Approches quantitatives pour l'étude des structures cellulaires et de la morphologie d'organite à Caenorhabditis elegans

Résumé

Cette étude décrit des mesures quantitatives de la taille et de la localisation synaptiques, de la morphologie musculaire et de la forme mitochondriale chez C. elegans à l'aide d'outils de traitement d'image librement disponibles. Cette approche permet à des études futures chez C. elegans de comparer quantitativement l'étendue des changements structurels tissulaires et organllés résultant de mutations génétiques.

Résumé

Définir les mécanismes cellulaires sous-jacents à la maladie est essentiel pour le développement de nouvelles thérapies. Une stratégie fréquemment utilisée pour démêler ces mécanismes est d'introduire des mutations dans les gènes candidats et de décrire qualitativement les changements dans la morphologie des tissus et des organites cellulaires. Cependant, les descriptions qualitatives peuvent ne pas saisir les différences phénotypiques subtiles, peuvent dénaturer les variations phénotypiques entre les individus d'une population et sont souvent évaluées subjectivement. Ici, des approches quantitatives sont décrites pour étudier la morphologie des tissus et des organites dans le nématode Caenorhabditis elegans à l'aide de la microscopie confocale de balayage laser combinée avec le logiciel de traitement de bio-image disponible dans le commerce. Une analyse quantitative des phénotypes affectant l'intégrité des synapses (niveaux de taille et de fluorescence intégrée), le développement musculaire (taille des cellules musculaires et longueur du filament de la myosine) et la morphologie mitochondriale (circularité et taille) a été effectuée pour comprendre les effets des mutations génétiques sur ces structures cellulaires. Ces approches quantitatives ne se limitent pas aux applications décrites ici, car elles pourraient facilement être utilisées pour évaluer quantitativement la morphologie d'autres tissus et organites dans le nématode, ainsi que dans d'autres organismes modèles.

Introduction

Le nématode Caenorhabditis elegans (C. elegans) est de plus en plus utilisé comme un système modèle pour découvrir les processus biologiques et moléculaires impliqués dans les maladies humaines. Un nématode adulte a une longueur de corps d'un peu plus de 1 mm, et peut produire une grande couvée de jusqu'à 300 œufs¹. Après l'éclosion, C. elegans ne nécessitent que 3-4 jours pour atteindre l'âge adulte, et vivent pendant environ 2 à 3 semaines². En raison de sa facilité de culture, C. elegans est actuellement l'un des modèles animaux in vivo les plus recherchés pour effectuer un dépistage rapide et rentable des médicaments afin d'identifier les traitements pour les maladies humaines. En outre, sa conservation génétique, ses paradigmes comportementaux bien définis, son corps transparent pour la fluorescence ou la microscopie légère, et sa facilité de manipulation génétique rendent l'étude des conséquences cellulaires et moléculaires des mutations génétiques facilement réalisable ³. Le génome de C. elegans partage environ 60-80% d'orthologie avec des gènes humains, et environ 40% de ces gènes sont connus pour être liés à la maladie. Certaines des maladies humaines qui ont été modélisées et étudiées chez C. elegans comprennent les troubles neurodégénératifs (maladie d'Alzheimer, maladie de Parkinson, sclérose latérale amyotrophique, maladie de Charcot-Marie-Tooth), les maladies musculaires associées ( Dystrophie musculaire de Duchenne), et les maladies métaboliques (hyperglycémie)^2,4. Dans la plupart des désordres humains, la localisation cellulaire et organelle provoquée par la maladie et les changements morphologiques se produisent, qui peuvent facilement être évalués dans le modèle de nématode.

Les marqueurs fluorescents ont été largement utilisés pour étiqueter les tissus et les organites pour la visualisation dynamique au microscope. Cependant, chez C. elegans, les méthodes conventionnelles qui évaluent les irrégularités morphologiques dues aux mutations génétiques se sont largement appuyées sur des descriptions visuelles. Bien que les évaluations qualitatives puissent couvrir des gammes plus larges de descriptions phénotypiques (morphologie synaptique, agglutination du GFP, forme axonale spécifique, épaisseur des fibres musculaires, etc.) et fournir une vue d'ensemble des changements morphologiques, elles sont moins bien adaptées pour en comparant de petites variations entre les différents groupes. En outre, les évaluations qualitatives sont basées sur une évaluation visuelle et subjective, qui peut conduire à une surestimation ou à une sous-estimation des anomalies morphologiques. Enfin, les observations qualitatives peuvent également varier considérablement d'un individu à l'autre, ce qui crée des difficultés avec la réplication des données.

