Approcci quantitativi per studiare le strutture cellulari e la morfologia delle orgine in Caenorhabditis elegans

Riepilogo

Questo studio descrive le misurazioni quantitative delle dimensioni sinaptiche e della localizzazione, della morfologia muscolare e della forma mitocondriale in C. elegans utilizzando strumenti di elaborazione delle immagini liberamente disponibili. Questo approccio consente a studi futuri in C. elegans di confrontare quantitativamente l'estensione dei cambiamenti strutturali dei tessuti e degli organelli a seguito di mutazioni genetiche.

Abstract

La definizione dei meccanismi cellulari alla base della malattia è essenziale per lo sviluppo di nuove terapie. Una strategia frequentemente utilizzata per svelare questi meccanismi consiste nell'introdurre mutazioni nei geni candidati e descrivere qualitativamente i cambiamenti nella morfologia dei tessuti e degli organelli cellulari. Tuttavia, le descrizioni qualitative potrebbero non cogliere le sottili differenze fenotipiche, potrebbero travisare le variazioni fenotipiche tra gli individui in una popolazione e sono spesso valutate soggettivamente. Qui, gli approcci quantitativi sono descritti per studiare la morfologia dei tessuti e degli organelli nel nematode Caenorhabditis elegans utilizzando la microscopia confocale a scansione laser combinata con un software di elaborazione bio-immagine disponibile in commercio. È stata eseguita un'analisi quantitativa dei fenotipi che influenzano l'integrità delle sinapsi (livelli di dimensioni e fluorescenza integrata), lo sviluppo muscolare (dimensioni delle cellule muscolari e la lunghezza del filamento della miosina) e la morfologia mitocondriale (circolarità e dimensione) per comprendere gli effetti delle mutazioni genetiche su queste strutture cellulari. Questi approcci quantitativi non si limitano alle applicazioni qui descritte, in quanto potrebbero essere facilmente utilizzati per valutare quantitativamente la morfologia di altri tessuti e organelli nel nematode, così come in altri organismi modello.

Introduzione

Il nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) è sempre più utilizzato come sistema modello per scoprire i processi biologici e molecolari coinvolti nella malattia umana. Un nematode adulto ha una lunghezza del corpo di poco superiore a 1 mm e può produrre una grande covata fino a 300 uova¹. Dopo la schiusa, C. elegans richiedono solo 3-4 giorni per raggiungere l'età adulta, e vivere per circa 2 o 3 settimane². Grazie alla sua facilità di coltura, C. elegans è attualmente uno dei modelli animali in vivo più ricercati per condurre uno screening rapido e conveniente dei farmaci per identificare le terapie per le malattie umane. Inoltre, la sua conservazione genetica, paradigmi comportamentali ben definiti, corpo trasparente per la fluorescenza o microscopia luminosa, e la facilità di manipolazione genetica rendono lo studio delle conseguenze cellulari e molecolari delle mutazioni genetiche facilmente raggiungibili ³. Il genoma di C. elegans condivide circa il 60-80% dell'ortologica con i geni umani, e circa il 40% di questi geni sono noti per essere correlati alla malattia. Alcune delle malattie umane che sono state modellate e studiate in C. elegans includono disturbi neurodegenerativi (malattia di Alzheimer, morbo di Parkinson, sclerosi laterale amiotrofica, malattia di Charcot-Marie-Tooth), malattie associate ai muscoli ( Distrofia muscolare di Duchenne) e malattie metaboliche (iperglicemia)^2,4. Nella maggior parte dei disturbi umani, si verificano la localizzazione cellulare e di organello indotta dalla malattia e cambiamenti morfologici, che possono essere facilmente valutati nel modello nematode.

I marcatori fluorescenti sono stati ampiamente utilizzati per etichettare tessuti e organelli per la visualizzazione dinamica al microscopio. Tuttavia, in C. elegans, i metodi convenzionali che valutano le irregolarità morfologiche dovute a mutazioni genetiche si sono in gran parte affidati a descrizioni visive. Mentre le valutazioni qualitative possono coprire più ampie gamme di descrizioni fenotipiche (morfologia sinaptica, gAPPamento GFP, forma assonale specifica, spessore della fibra muscolare, ecc.) e forniscono una visione a ciglio dell'uccello dei cambiamenti morfologici, sono meno adatti per confrontando piccole variazioni tra gruppi diversi. Inoltre, le valutazioni qualitative si basano su valutazioni visive soggettive, che possono portare a sovra o sottosoprastime di anomalie morfologiche. Infine, le osservazioni qualitative possono anche variare notevolmente da individuo a individuo, creando difficoltà con la replica dei dati.

