует ручная проверка.
    5. Используйте программное обеспечение для оценки локальной фоновой интенсивности вокруг каждого объекта, чтобы помочь вычислению оптимальной сегментации.
    6. Измерьте отдельные объекты по размеру, периметру, длине через число пикселей, а также интенсивности сигнала и расположению x/y на изображении. Для расчета измерений по размеру (нм), фактор размера пикселей исходного изображения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого эксперимента сначала необходимо вычислить оптимальные параметры. Для обеспечения точности сегментации рекомендуется провести анализ СКВАСНа на тестовом изображении и вручную проверить точность сегментации. Макро предоставляет выходные файлы, показывающие отдельные объекты, которые были идентифицированы на исходном изображении, и проверка этих близких и корректировка параметров в соответствии с ними обеспечит точную сегментацию. Затем определенные параметры должны использоваться для всего эксперимента для сопоставимости. Параметры, используемые для репрезентативных результатов, включены в таблицу 2.
    7. Откройте программное обеспечение для анализа Фиджи или ImageJ, перейдите к макроконтейнеру Mosaic и откройте меню СЗУАСШ.
      1. Откройте подмену фонового вычитания и убедитесь, что удалить фон? проверяется. По умолчанию для размера окна 10.
      2. Установите желаемую интенсивность регуляризации и минимальной интенсивности объектов, значение канала 1 для оптимальной идентификации и сегментирования объектов (см. шаг 6.2.4). Значения канала 2 не являются необходимыми для объектов, отмеченных одним трансгеном.
      3. Нажмите на оценку PSF из объективных свойств, чтобы оценить функцию спреда точек на основе характеристик микроскопа. Это помогает сегментации близко расположенных объектов, учитывая влияние каждого пикселя на соседний пиксель.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Сегментация субпикселей не использовалась в этом эксперименте из-за повышенной нагрузки на вычислительную мощность компьютера. Сотовые маски также не использовались, так как аксон легко определить. Эти настройки полезны для более сложных тканей и для определения объектов на клеточной основе.
      4. Для вариантов визуализации убедитесь, что контуры объектов и сохранение объектов и характеристик изображения проверяются. Для последующего использования в графике и статистическом программном обеспечении, убедитесь, что правильное количество условий входных данных.
    8. Найдите папку с изображениями .tiff и запустите макрос. Этот процесс может быть выполнен на отдельном изображении или на пакете изображений на генотип, расположенный в папке. Выходные файлы будут расположены в папке вместе с исходными изображениями.
  3. Анализ и измерение формы
    1. Используйте выход из S-SSSH, чтобы предоставить подробный файл данных объекта .csv, который предоставляет каждый отдельный объект в строке, включая его измерения, как описано выше.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как этот макропроцесс автоматизирует измерения объектов, всегда важно вручную проверять выходные изображения после сегментации СКВАСШ, чтобы убедиться, что макрос правильно определил митохондрии.
    2. Для анализа формы каждой митохондрии, используйте двумерную меру для сферичности, Круговой,чтобы оценить отклонение объекта от идеального круга.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Круговая линия является функцией области и периметра (Круговая зона(4 х) х (Площадь/Периметр 2), где 1 - идеальный круг и 0 - прямая линия. Это может быть достигнуто с помощью формулы в графике и статистическом программном обеспечении.
    3. Чтобы определить разницу в размерах и форме по всему пулу митохондрий, вычислите гистограммы и установленное гауссианское распределение с помощью графики и статистического программного обеспечения, с бункерами 0,2 мкм для митохондриального размера и 0,05 для митохондриальной круговой.

Результаты

C. elegans является идеальным модельным организмом для изучения морфологии различных тканей и органелл из-за своей простоты, известной клеточной линии, прозрачности и доступных инструментов. Здесь мы предоставляем количественные подходы к изучению органелл (наприм?...

Обсуждение

Морфологические вариации часто оценивались с помощью ручного подсчета заметных различий или использования произвольных пороговых значений для определения дефектов по сравнению с фенотипом дикого типа. Однако в последнее время для сравнительных исследований морфологии используютс?...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Благодарности

Мы благодарим сотрудников лаборатории Ноймана за ценные дискуссии и вклад. Некоторые штаммы были предоставлены CGC, которая финансируется NIH Управление научно-исследовательских инфраструктурных программ (P40 OD010440). Авторы благодарят WormBase за ее богатое количество информации о C. elegans, и признать Монаш Micro Imaging, Монаш университета, для предоставления приборов, обучение и техническую поддержку. Эта работа была поддержана cmTAA научно-исследовательских грантов (2015 и 2018), и NHMRC проект Гранты 1101974 и 1099690 присуждается B.N.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Agar-agarMerck1.01614.1000
AgaroseInvitrogen16500-500
Confocal microscopeLeicaTCS SP8Inverted platform
Fluorescence microscopeCarl Zeiss AGZeiss Axio Imager M2
Glass coverslips #1Thermo scientifiqueMENCS22221GP
Glass coverslips #1.5Zeiss474030-9000-000Made by SCHOTT
Glass slidesThermo scientifiqueMENS41104A/40
Light LEDSchottKL 300 LED
Stereo MicroscopeOlympusSZ51
Tryptone (Peptone from casein)Merck107213Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium
Yeast ExtractMerck103753Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium
Sodium chlorideMerck106404Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium
Peptone (Peptone from meat)Merck107214Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
AgarSigmaA1296Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Sodium chlorideMerck106404Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
CholesterolSigmaC8667-25GIngredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Calcium chlorideMerck102382Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Magnesium sulfateMerck105886Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Dipotassium phosphateMerck105101Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Potassium dihydrogen phosphateMerck104873Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Disodium phosphateMerck106586Ingredients for M9 buffer
Sodium chlorideMerck106404Ingredients for M9 buffer
Potassium dihydrogen phosphateMerck104873Ingredients for M9 buffer
Magnesium sulfateMerck105886Ingredients for M9 buffer
Pasteur pipetteCorningCLS7095D5X-200EA
Petri dishesCorningCLS430589-500EA
Platinum wireSigma267201-2G
SpatulaMet-app2616
Tetramisole hydrochlorideSigmaL9756-5G