Ces dernières années, un certain nombre d'algorithmes de calcul faciles à utiliser et facilement disponibles qui peuvent analyser quantitativement les images ont été développés. Cependant, l'utilisation d'un tel logiciel d'analyse d'image pour certaines études morphologiques, en particulier en ce qui concerne les muscles de la paroi du corps et les mitochondries, dans la recherche C. elegans a pris du retard. Pour améliorer l'analyse structurelle sous-jacente chez C. elegans, certains des logiciels d'analyse d'images open source facilement disponibles ont été testés pour comparer quantitativement les effets des mutations génétiques sur les mitochondries musculaires, les muscles de la paroi du corps et les morphologie. Ces procédures expérimentales décrivent en détail comment ces programmes (Fidji, ilastik, CellProfiler, SQUASSH) peuvent être utilisés pour évaluer les changements dans la taille synaptique et la localisation des protéines synaptiques, la zone musculaire de la paroi du corps et la longueur des fibres, et la taille mitochondriale et circularité à la suite de mutations génétiques dans le nématode.

Protocole

1. Croissance et entretien des souches de C. elegans

1. Seed Nematode Growth Medium (NGM, voir Table of Materials) agar plates with 300 'L of the slow-growing E. coli strain OP50 in a lamir flow cabinet.
2. Laissez sécher les plaques d'agar NGM dans l'armoire à débit laminaire.
   REMARQUE : En l'absence d'armoire à débit laminaire, les plaques peuvent être laissées sécher sur le banc, mais elles sont plus sujettes à la contamination.
3. Transférer au moins 20 animaux dans chacune des deux plaques d'agar NGM ensevulées OP50 pour avoir des stocks de travail. Il y a deux façons principales de transférer les animaux.
   1. Cueillette : Soulevez délicatement les animaux à l'aide d'un pic stérilisé à la chaleur. Cette méthode est efficace pour sélectionner des animaux individuels ou multiples à partir d'une plaque d'agar. Avoir une petite éraflure de bactéries à la pointe lors de la cueillette aide le transfert.
      REMARQUE: Un pic est fait d'un petit morceau de fil de platine d'environ 4 cm de long qui est intégré dans une pipette en verre, avec la pointe de fil aplatipour d'être «spear-like». Stérilisez la pression à la chaleur entre la cueillette pour éviter la contamination croisée.
   2. Chunking: À l'aide d'une spatule stérilisée, couper un petit carré d'agar contenant les animaux d'une assiette et transféré à l'envers dans une nouvelle plaque.
      NOTES: Cette méthode est généralement utile pour transférer un grand nombre de vers, et pour éliminer la contamination des plaques par le biais de plusieurs tours de morceaux de l'agar non contaminé. Évitez la contamination croisée en flamboyant la spatule pendant quelques secondes et en plongeant la spatule dans 100% d'éthanol entre les transferts. Le transfert des plaques affamées n'est pas recommandé car la famine et le surpeuplement peuvent affecter la santé et la morphologie des structures cellulaires et subcellulaires.
4. Maintenir les vers à la température de croissance standard (20 oC). Pour assurer un approvisionnement continu de vers bien nourris, transférez les vers vers de nouvelles plaques ensedues OP50 tous les 2 à 3 jours.

2. Synchronisation par âge C. elegans

1. Maintenir les vers sur 3-4 plaques NGM jusqu'à ce que la population est bondée, mais pas affamé.
2. Lavez doucement les vers de la plaque NGM avec la solution M9. Les œufs resteront dans l'assiette puisqu'ils collent à l'E. coli OP50. Répétez l'opération avec quatre étapes de lavage supplémentaires pour enlever tous les animaux éclos.
3. Laisser les vers éclore pendant 40 min.
4. Ajouter 1-2 ml de solution M9 à la plaque et tourbillonner doucement pour desserrer les vers récemment éclos.
5. Recueillir la solution M9 avec des vers récemment nés et transférer la solution avec des vers à une plaque NGM fraîche.
6. Laissez la solution M9 s'évaporer en exposant la plaque NGM à l'air. Faites-le à côté d'une flamme nue pour éviter la contamination de la plaque NGM.
7. Cultivez les vers pendant 27 h à 20 oC pour permettre le développement dans la troisième étape larvaire (L3). Pour les animaux adultes synchronisés de 3 jours, les vers sont cueillis au stade larvaire 4, et cultivés pendant 3 jours supplémentaires pour atteindre le stade adulte de 3 jours.