Negli ultimi anni, sono stati sviluppati una serie di algoritmi computazionali facili da usare e facilmente reperibili che possono analizzare quantitativamente le immagini. Tuttavia, l'utilizzo di tale software di analisi delle immagini per alcuni studi morfologici, soprattutto in relazione ai muscoli della parete del corpo e ai mitocondri, nella ricerca di C. elegans è rimasto indietro. Per migliorare l'analisi strutturale sottostante in C. elegans, alcuni dei software di analisi delle immagini open source prontamente disponibili sono stati sperimentati per confrontare quantitativamente gli effetti delle mutazioni genetiche sui mitocondri muscolari, sul muscolo della parete del corpo e sulla sinaptica morfologia. Queste procedure sperimentali delineano in dettaglio come questi programmi (Fiji, ilastik, CellProfiler, SQUASSH) possono essere utilizzati per valutare i cambiamenti nella dimensione sinaptica e nella localizzazione delle proteine sinaptiche, dell'area muscolare della parete del corpo e della lunghezza della fibra e delle dimensioni mitocondriali e circolarità a seguito di mutazioni genetiche nel nematode.

Protocollo

1. Crescita e manutenzione dei ceppi C. elegans

1. Seme Nematode Growth Medium (NGM, vedi Tabella dei materiali) piastre di agar con 300 -L della crescita lenta E. coli ceppo OP50 in un armadio di flusso laminare.
2. Lasciare asciugare le piastre di agar NGM nell'armadio di flusso laminare.
   NOTA: In assenza di armadietto a flusso laminare, le piastre possono essere lasciate asciugare sul banco, ma sono più soggette a contaminazione.
3. Trasferire almeno 20 animali a ciascuna delle due piastre di agar NGM di semi OP50 per avere scorte di lavoro. Ci sono due modi principali per trasferire gli animali.
   1. Raccolta: Sollevare delicatamente gli animali utilizzando un plettro sterilizzato a caldo. Questo metodo è efficace per la selezione di singoli o più animali da una piastra di agar. Avere un piccolo graffio di batteri sulla punta durante la raccolta aiuta il trasferimento.
      NOTA: Un plettro è fatto di un piccolo pezzo di filo di platino lungo circa 4 cm che è incorporato in una pipetta di vetro, con la punta di filo appiattita per essere 'lancia-come'. Sterilizzare il calore del prelievo tra la raccolta per evitare la contaminazione incrociata.
   2. Chunking: Utilizzando una spatola sterilizzata, tagliare un piccolo quadrato di agar contenente gli animali da una piastra e trasferito a testa in giù per un nuovo piatto.
      NOTE: Questo metodo è generalmente utile per trasferire un gran numero di vermi e per rimuovere la contaminazione dalle piastre attraverso più cicli di pezzi di agar non contaminato. Evitare la contaminazione incrociata infiammando la spatola per alcuni secondi e immergendo la spatola nel 100% di etanolo tra un trasferimento e l'altro. Il trasferimento da piastre affamate non è raccomandato in quanto la fame e il sovraffollamento possono influenzare la salute e la morfologia delle strutture cellulari e subcellulari.
4. Mantenere i vermi a temperatura di crescita standard (20 gradi centigradi). Per garantire la fornitura continua di vermi ben nutriti, trasferire i vermi su nuove piastre di semi OP50 ogni 2 o 3 giorni.

2. Sincronizzazione dell'età di C. elegans

1. Mantenere i vermi su 3-4 piatti NGM fino a quando la popolazione è affollata ma non affamato.
2. Lavare delicatamente i vermi dalla piastra NGM con soluzione M9. Le uova rimarranno sul piatto poiché si attaccano all'E. coli OP50. Ripetere con quattro passaggi di lavaggio aggiuntivi per rimuovere tutti gli animali nati.
3. Lasciare che i vermi si schiudano per 40 min.
4. Aggiungere 1-2 mL di soluzione M9 alla piastra e ruotare delicatamente per allentare i vermi appena schiusi.
5. Raccogli la soluzione M9 con i vermi nati di recente e trasferisci la soluzione con i vermi in una piastra NGM fresca.
6. Lasciare evaporare la soluzione M9 esponendo la piastra NGM all'aria. Fate questo adiacente a una fiamma aperta per evitare la contaminazione della piastra NGM.
7. Far crescere i vermi per 27 h a 20 gradi centigradi per consentire lo sviluppo nella terza fase larvale (L3). Per gli animali adulti di 3 giorni sincronizzati, i vermi vengono raccolti allo stadio larvale 4 e coltivati per altri 3 giorni per raggiungere la fase adulta di 3 giorni.