Ссылки

  1. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. , (1974).
  2. Markaki, M., Tavernarakis, N. Modeling human diseases in Caenorhabditis elegans. Biotechnology Journal. 5 (12), 1261-1276 (2010).
  3. Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise. BMC Biology. , (2017).
  4. Alexander, A. G., Marfil, V., Li, C. Use of C. elegans as a model to study Alzheimer's disease and other neurodegenerative diseases. Frontiers in Genetics. , (2014).
  5. Zheng, C., Jin, F. Q., Chalfie, M. Hox Proteins Act as Transcriptional Guarantors to Ensure Terminal Differentiation. Cell Reports. 13 (7), 1343-1352 (2015).
  6. Koushika, S. P., et al. Mutations in Caenorhabditis elegans cytoplasmic dynein components reveal specificity of neuronal retrograde cargo. Journal of Neuroscience. 24 (16), 3907-3916 (2004).
  7. Byrne, J. J., et al. Disruption of mitochondrial dynamics affects behaviour and lifespan in Caenorhabditis elegans. Cellular and Molecular Life Sciences. , (2019).
  8. Campagnola, P. J., et al. Three-Dimensional High-Resolution Second-Harmonic Generation Imaging of Endogenous Structural Proteins in Biological Tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
  9. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  10. Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , (2011).
  11. Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, Drosophila and zebrafish. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
  12. Paul, G., Cardinale, J., Sbalzarini, I. F. Coupling image restoration and segmentation: A generalized linear model/bregman perspective. International Journal of Computer Vision. , (2013).
  13. Rizk, A., et al. Segmentation and quantification of subcellular structures in fluorescence microscopy images using Squassh. Nature Protocols. 9, 586-586 (2014).
  14. Akella, J. S., et al. MEC-17 is an alpha-tubulin acetyltransferase. Nature. 467 (7312), 218-222 (2010).
  15. Neumann, B., Hilliard, M. A. Loss of MEC-17 leads to microtubule instability and axonal degeneration. Cell Reports. 6 (1), 93-103 (2014).
  16. Shida, T., Cueva, J. G., Xu, Z., Goodman, M. B., Nachury, M. V. The major alpha-tubulin K40 acetyltransferase alphaTAT1 promotes rapid ciliogenesis and efficient mechanosensation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21517-21522 (2010).
  17. Teoh, J. -. S., Wang, W., Chandhok, G., Pocock, R., Neumann, B. Development and maintenance of synaptic structure is mediated by the alpha-tubulin acetyltransferase MEC-17/αTAT1. bioRxiv. 84, 522904-522904 (2019).
  18. Bird, T. D. . Charcot-Marie-Tooth Neuropathy Type 2. , (1998).
  19. Chandhok, G., Lazarou, M., Structure Neumann, B. Structure, function, and regulation of mitofusin-2 in health and disease. Biological Reviews. 93 (2), 933-949 (2018).
  20. Soh, M. S., Cheng, X., Liu, J., Neumann, B. Disruption of genes associated with Charcot-Marie-Tooth type 2 lead to common behavioural, cellular and molecular defects in Caenorhabditis elegans. bioRxiv. , 605584 (2019).
  21. Kamerkar, S. C., Kraus, F., Sharpe, A. J., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. Dynamin-related protein 1 has membrane constricting and severing abilities sufficient for mitochondrial and peroxisomal fission. Nature Communications. , (2018).
  22. Zhu, P. -. P., et al. Intra- and Intermolecular Domain Interactions of the C-terminal GTPase Effector Domain of the Multimeric Dynamin-like GTPase Drp1. Journal of Biological Chemistry. 279 (34), 35967-35974 (2004).
  23. Osellame, L. D., et al. Cooperative and independent roles of the Drp1 adaptors Mff, MiD49 and MiD51 in mitochondrial fission. Journal of Cell Science. , (2016).
  24. Dima, A. A., et al. Comparison of segmentation algorithms for fluorescence microscopy images of cells. Cytometry Part A. 79 (7), 545-559 (2011).
  25. Trevisan, T., et al. Manipulation of Mitochondria Dynamics Reveals Separate Roles for Form and Function in Mitochondria Distribution. Cell Reports. , (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

149Caenorhabditis elegans

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены