Caenorhabditis elegans hücresel yapıları ve organelle morfoloji eğitim için nicel yaklaşımlar

Özet

Bu çalışmada, sinaptik boyut ve lokalizasyon, kas Morfoloji ve marochondrial şekil nicel ölçümler serbestçe kullanılabilir görüntü işleme araçları kullanarak C. elegans özetliyor. Bu yaklaşım, C. elegans 'da gelecekteki çalışmaların, genetik mutasyonların bir sonucu olarak doku ve organel yapısal değişikliklerin kapsamını nicel olarak karşılaştırmasına olanak sağlar.

Özet

Hastalığın altta yatan hücresel mekanizmaların tanımlanması, yeni teraplerin geliştirilmesi için önemlidir. Bu mekanizmaları çözmek için sık kullanılan bir strateji, aday genlerde mutasyonları tanıtmak ve dokuların ve hücresel organizlerin morfolojisindeki değişiklikleri niteliksel olarak tarif etmektir. Ancak, nitel açıklamaları ince fenosimik farklar yakalamayabilir, bir nüfusun bireyler arasında fenotipi varyasyonları yanlış gösterebilir, ve sıklıkla subjektif olarak değerlendirilir. Burada, nicel yaklaşımlar nematod Caenorhabditis elegans içinde dokuların ve organelilerin morfolojisi, ticari olarak mevcut biyo-görüntü işleme yazılımı ile birlikte lazer tarama konfetit mikroskopisi kullanarak incelemek için açıklanmıştır. Sinaps bütünlüğünü (boyut ve entegre floresan seviyeleri) etkileyen fenotiplerin nicel analizi, kas gelişimi (kas hücresi boyutu ve miyosin filament uzunluğu), ve mitokondriyal morfoloji (devre ve boyutu) anlamak için yapıldı Bu hücresel yapılarda genetik mutasyonların etkileri. Bu niceliksel yaklaşımlar, burada açıklanan uygulamalarla sınırlı değildir, çünkü Nematot 'taki diğer dokuların ve organelların morfolojisini ve diğer model organizmalardaki gibi kolayca nicel olarak değerlendirmek için kullanılabilir.

Giriş

Nematod Caenorhabditis elegans (C. elegans) , insan hastalığında yer alan biyolojik ve moleküler süreçleri ortaya çıkarmak için giderek bir model sistemi olarak kullanılmaktadır. Bir yetişkin nematod sadece 1 mm üzerinde bir vücut uzunluğu vardır ve 300 yumurta¹kadar büyük bir damızlık üretebilir. Hatching sonra, C. elegans sadece yetişkin ulaşmak için 3-4 gün gerektirir ve yaklaşık 2 ila 3 hafta²için yaşamak. Kültür kolaylığı nedeniyle, C. elegans Şu anda insan hastalıkları için terapötik tanımlamak için maliyet-etkili, hızlı ilaç taraması yapmak için en çok aranan in vivo hayvan modellerinin biridir. Ayrıca, genetik koruma, iyi tanımlanmış davranışsal paradigmalar, floresan veya ışık mikroskobu için şeffaf vücut, ve genetik manipülasyon kolaylığı genetik mutasyonların hücresel ve moleküler sonuçlarının çalışma kolayca ulaşılabilir hale ³. C. elegans genom hisselerin yaklaşık% 60-80 insan genleri ile ortoloji ve bu genlerin yaklaşık% 40 ' i hastalık ile ilgili olduğu bilinmektedir. C. elegans modellenmiş ve okudu bazı insan hastalıkları nörodejeneratif bozukluklar (Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı, amilotrofik lateral skleroz, Charcot-Marie-Tooth hastalığı), kas ilişkili hastalıklar ( Duchenne kas Distrofi) ve metabolik hastalıklar (hiperglisemi)^2,4. Çoğu insan bozukluklarında, hastalığın kaynaklı hücresel ve organel lokalizasyonu ve morfolojik değişiklikler ortaya çıkar ve bu da Nematot modelinde kolayca değerlendirilebilecek.

Floresan işaretçileri mikroskopla dinamik görselleştirme için dokulara ve organelleri etiketlemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Ancak, C. elegans, genetik mutasyonlar nedeniyle morfolojik düzensizlikleri değerlendirmek konvansiyonel yöntemler büyük ölçüde görsel açıklamaları üzerinde dayanmış. Nitel değerlendirmeler fenokolojik açıklamaların daha geniş aralıklarını (sinaptik morfoloji, Gfp kümelenme, spesifik akal şekli, kas lif kalınlığı, vb.) kapsayacak ve morfolojik değişikliklerin bir kuş bakışı görünümü sağlamak, onlar için daha az uygundur farklı gruplar arasında küçük varyasyonları karşılaştırarak. Ayrıca, niteliksel değerlendirmeler, morfolojik anomalilerin üzerinde veya daha fazla tahminine yol açabilecek görsel, subjektif değerlendirmeye dayanır. Son olarak, nitel gözlemler de bireyler arasında büyük farklılık gösterebilir, veri çoğaltma ile zorluklar yaratmak.

Son yıllarda, görüntüleri nicel olarak analiz edebilir Kullanıcı dostu, kolayca kullanılabilir Hesaplamalı algoritmalar bir dizi geliştirilmiştir. Ancak, bazı morfolojik çalışmalar için bu tür görüntü analiz yazılımının kullanımı, özellikle vücut duvar kasları ve mitokondri ile ilgili olarak, C. elegans araştırma arkasında gecikmiştir. C. eleganstemel yapısal analiz geliştirmek için, bazı hazır, açık kaynak görüntü analiz yazılımı niceliksel kas mitokondri üzerinde genetik mutasyonların etkilerini karşılaştırmak için trialed edildi, vücut duvar kas ve sinaptik Morfolojisi. Bu deneysel prosedürler ayrıntılı olarak nasıl bu programların (Fiji, ilastik, CellProfiler, SQUASSH) sinaptik boyutu ve sinaptik protein lokalizasyonu, vücut duvar kas alanı ve lif uzunluğu ve mitokondriyal boyutu değişiklikleri değerlendirmek için kullanılabilir anahat ve Nematot genetik mutasyonlar sonucu olarak döngü.

Protokol

1. büyüme ve bakım C. elegans suşları

1. Tohum Nematode büyüme orta (NGM, bkz. malzeme tablosu) bir laminar akış kabininde yavaş büyüyen E. COLI gerinim OP50 μL 300 ile agar plakaları.
2. NGM agar plakalarını laminar akış kabininde kurumaya bırakın.
   Not: laminar akış kabininin yokluğunda, plakalar bankta kurumaya bırakılabilirler, ancak kontaminasyona daha eğilimli olurlar.
3. İki OP50-seeded NGM agar plakaları her biri için en az 20 hayvan transfer çalışma stokları var. Hayvanları aktarmanın iki ana yolu vardır.
   1. Çekme: sıcaktan sterilize edilmiş bir pick kullanarak hayvanları yavaşça kaldırın. Bu yöntem bir agar plaka bireysel veya birden fazla hayvan seçmek için etkilidir. Küçük bir bakteri kazımına sahip olduğunda, çekme transferi yardımcı olur.
      Not: bir seçim bir cam pipet gömülür yaklaşık 4 cm uzunluğunda platin tel küçük bir parça yapılır, tel ucu ' mızrak benzeri ' olarak düzleştirilmiş ile. Çapraz kontaminasyonu önlemek için çekme arasındaki Pick ısı sterilize.
   2. Chunking: sterilize spatula kullanarak, bir plaka hayvanları içeren agar küçük bir kare kesti ve yeni bir plaka için ters transfer.
      Notlar: Bu yöntem genellikle solucanlar çok sayıda aktarmak için yararlıdır ve olmayan kontamine agar parçalama birden fazla tur ile plakalardan kontaminasyonu kaldırmak için. Birkaç saniye spatula yanan ve transferler arasında 100% etanol içinde spatula daldırarak çapraz kontaminasyonu kaçının. Açlık ve aşırı kalabalık, hücresel ve hücre içi yapıların sağlığını ve morfolojisini etkileyebilir.
4. Solucanları standart büyüme sıcaklığında koruyun (20 °C). İyi beslenen solucanlar sürekli tedarik sağlamak için, yeni OP50-seeded plakaları her 2 ila 3 gün solucanlar aktarın.