3. Preparazione dei vetrini per l'imaging

1. Preparare il 3-4% di brodo w/v agarose in una bottiglia a microonde (3-4 g in 100 mL di acqua ultrapura).
   NOTA: L'agar può essere utilizzato al posto dell'agarose alla stessa concentrazione.
2. Sciogliere l'agarose con attenzione in un forno a microonde, facendo attenzione a non ebollizione, fino a quando tutte le agarose si dissolvono (soluzione chiara). Mantenere la soluzione a 70 gradi centigradi per evitare la solidificazione.
   NOTA: lo stock di agarose può essere utilizzato più volte. Riscaldare prima dell'uso se l'agarose si è solidificato.
3. Utilizzando una pipetta Pasteur, mettere una goccia di agarose fuso su un vetrino del microscopio.
   NOTA: Evitare di avere bolle d'aria nella goccia di agar come questi interrompere l'integrità del pad.
4. Premere immediatamente verso il basso la goccia di agarose con un altro vetrino al microscopio, appiattindo delicatamente l'agarose in un pad tra i due vetrini.
   NOTA: Eventuali bolle rimanenti devono essere rimosse in questa fase. In caso contrario, i nuovi vetrini dovrebbero essere fatti come gli animali possono facilmente rimanere bloccati nelle bolle. Evitare l'overflow di agar di lato quando si preme sulla diapositiva.
5. Lasciare asciugare l'agarose per 1 min.
6. Separare con cura le due diapositive per evitare danni all'agarose, lasciando il pad solidificato su una delle diapositive.
   NOTA: I vetrini con pastiglie agarose devono essere sempre preparati freschi appena prima dell'esperimento in quanto possono asciugarsi. Assicurarsi che il cuscinetto di agarose abbia uno spessore costante. Non ci dovrebbero essere bolle d'aria o crepe nel pad in quanto questo può interferire con l'imaging.
7. Aggiungere una piccola goccia (5-10 l) di 0,05% di cloridrato tetramisole (anestetico) al centro del cuscinetto di agarose.
8. Utilizzando il piccone sterilizzato termicamente, trasferire rapidamente circa 10 – 15 animali dalla piastra di riserva alla goccia anestetica prima che la soluzione si asciughi. Evitare di trasferire troppi batteri OP50 in quanto questo rende la soluzione torbida, che può interferire con l'imaging.
   NOTA: Se la soluzione anestetica si asciuga durante la raccolta, è sufficiente pipettare una seconda goccia di 0,05% di cloruro di tetramisole sugli animali. Gli animali tendono a sdraiarsi sul loro lato laterale nella soluzione anestetica.
9. Applicare un coverslip posizionandolo appena sopra il pad agarose e facendolo cadere delicatamente verso il basso. Questo impedirà la formazione di bolle. Non applicare pressione sul coperchio in quanto ciò potrebbe schiacciare gli animali.
10. Etichettare le diapositive con il nome della deformazione.

4. Valutazione della morfologia sinaptica

NOTA: gli effetti della sovraespressione MEC-17 sull'integrità delle sinapsi nei neuroni del recettore tattile del microtubulo laterale posteriore (PLM) sono stati studiati quantificando le dimensioni sinaptiche e la localizzazione utilizzando la microscopia confocale a scansione lineare. I neuroni PLM (comprese le regioni sinaptiche) sono stati visualizzati utilizzando il transgene uIs115(Pmec-17::tagRFP) (strain: TU4065⁵) e la regione sinaptica è stata specificatamente etichettata con jsIs37(Pmec-7::snb-1::GFP) (strain: NM6644) (strain: NM6644) ⁶) . Questo studio è stato eseguito su animali sincronizzati L3 non transgenici e transgenici del ceppo di sovraespressione MEC-17 extracromosomal BXN507 [cjnEx036(Pmec-4::mec-17, Pmyo-2::mCherry); jsIs37; uIs115]⁷. Un elenco completo dei ceppi utilizzati in questo studio è incluso nella Tabella 1.