3. Préparation de diapositives pour l'imagerie

1. Préparer 3-4% w/v alrose stock dans une bouteille allant au micro-ondes (3-4 g dans 100 ml d'eau ultrapure).
   REMARQUE: Agar peut être utilisé à la place de l'agarose à la même concentration.
2. Faire fondre soigneusement l'agarose dans un four à micro-ondes, en prenant soin de ne pas trop bouillir, jusqu'à ce que tout l'agarose se dissout (solution claire). Maintenez la solution à 70 oC pour éviter la solidification.
   REMARQUE : Le stock d'Agarose peut être utilisé plusieurs fois. Réchauffer avant utilisation si l'agarose s'est solidifiée.
3. À l'aide d'une pipette Pasteur, déposer une goutte d'agarose fondue sur une lame de microscope.
   REMARQUE : Évitez d'avoir des bulles d'air dans la goutte d'agar car celles-ci perturbent l'intégrité du tampon.
4. Appuyez immédiatement sur la gouttelette d'agarose avec une autre lame de microscope, aplatissant doucement l'agarose dans un tampon entre les deux diapositives.
   REMARQUE : Les restes de bulles doivent être enlevés à ce stade. Si ce n'est pas le cas, de nouvelles diapositives doivent être faites car les animaux peuvent facilement se coincer dans les bulles. Évitez le débordement d'agar sur le côté lorsque vous appuyez sur la glissière.
5. Laisser sécher l'agarose pendant 1 min.
6. Séparez soigneusement les deux diapositives pour éviter d'endommager l'agarose, tout en laissant le tampon solidifié sur l'une des diapositives.
   REMARQUE : Les glissières avec des coussinets d'agarose doivent toujours être préparées fraîchement juste avant l'expérience, car elles peuvent sécher. Assurez-vous que le tampon d'agarose a une épaisseur constante. Il ne devrait pas y avoir de bulles d'air ou de fissures dans le coussinet, car cela peut interférer avec l'imagerie.
7. Ajouter une petite goutte (5-10 l) d'hydrochlorure de tétramisole (anesthésique) de 0,05 % au centre du tampon d'agarose.
8. À l'aide d'un pic stérilisé à la chaleur, transférez rapidement environ 10 à 15 animaux de la plaque de bouillon à la gouttelette anesthésique avant que la solution ne s'assèche. Évitez de transférer trop de bactéries OP50 car cela rend la solution trouble, ce qui peut interférer avec l'imagerie.
   REMARQUE : Si la solution anesthésique s'assèche pendant la cueillette, il suffit de pipette une deuxième goutte de 0,05% d'hydrochlorure de téramisole sur les animaux. Les animaux ont tendance à se trouver sur leur côté latéral dans la solution anesthésique.
9. Appliquer un bordereau en le positionnant juste au-dessus du tampon d'agarose et en le laissant tomber doucement. Cela empêchera la formation de bulles. N'appliquez pas de pression sur la couverture car cela peut écraser les animaux.
10. Étiquetez les diapositives avec le nom de la souche.

4. Évaluer la morphologie synaptique

REMARQUE : Les effets de la surexpression de MEC-17 sur l'intégrité de synapse dans les neurones postérieurs de récepteur de contact de microtubule latéral (PLM) ont été étudiés en quantifiant la taille synaptique et la localisation utilisant la microscopie confocale de balayage de ligne. Les neurones PLM (y compris les régions synaptiques) ont été visualisés à l'aide du transgène uIs115 (Pmec-17::tagRFP) (souche : TU4065⁵) et la région synaptique a été spécifiquement étiquetée avec jsIs37 (Pmec-7::snb-1:GFP) (souche : NM664 ⁶) . Cette étude a été réalisée chez des animaux non transgéniques et transgéniques ltérogéogènes de la souche extrachromosomique MEC-17 surexpression BXN507 [cjnEx036 (Pmec-4::mec-17, Pmyo-2:mCherry); jsIs37; uIs115]⁷. Une liste complète des souches utilisées dans cette étude est incluse dans le tableau 1.