1. Imaging confocale delle sinapsi del neurone del recettore tattile
   1. Per immaginare le regioni sinaptiche, utilizzare un microscopio confocale a scansione di linee accoppiato a un laser a diodo semiconduttore pompato otticamente da 488 nm e 552 nm e dotato di software di acquisizione immagini.
   2. Individuare i vermi utilizzando l'ingrandimento più basso.
   3. Quando gli animali sono posizionati con successo, passare a un ingrandimento 40X e applicare un mezzo di immersione (in questo studio: è stato utilizzato un obiettivo multi-immersivo 40X/1.10 HC PL APO CS2 con immersione in acqua).
   4. Visualizza la regione sinaptica entusiasmando i fluorofori con un laser da 488 nm (potenza del 2%) per il fluoroforo GFP e 552 nm (1% di potenza) per il tagRFP fluorophore.
   5. Determinare il fotogramma x e y ottimale per catturare l'intera area sinaptica. Assicuratevi di considerare la dimensione ottimale in pixel quando selezionate il fotogramma. In questo studio, è stata ottenuta una dimensione costante dei pixel di 56 nm.
   6. Acquisire immagini utilizzando un rilevatore di foto ibrido e impostare i vantaggi per prevenire la sovraesposizione dei fluorofori (100% per 488 nm eccitazione e 15% per 552 nm eccitazione).
   7. Raccogliere le immagini z-stack per coprire l'intera sinapsi, utilizzando la dimensione ottimale z-step a seconda dell'obiettivo specifico utilizzato. In questo studio è stata utilizzata una dimensione ottimale di z-step di 0,211 nm.
      NOTA: Assicurarsi che tutte le immagini siano prese in condizioni rigorose per consentire la quantificazione e il confronto integrati della fluorescenza. Questo può essere fatto mantenendo i parametri di microscopia identici in tutte le immagini catturate (ad esempio, le impostazioni del laser e del rilevatore, le dimensioni dei pixel, la velocità di scansione e la dimensione ottimale dello z-step). Le impostazioni ottimali dipendono dall'obiettivo e possono essere calcolate utilizzando programmi di bioinformatica accessibili, come il calcolatore Nyquist (https://svi.nl/NyquistCalculator). Etichettare le immagini in modo sistematico, questo sarà utile quando si utilizza un software bioinformatica che organizzerà ed elaborai i file in base al nome del file.
2. Quantificazione della regione sinaptica
   1. Per analizzare la regione sinaptica, esportare le immagini come file TIFF. È possibile utilizzare un software di elaborazione di imaging basato su Java come ImageJ (in questo studio è stata utilizzata la macro di conversione dell'immagine MRI in ImageJ).
   2. Le dimensioni e i livelli integrati di intensità di fluorescenza delle sinapsi sono stati misurati dall'intensità di somma degli z-stack ottenuti con CellProfiler-3.1.5. Caricare le immagini nel software CellProfiler3.1.5. Se necessario, le immagini possono essere filtrate in base ai nomi dei file di immagine.
   3. Impostare il modulo Nome e tipo. Facoltativamente, estrarre i metadati dall'etichetta dell'immagine per organizzare di conseguenza i dati calcolati.
   4. Determinare l'area sinaptica a mano definizione di questa regione utilizzando il tag diffusoRF espresso dal transgene uIs115(Pmec-17::tagRFP). Questa operazione può essere eseguita aggiungendo il modulo relativo alla pipeline CellProfiler-3.1.5.This can be done by adding the regarding module to the CellProfiler-3.1.5 pipeline.
   5. Per misurare le dimensioni e la fluorescenza della sinapsi definita dalla mano, aggiungere il modulo Misura dimensione e forma oggetto e Intensità oggetto misura alla pipeline.
   6. Calcolare l'intensità di fluorescenza integrata relativa aggiungendo il modulo Calcola calcola calcola. Dividere le unità di intensità integrate ottenute da jsIs37(Pmec-7::snb-1::GFP) per le unità integrate ottenute per uIs115(Pmec-17::tagRFP).
   7. Esportare misurazioni e calcoli.

5. Quantificare la struttura muscolare della parete corporea

1. Immagine della fluorescenza della struttura muscolare della parete corporea
   1. Ottenere un ceppo (ad esempio, RW1596) portando il transgene stEx30(Pmyo-3::gfp::myo-3 - rol-6 (su1006))⁸, che etichetta le fibre di miosina con GFP.
      NOTA: L'introduzione del transgene negli animali può essere ottenuta incrociando uno sforzo di interesse con animali che già esprimono il transgene, o microiniettando il DNA nel braccio distale della gonade. Il fenotipo "rotolamento" indotto dalla mutazione rol-6 in questo transgene facilita la visualizzazione dei muscoli. I muscoli della parete del corpo corrono lungo i lati dorsale e ventrale che sono normalmente preclusi dalla vista negli animali selvatici perché in genere si trovano su uno dei loro lati laterali. L'allele rol-6(su1006) induce torsione degli animali, esponendo così alcune cellule muscolari per l'imaging.
   2. Immagine degli animali utilizzando un microscopio a fluorescenza accoppiato con una fotocamera dispositivo accoppiato caricato ad alta risoluzione (CCD), obiettivo 40X o superiore, filtro GFP e software di acquisizione.
   3. Regolare il tempo di esposizione e l'intensità dell'illuminazione per evitare immagini sovrasaturate.
   4. Cattura e salva le immagini dei muscoli (400X ingrandimento) da una sezione dell'animale contenente almeno una cella muscolare oblique visibile completa. Evitare le regioni con una singola cella muscolare che è incompleta o sezioni che sono fuori fuoco. Escludere anche le immagini dalle regioni anteriori e posteriori estreme e le regioni adiacenti alla vulva.
      NOTA: Se l'animale non ha una singola cellula muscolare completa visibile, far scorrere delicatamente il coperchio per trasformare l'animale in modo da esporre una cellula completa.
2. Misurazione dell'area delle cellule muscolari
   1. Aprire l'immagine nel software Fiji⁹ (versione 2.0.0 è stata utilizzata in questo studio).
   2. Utilizzare la selezione del poligono per tracciare con attenzione intorno a una singola cellula muscolare oblique. Regolare la linea del poligono alla fine trascinando il punto di ancoraggio per migliorare il ricalco.
   3. Vai alla scheda Analizza nella parte superiore del software e fai clic su Misura per calcolare l'area della selezione. Verrà visualizzata una tabella dei risultati separata contenente l'area e altre misure. Se la misura dell'area non è presente nella tabella dei risultati, passare a Imposta misurazioni nella scheda Analizza e verificare che la casella dell'area sia selezionata. Allo stesso modo, deselezionare altre misure che non sono necessarie.
   4. Per le celle muscolari con una regione degenerata/mancante, tracciate la regione mancante con lo strumento di selezione poligono e fate di nuovo clic su Misura. Se ci sono più spazi all'interno della cella, tracciare ogni spazio separatamente.
   5. Calcolare il rapporto tra l'area del gap e l'intera singola cellula muscolare. Un rapporto elevato indica una maggiore estensione della degenerazione muscolare a causa di grandi lacune all'interno della cellula. Se non ci sono regioni mancanti, come si vede comunemente negli animali selvatici, il rapporto verrebbe calcolato come zero.
      NOTA: Come controllo, il punteggio anche per i difetti della struttura muscolare visivamente e confrontare i risultati con la misurazione quantitativa. Ciò è particolarmente utile se il ceppo viene studiato per la prima volta in laboratorio. Per il punteggio fenotipico, valutare gli animali come difettosi o non difettosi in base all'integrità dei filamenti. Ad esempio, gli animali con perdita di striature di filamento distinte, gFP agglomerati o lacune all'interno delle cellule muscolari a causa di ripartizione strutturale, verrebbero valutati come difettosi.
3. Segmentazione e quantificazione della lunghezza della fibra di miosina
   1. Se necessario, convertire prima i file in . tif utilizzando Fiji o un altro pacchetto software. Salvare i file TIFF nella posizione desiderata.
   2. Aperto ilastik¹⁰ (software libero, versione 1.3.2 può essere scaricato da https://www.ilastik.org/).
   3. Una volta in ilastik, scegliere Classificazione pixel in Crea nuovo progetto. Il software richiederà il salvataggio del progetto. Rinominare il progetto e salvarlo nella posizione desiderata.
      NOTA: un nuovo progetto deve essere creato una sola volta. La segmentazione successiva può essere effettuata utilizzando lo stesso progetto. Per utilizzare le stesse impostazioni di progetto, passare alla scheda Progetto nella parte superiore e fare clic su Apri progetto per accedere al file di progetto.
   4. Nel pannello di sinistra devono essere presenti 5 schede (Dati di input, Selezione funzionalità, Formazione, Esportazione previsione ed Elaborazione batch). Nella scheda Dati di input fare clic su Aggiungi nuovo e quindi su Aggiungi immagini separate. Dirigere la finestra pop-up alla cartella contenente i file TIFF e selezionare l'immagine da aprire.
   5. Nella scheda successiva (Selezionefunzionalità), fare clic su Seleziona funzioni per selezionare tutte le funzioni dei pixel, indicate da caselle verdi selezionate. La selezione di pixel in questo passaggio viene utilizzata per distinguere le diverse classi di pixel nel passaggio successivo.
      NOTA: la selezione delle funzioni Pixel dipende dalla risoluzione dell'immagine. Quindi, gli sviluppatori suggeriscono di selezionare tutte o quante più funzioni possibili, se la potenza di elaborazione e il tempo lo consentono.
   6. Il pannello Allenamento seguente consente la classificazione di diverse classi di oggetti in base ai pixel. In questo caso, le due classi sono i singoli filamenti di miosina che esprimono GFP e lo sfondo indesiderato o i bordi sfocati. Fare clic su Aggiungi etichetta per avere la prima etichetta. Eseguire lo scarto su un certo numero di filamenti per iniziare la formazione del classificatore.
      NOTA: facendo doppio clic sull'etichetta è possibile modificare il nome (ad esempio, rinominando 'etichetta 1' in 'filamento'). Facendo doppio clic sulla casella colorata è possibile modificare i colori per il disegno e la visualizzazione delle probabilità. La dimensione predefinita del pennello è 1, anche se la dimensione può essere aumentata a 61. Se è stato disegnato il pixel errato, è sufficiente utilizzare lo strumento gomma per rimuovere il disegno. I controlli da tastiera (-) e (MAIUSC) possono essere utilizzati rispettivamente per ingrandire e ridurre l'immagine. I tasti freccia vengono utilizzati per spostarsi all'interno dell'immagine.
   7. Aggiungere una seconda etichetta e rinominarla in Sfondo. Scarabocchiare su sfondi indesiderati e spazi tra i filamenti.
   8. Fare clic su Live Update e assicurarsi che la classificazione è stata fatta dal software correttamente. Aggiungere altri scarabocchi e ottimizzare la formazione, se necessario.
      NOTA: È importante tenere d'occhio le fibre unite e i bordi sfocati (come la linea del corpo) in questo passaggio. Migliorare la previsione qui il più possibile per aumentare la precisione delle misurazioni. La precisione della stima dipende anche dalla risoluzione dell'immagine, poiché i pixel nelle immagini di bassa qualità sono più difficili da prendere in giro. È inoltre facoltativo, ma consigliato per eseguire il metodo di filtro nella funzione Suggerisci funzionalità accanto al controllo Live Update.
   9. Una volta che il classificatore di training è stato eseguito in modo adeguato, passare al pannello Esportazione previsione. Fare clic su Scegli impostazioni immagine di esportazione con probabilità come origine.
   10. Utilizzare le seguenti impostazioni. Sottoregione di ritaglio x e y selezionato e c deselezionato. I valori di inizio e fine per c devono essere rispettivamente 0 e 1. Selezionare e convertire il tipo di dati in Trasformazioni in un signed a 8 bit, selezionare nuovamente [min, max] e utilizzare i valori predefiniti. Modificare il formato del video del file di output in PNG e rinominare il file e la directory come desiderato.
   11. Chiudere la finestra delle impostazioni di esportazione ed esportare l'immagine specifica appena segmentata.
   12. Aprire l'immagine PNG salvata nel software Fiji. L'immagine dovrebbe apparire in bianco e nero.
   13. Regolare la soglia dell'immagine utilizzando le impostazioni predefinite.
   14. Applicare il plug-in di scheletro (Scheletra 2D/3D e quindi Analizza scheletro). Verrà visualizzata una tabella separata dei risultati, che include la lunghezza del ramo. La lunghezza del ramo rappresenta la lunghezza della fibra. Altri dati nei risultati potrebbero anche essere utili, come la distanza euclidea.
       NOTA: Omettere le fibre con lunghezze pari a 0 m o superiori a 250 m, in quanto queste dimensioni non sono fisiologicamente possibili.