1. Imagerie confocale des synapses de neurones récepteurs tactiles
   1. Pour imager les régions synaptiques, utilisez un microscope confocal à balayage de ligne couplé à un laser à diodes semi-conducteurs à pompe optique de 488 nm et 552 nm et équipé d'un logiciel de capture d'image.
   2. Localisez les vers à l'aide du grossissement le plus bas.
   3. Lorsque les animaux sont situés avec succès, passez à un grossissement 40X et appliquez un milieu d'immersion (dans cette étude : un objectif multi-immersif 40X/1.10 HC PL APO CS2 avec immersion en eau a été utilisé).
   4. Visualisez la région synaptique en excitant les fluorophores avec un laser de 488 nm (2% de puissance) pour le fluorophore GFP et 552 nm (1% de puissance) pour le fluorophore tagRFP.
   5. Déterminez le cadre x et y optimal pour capturer toute la région synaptique. Assurez-vous de tenir compte de la taille optimale des pixels lors de la sélection du cadre. Dans cette étude, une taille de pixel cohérente de 56 nm a été obtenue.
   6. Capturez des images à l'aide d'un photodétecteur hybride et fixez les gains pour prévenir la surexposition des fluorophores (100 % pour 488 nm d'excitation et 15 % pour 552 nm d'excitation).
   7. Recueillir des images z-pile pour couvrir l'ensemble de la synapse, en utilisant la taille optimale z-étape en fonction de l'objectif spécifique utilisé. Dans cette étude, une taille optimale de z-step de 0.211 nm a été employée.
      REMARQUE : Assurez-vous que toutes les images sont prises dans des conditions strictes pour permettre la quantification et la comparaison intégrées de fluorescence. Cela peut être fait en gardant les paramètres de microscopie identiques sur toutes les images capturées (c.-à-d., les paramètres laser et détecteur, la taille des pixels, la vitesse de numérisation et la taille optimale de l'étape z). Les paramètres optimaux dépendent de l'objectif et peuvent être calculés à l'aide de programmes de bioinformatique accessibles, comme la calculatrice Nyquist (https://svi.nl/NyquistCalculator). Étiqueter les images systématiquement, ce sera utile lors de l'utilisation d'un logiciel de bioinformatique qui organisera et traitera les fichiers en fonction du nom de fichier.
2. Quantification de la région synaptique
   1. Pour analyser la région synaptique, exportez des images sous forme de fichiers TIFF. Un logiciel de traitement d'imagerie basé sur Java, tel que ImageJ, peut être utilisé (dans cette étude, la macro de conversion d'image IRM dans ImageJ a été utilisée).
   2. La taille et les niveaux intégrés d'intensité de fluorescence des synapses ont été mesurés à partir de l'intensité de somme des z-stacks obtenus avec CellProfiler-3.1.5. Chargez les images dans le logiciel CellProfiler3.1.5. Si nécessaire, les images peuvent être filtrées en fonction des noms de fichiers d'image.
   3. Configurez le module Nom et Type. En option, extraire les métadonnées de l'étiquette d'image pour organiser les données calculées en conséquence.
   4. Déterminer la définition synaptique de cette région à la main à l'aide du tagRFP diffus exprimé à partir du transgène uIs115 (Pmec-17::tagRFP). Cela peut être fait en ajoutant le module en ce qui concerne le pipeline CellProfiler-3.1.5.
   5. Pour mesurer la taille et la fluorescence de la synapse définie à la main, ajoutez la taille et la forme de l'objet Mesure, ainsi que le module d'intensité de l'objet Mesure au pipeline.
   6. Calculez l'intensité relative de fluorescence intégrée en ajoutant le module Calcul Math. Diviser les unités d'intensité intégréeobtenues à partir de jsIs37 (Pmec-7::snb-1:GFP) par les unités intégrées obtenues pour uIs115 (Pmec-17::tagRFP).
   7. Mesures et calculs à l'exportation.