6. Quantificare la morfologia mitocondriale

NOTA: Per la quantificazione della morfologia mitocondriale, questo studio ha utilizzato il ceppo BXN038⁷ contenente il numero uIs115(Pmec-17::tagRFP)⁵ transgene per visualizzare i neuroni PLM e jsIs609(Pmec-4::MLS::GFP)¹¹ per visualizzare i mitocondri specificamente all'interno dei neuroni PLM. Questo studio è stato eseguito in vermi adulti sincronizzati di 3 giorni, ma è stato eseguito con successo in altre età, così come in altri tessuti⁷.

1. Immagine di fluorescenza dei mitocondri all'interno dei neuroni PLM
   1. Per misurare i cambiamenti di dimensione e forma dei mitocondri all'interno dei neuroni PLM, visualizzare sia il neurone di sfondo che i mitocondri usando transgeniflui fluorescenti.
   2. Per immaginare il neurone PLM, utilizzare un microscopio confocale accoppiato a un laser a diodo a semiconduttori pompato otticamente da 488 nm e 552 nm e dotato di software di acquisizione immagini.
   3. Immagine del verme come da passi 4.1.1-4.1.4 sopra, garantendo condizioni di esposizione non saturanti.
   4. Per visualizzare l'intero neurone, potrebbe essere necessaria un'immagine piastrellata. Per raggiungere questo obiettivo, utilizzare il software con un'opzione di scansione piastrelle per individuare e rilasciare un marcatore in un angolo del neurone e quindi individuare l'estremità opposta e rilasciare l'altro marcatore. Il software calcolerà il numero ottimale di piastrelle necessarie per catturare l'area richiesta.
      NOTA: Per ridurre il tempo di scansione, è spesso più facile individuare i neuroni che seguono un singolo piano, con conseguente minor numero di tessere.
   5. Per accoppiare la scansione del riquadro con uno stack z, impostare i limiti inferiore e superiore prima di avviare la scansione del riquadro e assicurarsi che sia impostata la dimensione ottimale della sezione.
   6. Assicurati che la risoluzione sia ottimizzata, poiché la segmentazione sarà più raffinata con risoluzioni più elevate (in questo caso è stata utilizzata una risoluzione di 3224 x 3224 pixel).
      NOTA: Mentre il transgene uIs115(Pmec-17::tagRFP) viene utilizzato per contrassegnare il PLM e posizionare con successo la fotocamera, non è necessariamente necessario immagine a causa della leggera fluorescenza di fondo osservata dal jsIs609(Pmec-4::MLS::GFP) transgene all'interno dell'assone PLM stesso. Pertanto, il tempo di scansione e imaging può essere ridotto rimuovendo il filtro 552 nm dall'esperimento.
2. Segmentazione degli oggetti tramite SQUASSH
   1. Convertire i file di immagine in immagini .tiff e generare proiezioni di intensità massima dagli stack z utilizzando il software di imaging Fiji. Ritagliare le immagini alle dimensioni minime pur contenendo il neurone completo per ridurre il carico computazionale e ridurre il rumore di fondo.
      NOTA: Per i risultati rappresentativi, sono stati considerati solo i mitocondri all'interno dei lunghi processi assonali, quindi il corpo cellulare e qualsiasi mitocondri all'interno sono stati esclusi da ogni immagine.
   2. Utilizzando la macro Mosaic Suite SQUASSH per ImageJ, eseguite la segmentazione¹² di Split Bregman sulle proiezioni massime. Una guida dettagliata per l'installazione e l'applicazione di questa macro è disponibile sul sito Web Mosaic (http://mosaic.mpi-cbg.de/) e descritta da Rizk et al. 2014¹³. Il processo di segmentazione dell'immagine è descritto in breve.
      NOTA: Questa segmentazione identifica gli oggetti (in questo caso il mitocondrio individuale) sopra una soglia di intensità di fluorescenza, consentendo una misurazione accurata delle dimensioni e della forma di ogni singolo oggetto.
   3. Rimuovere il disturbo di fondo da un'immagine utilizzando il metodo a sfera a rotazione, in cui una finestra definita dall'utente si sposta attraverso l'immagine, imputando la stima dell'intensità di sfondo locale dall'intensità più frequente in ogni finestra. In questo modo vengono corrette le intensità di fondo non uniformi.
   4. Utilizzare il rilevamento degli oggetti per trovare approssimativamente le aree dell'immagine che contengono oggetti (mitocondri) di interesse, in base all'intensità di fluorescenza e al numero di pixel. I parametri che regolano questo passaggio sono la regolarizzazione e l'intensità minima dell'oggetto.
      NOTA: la regolarizzazione viene utilizzata per evitare la segmentazione di piccole intensità, picchi indotti dal rumore e la soglia minima di intensità dell'oggetto aiuta a definire gli organelli subcellulari dalla fluorescenza dei tessuti di fondo. Questi sono i due parametri principali che vengono manipolati per trovare una segmentazione ottimale dei mitocondri, e il processo di ottimizzazione tende ad essere tentativi ed errori di diversi parametri per un'immagine di prova, seguita da ispezione manuale.
   5. Utilizzare il software per stimare l'intensità di fondo locale intorno a ogni oggetto per facilitare il calcolo della segmentazione ottimale.
   6. Misurare i singoli oggetti per dimensioni, perimetro, lunghezza tramite numero di pixel, nonché l'intensità del segnale e la posizione x/ y sull'immagine. Per calcolare le misure in formato nm, calcolare le dimensioni in pixel dell'immagine originale.
      NOTA: per ogni esperimento, è necessario prima calcolare i parametri ottimali. Per garantire l'accuratezza della segmentazione, è consigliabile eseguire un'analisi SQUASSH su un'immagine di prova e ispezionare manualmente l'accuratezza della segmentazione. La macro fornisce file di output che mostrano i singoli oggetti identificati sull'immagine originale e l'ispezione di questi parametri strettamente e la regolazione dei parametri per soddisfare garantirà una segmentazione accurata. I parametri definiti devono quindi essere utilizzati per l'intero esperimento per la comparabilità. I parametri utilizzati per i risultati rappresentativi sono inclusi nella tabella 2.
   7. Aprire il software di analisi Fiji o ImageJ, passare al contenitore macro Mosaic e aprire il menu SQUASSH.
      1. Aprire il sottomenu Sottrazione in background e verificare che l'opzione Rimuovi sfondo sia selezionata. Il valore predefinito per le dimensioni della finestra è 10.
      2. Impostare i valori di Regolarizzazione e Intensità minima oggetto, canale 1 per identificare e segmentare al meglio gli oggetti (vedere il passaggio 6.2.4). I valori del canale 2 non sono necessari per gli oggetti contrassegnati con un singolo transgene.
      3. Fare clic sul PSF stimare dalle proprietà oggettive per stimare la funzione di diffusione dei punti in base alle caratteristiche del microscopio. Ciò consente di segmentare gli oggetti vicini tenendo conto dell'influenza di ogni pixel sul pixel adiacente.
         NOTA: la segmentazione dei subpixel non è stata utilizzata in questo esperimento a causa del suo aumento del carico sulla potenza di elaborazione del computer. Anche le maschere cellulari non sono state utilizzate in quanto l'assone è facilmente definito. Queste impostazioni sono utili per i tessuti più complessi e per definire gli oggetti su una cella per cella.
      4. Per le opzioni di visualizzazione, verificare che le caratteristiche Dettagli oggetto e Salva oggetto e immagine siano selezionate. Per utilizzarli in seguito nella grafica e nel software statistico, assicurarsi che venga immesso il numero corretto di condizioni.
   8. Individuare la cartella con le immagini .tiff ed eseguire la macro. Questo processo può essere eseguito su una singola immagine o su un batch di immagini per genotipo che si trova all'interno di una cartella. I file di output si troveranno nella cartella insieme alle immagini originali.
3. Analisi e misurazioni della forma
   1. Utilizzare l'output di SQUASSH per fornire un file CSV di dati oggetto dettagliato, che fornisce ogni singolo oggetto per riga, incluse le relative misure come descritto in precedenza.
      NOTA: mentre questo processo macro automatizza le misurazioni degli oggetti, è sempre importante controllare manualmente le immagini di output dopo la segmentazione SQUASSH per assicurarsi che la macro abbia identificato correttamente i mitocondri.
   2. Per analizzare la forma di ogni mitocondri, utilizzare una misura bidimensionale per la sfericità, la circolarità, per stimare la deviazione dell'oggetto da un cerchio perfetto.
      NOTA: La circolarità è una funzione dell'area e del perimetro(Circolalità) x (Area/Perimetro 2) dove 1 è un cerchio perfetto e 0 - una linea retta. Questo può essere ottenuto utilizzando una formula in grafica e software statistico.
   3. Per determinare la varianza in termini di dimensioni e forma attraverso il pool di mitocondri, calcolare gli istogrammi e una distribuzione gaussiana adattata utilizzando grafica e software statistico, con bidoni di 0,2 m per le dimensioni mitocondriali e 0,05 per la circolarità mitocondriale.