5. Quantifier la structure musculaire de la paroi du corps

1. Imagerie de fluorescence de la structure de muscle de corps de corps
   1. Obtenir une souche (par exemple, RW1596) portant le transgène stEx30 (Pmyo-3:gfp::myo-3 - rol-6(su1006))⁸, qui étiquette les fibres de myosine avec GFP.
      REMARQUE : L'introduction du transgène chez les animaux peut être réalisée soit en croisant une souche d'intérêt avec des animaux qui expriment déjà le transgène, soit en micro-injectant de l'ADN dans le bras distal de la gonade. Le phénotype « roulant » induit par la mutation rol-6 dans ce transgène facilite la visualisation des muscles. Les muscles de la paroi du corps courent le long des côtés dorsaux et ventral qui sont normalement exclus de la vue chez les animaux de type sauvage parce qu'ils se trouvent généralement sur l'un de leurs côtés latéraux. L'allèle rol-6(su1006) induit la torsion des animaux, exposant ainsi certaines cellules musculaires pour l'imagerie.
   2. Imagez les animaux à l'aide d'un microscope à fluorescence couplé à une caméra couplée haute résolution (CCD), à un objectif 40X ou supérieur, à un filtre GFP et à un logiciel d'acquisition.
   3. Ajustez le temps d'exposition et l'intensité de l'éclairage pour éviter les images sursaturées.
   4. Capturez et enregistrez des images des muscles (grossissement 400X) à partir d'une section de l'animal contenant au moins une cellule musculaire oblique visible complète. Évitez les régions avec une seule cellule musculaire qui est incomplète ou des sections qui sont floues. Exclure également les images des régions extrêmes antérieures et postérieures, et des régions adjacentes à la vulve.
      REMARQUE : Si l'animal n'a pas une seule cellule musculaire complète visible, faites glisser doucement la glissière pour tourner l'animal afin d'exposer une cellule complète.
2. Mesure de la zone des cellules musculaires
   1. Ouvrez l'image dans le logiciel^{Fidji 9} (version 2.0.0 a été utilisé dans cette étude).
   2. Utilisez la sélection de polygones pour tracer soigneusement autour d'une seule cellule musculaire oblique. Ajustez la ligne du polygone à l'extrémité en faisant glisser le point d'ancrage pour améliorer le traçage.
   3. Aller à l'onglet Analyser en haut du logiciel et cliquez sur Mesurer pour calculer la zone de la sélection. Un tableau des résultats distinct contenant la zone et d'autres mesures sera affiché. Si la mesure de la zone est absente du tableau des résultats, allez à Définir les mesures sous l'onglet Analyse et vérifier que la case zone est cochée. De même, décochez d'autres mesures qui ne sont pas nécessaires.
   4. Pour les cellules musculaires avec une région dégénérée/manquante, tracez la région manquante avec l'outil de sélection de polygone et cliquez à nouveau sur Mesurer. S'il y a plusieurs lacunes dans la cellule, tracez chaque lacune séparément.
   5. Calculer le rapport de la zone d'écart à l'ensemble de la cellule musculaire unique. Un rapport élevé indique une plus grande étendue de dégénérescence musculaire due à de grandes lacunes dans la cellule. S'il n'y a pas de régions manquantes, comme on le voit couramment chez les animaux de type sauvage, le ratio serait calculé comme nul.
      REMARQUE: Comme un contrôle, le score aussi pour les défauts de structure musculaire visuellement et de comparer les résultats avec la mesure quantitative. Ceci est particulièrement utile si la souche est étudiée pour la première fois en laboratoire. Pour la notation phénotypique, évaluez les animaux comme défectueux ou non défectueux en fonction de l'intégrité des filaments. Par exemple, les animaux ayant perdu des stries de filament distincts, l'agglutination du PFG ou des lacunes dans les cellules musculaires en raison d'une dégradation structurelle seraient classés comme défectueux.
3. Segmentation et quantification de la longueur des fibres de myosine
   1. Si nécessaire, convertissez d'abord les fichiers en . tif à l'aide de Fidji ou d'un autre logiciel. Enregistrez les fichiers TIFF à l'emplacement souhaité.
   2. Open ilastik¹⁰ (logiciel libre, version 1.3.2 peut être téléchargé à partir de https://www.ilastik.org/).
   3. Une fois dans ilastik, choisissez Pixel Classification sous Créer un nouveau projet. Le logiciel invite à l'enregistrer dans le projet. Renommer le projet et enregistrer à l'emplacement souhaité.
      REMARQUE : Un nouveau projet n'a besoin d'être créé qu'une seule fois. La segmentation ultérieure peut être effectuée à l'aide du même projet. Pour utiliser les mêmes paramètres de projet, accédez à l'onglet Projet en haut et cliquez sur Projet ouvert pour accéder au fichier du projet.
   4. Il devrait y avoir 5 onglets sur le panneau de gauche (données d'entrée, sélection de fonctionnalités, formation, exportation de prédiction s'il y a eu et traitement par lots). Dans l'onglet Données d'entrée, cliquez sur Ajouter du nouveau, puis ajouter des images séparées. Dirigez la fenêtre contextielle vers le dossier contenant les fichiers TIFF et sélectionnez l'image à ouvrir.
   5. Dans l'onglet suivant ci-dessous ( Selectiondes fonctionnalités ), cliquez sur Sélectionner les fonctionnalités pour sélectionner toutes les fonctionnalités pixel, indiquées par des cases à cochées vertes. La sélection de pixels dans cette étape est utilisée pour distinguer les différentes classes de pixels dans l'étape suivante.
      REMARQUE : La sélection des fonctionnalités Pixel dépend de la résolution de l'image. Par conséquent, les développeurs suggèrent de sélectionner toutes ou autant de fonctionnalités que possible, si la puissance de traitement et le temps le permettent.
   6. Le panneau de formation suivant permet la classification de différentes classes d'objets en fonction des pixels. Dans ce cas, les deux classes sont les filaments individuels de myosine GFP-exprimant et l'arrière-plan non désiré ou les bords brouillés. Cliquez sur Ajouter l'étiquette pour avoir la première étiquette. Scrawl sur un certain nombre de filaments pour commencer la formation classificateur.
      REMARQUE : Le double clic de l'étiquette permet de changer de nom (par exemple, renommer « étiquette 1 » en « filament »). Le double clic de la boîte colorée permet de modifier les couleurs pour le dessin et les affichages de probabilité. La taille par défaut du pinceau est de 1, bien que la taille peut être augmentée à 61. Si le mauvais pixel a été dessiné, il suffit d'utiliser l'outil de gomme pour supprimer le dessin. Les commandes du clavier (-) et (Shift ) peuvent être utilisées pour effectuer un zoom avant et arrière de l'image, respectivement. Les touches de flèche sont utilisées pour naviguer autour de l'image.
   7. Ajoutez une deuxième étiquette et renommez-la en Contexte. Scrawl sur les arrière-plans indésirables et les espaces entre les filaments.
   8. Cliquez sur Mise à jour en direct et assurez-vous que la classification a été faite par le logiciel correctement. Ajouter plus de griffonnages et affiner la formation si nécessaire.
      REMARQUE: Il est important de garder un œil sur les fibres fusionnées et les bords flous (tels que la ligne du corps) dans cette étape. Améliorer la prédiction ici autant que possible pour augmenter la précision des mesures. La précision de prédiction dépend également de la résolution de l'image, car les pixels dans les images de faible qualité sont plus difficiles à distinguer. Il est également facultatif, mais recommandé d'exécuter la méthode de filtre dans la fonction Caractéristiques de suggérer à côté du contrôle de mise à jour en direct.
   9. Une fois que le classificateur de formation a été correctement exécuté, allez au panneau d'exportation de prévision. Cliquez sur Choisissez les paramètres d'image d'exportation avec les probabilités comme source.
   10. Utilisez les paramètres suivants. Découper la sous-région x et y coché, et c unticked. Les valeurs de démarrage et d'arrêt pour c doivent être 0 et 1, respectivement. Cochez et convertissez le type de données dans Transformations en 8 bits non signés, les tiques renormalisent [min, max] et utilisez les valeurs par défaut. Modifier le format de la vidéo de fichier de sortie à PNG, et renommer le fichier et l'annuaire comme vous le souhaitez.
   11. Fermez la fenêtre des paramètres d'exportation et exportez l'image spécifique qui vient d'être segmentée.
   12. Ouvrez l'image PNG enregistrée dans le logiciel Fidji. L'image doit apparaître en noir et blanc.
   13. Ajustez le seuil de l'image en utilisant les paramètres par défaut.
   14. Appliquer le plugin de setatisation (Skeletonize 2D/3D, puis Analyser le squelette). Un tableau séparé des résultats sera affiché, qui comprend la longueur de la branche. La longueur de la branche représente la longueur de la fibre. D'autres données dans les résultats pourraient également être utiles, comme la distance euclidn.
       REMARQUE : Omettre les fibres d'une longueur de 0 m ou plus de 250 m, car ces tailles ne sont pas physiologiquement possibles.