Risultati

C. elegans è un organismo modello ideale per studiare la morfologia di diversi tessuti e organelli grazie alla sua semplicità, al lignaggio cellulare noto, alla trasparenza e agli strumenti disponibili. Qui, forniamo approcci quantitativi per studiare organelli (ad esempio, mitocondri) e tessuti, tra cui sinapsi e muscoli utilizzando l'imaging a fluorescenza dal vivo e il software di elaborazione bio-immagine gratuito.

Discussione

Le variazioni morfologiche sono state frequentemente valutate attraverso il conteggio manuale di differenze evidenti o utilizzando soglie arbitrarie per determinare i difetti rispetto a un fenotipo di tipo selvaggio. Più recentemente, tuttavia, sono stati utilizzati metodi quantitativi per studi comparativi di morfologia per misurare e descrivere con precisione i cambiamenti a livello cellulare e subcellulare in modo imparziale. La capacità di identificare differenze sottili ma biologicamente rilevanti tra i fenotipi ?...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar-agar	Merck	1.01614.1000
Agarose	Invitrogen	16500-500
Confocal microscope	Leica	TCS SP8	Inverted platform
Fluorescence microscope	Carl Zeiss AG	Zeiss Axio Imager M2
Glass coverslips #1	Thermo scientifique	MENCS22221GP
Glass coverslips #1.5	Zeiss	474030-9000-000	Made by SCHOTT
Glass slides	Thermo scientifique	MENS41104A/40
Light LED	Schott	KL 300 LED
Stereo Microscope	Olympus	SZ51
Tryptone (Peptone from casein)	Merck	107213	Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium
Yeast Extract	Merck	103753	Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium
Sodium chloride	Merck	106404	Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium
Peptone (Peptone from meat)	Merck	107214	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Agar	Sigma	A1296	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Sodium chloride	Merck	106404	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Cholesterol	Sigma	C8667-25G	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Calcium chloride	Merck	102382	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Magnesium sulfate	Merck	105886	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Dipotassium phosphate	Merck	105101	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Potassium dihydrogen phosphate	Merck	104873	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Disodium phosphate	Merck	106586	Ingredients for M9 buffer
Sodium chloride	Merck	106404	Ingredients for M9 buffer
Potassium dihydrogen phosphate	Merck	104873	Ingredients for M9 buffer
Magnesium sulfate	Merck	105886	Ingredients for M9 buffer
Pasteur pipette	Corning	CLS7095D5X-200EA
Petri dishes	Corning	CLS430589-500EA
Platinum wire	Sigma	267201-2G
Spatula	Met-app	2616
Tetramisole hydrochloride	Sigma	L9756-5G