6. Quantifier la morphologie mitochondriale

REMARQUE : Pour la quantification de la morphologie mitochondriale, cette étude a utilisé la souche BXN038⁷ contenant l'uIs115 (Pmec-17:tagRFP)⁵ transgènes pour visualiser les neurones Eti609 de PLM (Pmec-4 :MLS::GFP)¹¹ pour visualiser les mitochondries spécifiquement dans les neurones PLM. Cette étude a été réalisée dans des vers adultes synchronisés de 3 jours, mais a été réalisée avec succès à d'autres âges, ainsi que dans d'autres tissus⁷.

1. Imagerie par fluorescence des mitochondries dans les neurones PLM
   1. Pour mesurer la taille et la forme des changements des mitochondries dans les neurones PLM, visualisez à la fois le neurone de fond et les mitochondries à l'aide de transgènes fluorescents.
   2. Pour imager le neurone PLM, utilisez un microscope confocal couplé à un laser à diodes semi-conducteurs à pompe optique de 488 nm et 552 nm et équipé d'un logiciel de capture d'image.
   3. Imagez le ver selon les étapes 4.1.1-4.1.4 ci-dessus, assurant des conditions d'exposition non saturantes.
   4. Afin de visualiser l'ensemble du neurone, une image de remaillée peut être nécessaire. Pour ce faire, utilisez un logiciel avec une option de balayage de tuile pour localiser et déposer un marqueur à un coin du neurone, puis localiser l'extrémité opposée et laisser tomber l'autre marqueur. Le logiciel calculera le nombre optimal de tuiles nécessaires pour capturer la zone requise.
      REMARQUE : Pour réduire le temps de numérisation, il est souvent plus facile de localiser les neurones qui suivent un seul plan, ce qui entraîne moins de tuiles.
   5. Pour coupler la tomodensitome avec une pile Z, fixez les limites inférieures et supérieures avant de commencer l'analyse de la tuile, et assurez-vous que la taille optimale de la tranche est fixée.
   6. Assurez-vous que la résolution est optimisée, car la segmentation sera plus raffinée avec des résolutions plus élevées (ici, une résolution de 3224 x 3224 pixels a été utilisée).
      REMARQUE: Alors que le transgène uIs115 (Pmec-17:tagRFP) est utilisé pour marquer le PLM et positionner avec succès la caméra, il n'a pas nécessairement besoin d'être photographié en raison de la légère fluorescence de fond observée à partir de la jsIs609 (Pmec-4:MLS::GFP) transgène au sein même de l'axone PLM. Ainsi, le temps de numérisation et d'imagerie peut être réduit en supprimant le filtre de 552 nm de l'expérience.
2. Segmentation d'objets à l'aide de SQUASSH
   1. Convertissez les fichiers d'images en images .tiff et produisez des projections d'intensité maximale à partir de z-stacks à l'aide d'un logiciel d'imagerie Fidji. Crop images à la taille minimale tout en contenant le neurone complet pour réduire la charge de calcul et de réduire le bruit de fond.
      REMARQUE : Pour les résultats représentatifs, seules les mitochondries dans les longs processus axonaux ont été considérées, de sorte que le corps cellulaire et toutes les mitochondries à l'intérieur ont été exclus de chaque image.
   2. À l'aide de la macro Mosaic Suite SQUASSH pour ImageJ, effectuez la segmentation Split Bregman¹² sur les projections maximales. Un guide détaillé de l'installation et de l'application de cette macro est disponible sur le site Mosaic (http://mosaic.mpi-cbg.de/) et décrit par Rizk et al. 2014¹³. Le processus de segmentation de l'image est décrit en bref ci-dessous.
      REMARQUE : Cette segmentation identifie des objets (dans ce cas la mitochondrie individuelle) au-dessus d'un seuil d'intensité de fluorescence, permettant la mesure précise de chaque taille et forme d'objets individuels.
   3. Supprimer le bruit de fond d'une image à l'aide de la méthode de la boule roulante, dans laquelle une fenêtre définie par l'utilisateur se déplace à travers l'image, en imputant l'estimation de l'intensité de fond locale de l'intensité la plus fréquente dans chaque fenêtre. Cela corrige les intensités inégales de fond.
   4. Utilisez la détection d'objets pour trouver grossièrement des régions de l'image qui contiennent des objets (mitochondries) d'intérêt, en fonction de l'intensité de la fluorescence et du nombre de pixels. Les paramètres qui régissent cette étape sont la régularisation et l'intensité minimale de l'objet.
      REMARQUE : La régularisation est employée pour éviter de segmenter la petite intensité, les crêtes bruit-induites, et le seuil minimum d'intensité d'objet aide à définir les organites subcellulaires de la fluorescence de tissu de fond. Ce sont les deux principaux paramètres qui sont manipulés pour trouver une segmentation optimale des mitochondries, et le processus d'optimisation tend à être l'essai et l'erreur de différents paramètres pour une image de test, suivie d'une inspection manuelle.
   5. Utilisez le logiciel pour estimer les intensités de fond locales autour de chaque objet pour faciliter le calcul de la segmentation optimale.
   6. Mesurez les objets individuels pour la taille, le périmètre, la longueur via le nombre de pixels, ainsi que l'intensité du signal et l'emplacement x/y sur l'image. Pour calculer les mesures de taille (nm), tenez compte de la taille du pixel de l'image originale.
      REMARQUE : Pour chaque expérience, les paramètres optimaux doivent d'abord être calculés. Pour assurer l'exactitude de la segmentation, il est conseillé d'effectuer une analyse SQUASSH sur une image de test et d'inspecter manuellement l'exactitude de la segmentation. La macro fournit des fichiers de sortie montrant les objets individuels qui ont été identifiés sur l'image d'origine, et l'inspection de ces paramètres de près et d'ajustement pour convenir assurera une segmentation précise. Les paramètres définis doivent ensuite être utilisés pour l'ensemble de l'expérience pour la comparabilité. Les paramètres utilisés pour les résultats représentatifs sont inclus dans le tableau 2.
   7. Ouvrez le logiciel d'analyse Fiji ou ImageJ, naviguez vers le conteneur macro Mosaic et ouvrez le menu SQUASSH.
      1. Ouvrez le sous-menu de soustraction d'arrière-plan et assurez-vous que l'arrière-plan Supprimer? est vérifié. La valeur par défaut pour la taille de la fenêtre est de 10.
      2. Définir la régularisation souhaitée et l'intensité minimale de l'objet, les valeurs du canal 1 pour identifier et segmenter au mieux les objets (voir l'étape 6.2.4). Les valeurs du canal 2 ne sont pas nécessaires pour les objets marqués d'un seul transgène.
      3. Cliquez sur le PSF D'estimation à partir de propriétés objectives pour estimer la fonction de propagation des points en fonction des caractéristiques du microscope. Cela permet de segmenter des objets étroitement situés en tenant compte de l'influence de chaque pixel sur son pixel voisin.
         REMARQUE : La segmentation des sous-pixels n'a pas été utilisée dans cette expérience en raison de sa charge accrue sur la puissance de traitement informatique. Les masques cellulaires n'ont pas non plus été utilisés car l'axone est facile à définir. Ces paramètres sont utiles pour les tissus plus complexes et pour définir les objets sur une base cellulaire par cellule.
      4. Pour les options de visualisation, assurez-vous que les contours de l'objet et enregistrez les caractéristiques de l'objet et de l'image. Pour une utilisation ultérieure dans les graphiques et les logiciels statistiques, assurez-vous que le nombre correct de conditions sont entrées.
   8. Localisez le dossier avec des images .tiff et exécutez la macro. Ce processus peut être effectué sur une image individuelle ou sur un lot d'images par génotype situé dans un dossier. Les fichiers de sortie seront situés dans le dossier avec les images originales.
3. Analyse et mesures de la forme
   1. Utilisez la sortie de SQUASSH pour fournir un fichier .csv de données d'objets détaillés, qui fournit chaque objet individuel par rangée, y compris ses mesures telles que décrites ci-dessus.
      REMARQUE : Bien que ce processus macro automatise les mesures d'objets, il est toujours important de vérifier manuellement les images de sortie après la segmentation SQUASSH pour s'assurer que la macro a correctement identifié les mitochondries.
   2. Pour analyser la forme de chaque mitochondrie, utilisez une mesure bidimensionnelle pour la sphérité, La Circularité,pour estimer la déviation de l'objet à partir d'un cercle parfait.
      REMARQUE : La circularité est fonction de la zone et du périmètre (Circularité ( 4 x ) x (Zone/Périmètre²) où 1 , un cercle parfait et 0 , une ligne droite. Cela peut être réalisé en utilisant une formule dans les logiciels graphiques et statistiques.
   3. Pour déterminer la variance de la taille et de la forme à travers le bassin de mitochondries, calculez les histogrammes et une distribution gaussienne équipée à l'aide de logiciels graphiques et statistiques, avec des bacs de 0,2 m pour la taille mitochondriale et de 0,05 pour la circularité mitochondriale.

Résultats

C. elegans est un organisme modèle idéal pour étudier la morphologie de différents tissus et organites en raison de sa simplicité, de sa lignée cellulaire connue, de sa transparence et des outils disponibles. Ici, nous fournissons des approches quantitatives pour l'étude des organites (p. ex. les mitochondries) et des tissus, y compris les synapses et les muscles à l'aide d'imagerie par fluorescence vivante et d'un logiciel gratuit de traitement de la bio-image.

Discussion

Les variations morphologiques ont souvent été évaluées par comptage manuel des différences notables ou en utilisant des seuils arbitraires pour déterminer les défauts par rapport à un phénotype de type sauvage. Plus récemment, cependant, des méthodes quantitatives ont été utilisées pour des études comparatives de la morphologie afin de mesurer et de décrire avec précision les changements au niveau cellulaire et subcellulaire d'une manière impartiale. La capacité d'identifier les différences subtiles m...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar-agar	Merck	1.01614.1000
Agarose	Invitrogen	16500-500
Confocal microscope	Leica	TCS SP8	Inverted platform
Fluorescence microscope	Carl Zeiss AG	Zeiss Axio Imager M2
Glass coverslips #1	Thermo scientifique	MENCS22221GP
Glass coverslips #1.5	Zeiss	474030-9000-000	Made by SCHOTT
Glass slides	Thermo scientifique	MENS41104A/40
Light LED	Schott	KL 300 LED
Stereo Microscope	Olympus	SZ51
Tryptone (Peptone from casein)	Merck	107213	Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium
Yeast Extract	Merck	103753	Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium
Sodium chloride	Merck	106404	Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium
Peptone (Peptone from meat)	Merck	107214	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Agar	Sigma	A1296	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Sodium chloride	Merck	106404	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Cholesterol	Sigma	C8667-25G	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Calcium chloride	Merck	102382	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Magnesium sulfate	Merck	105886	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Dipotassium phosphate	Merck	105101	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Potassium dihydrogen phosphate	Merck	104873	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Disodium phosphate	Merck	106586	Ingredients for M9 buffer
Sodium chloride	Merck	106404	Ingredients for M9 buffer
Potassium dihydrogen phosphate	Merck	104873	Ingredients for M9 buffer
Magnesium sulfate	Merck	105886	Ingredients for M9 buffer
Pasteur pipette	Corning	CLS7095D5X-200EA
Petri dishes	Corning	CLS430589-500EA
Platinum wire	Sigma	267201-2G
Spatula	Met-app	2616
Tetramisole hydrochloride	Sigma	L9756-5G