2. yaş-senkronizasyon C. elegans

1. Nüfus kalabalık ama açlıktan değil kadar 3-4 NGM plakaları üzerinde solucanlar koruyun.
2. M9 çözeltisi ile NGM plakasının solucanlarını nazikçe yıkayın. Onlar E. COLI OP50sopa beri yumurta plaka üzerinde kalacaktır. Tüm yumurtadan hayvanları kaldırmak için dört ek yıkama adımlarını tekrarlayın.
3. Solucanlar 40 dk için yumurtadan izin verin.
4. 1-2 mL M9 çözeltisi plakaya ekleyin ve son zamanlarda yumurtadan solucanları gevşetmek için hafifçe kıvrın.
5. Son zamanlarda doğmuş solucanlarla M9 çözümünü toplayın ve çözümü solucanlar ile taze bir NGM plakasına aktarın.
6. NGM plakasını havaya çıkararak M9 çözeltinin Buharlık yapmasına izin verin. NGM plakasının kontaminasyonunu önlemek için bunu açık bir alev ile bitişik yapın.
7. Üçüncü larva (L3) aşamasında gelişimine izin vermek için 20 °c ' de 27 saat boyunca solucanları büyütün. Senkronize 3 günlük Yetişkin hayvanlar için, solucanlar larva Aşama 4 ' de seçilmiş ve 3 gün eski yetişkin aşamasına ulaşmak için daha 3 gün yetişir.

3. görüntüleme için slaytların hazırlanması

1. Bir mikrodalga-güvenli şişe içinde% 3-4 w/v agaroz stok hazırlayın (3-4 g 100 ml Ultra saf su).
   Not: agar, agaroz yerine aynı konsantrasyonda kullanılabilir.
2. Tüm agaroz çözülür (NET çözüm) kadar, üzerinde kaynatma değil bakım alarak, bir mikrodalga fırında dikkatle agaroz eritin. Katılaşma önlemek için 70 °C ' de çözüm tutun.
   Not: Agarose stok birkaç kez kullanılabilir. Agaroz katılaştırılmış ise kullanmadan önce yeniden ısıtın.
3. Bir Pasteur pipet kullanarak, bir damla erimiş agaroz bir mikroskop slayt üzerine yerleştirin.
   Not: Bu yastık bütünlüğünü bozar gibi agar damlası içinde hava kabarcıkları sahip kaçının.
4. Agaroz damlacılığı hemen başka bir mikroskop kaydırağı ile aşağı bastırın ve agaroz 'i iki slayt arasındaki bir yastık içine hafifçe düzleştirin.
   Not: herhangi bir kalan kabarcıklar bu aşamada kaldırılmalıdır. Değilse, hayvanlar kolayca kabarcıklar sıkışmış alabilirsiniz yeni slaytlar yapılmalıdır. Slayda basıldığında yan agar taşması kaçının.
5. Agaroz 'i 1 dakika boyunca kurumaya bırakın.
6. Agarose hasar görmesini önlemek için iki slayt dikkatle ayırın, slaytlardan birinde katılaştırılmış Pad bırakarak.
   Not: agaroz pedleri olan slaytlar, her zaman deneyden hemen önce kuru olarak hazırlanmalıdır. Agaroz yastığı tutarlı bir kalınlığa sahip olduğundan emin olun. Bu görüntüleme etkileyebilir gibi yastık hiçbir hava kabarcıkları veya çatlaklar olmalıdır.
7. Agaroz yastık merkezine% 0,05 tetramisol hidroklorür (anestezik) küçük bir damla (5-10 μL) ekleyin.
8. Isı Sterilized almak kullanarak, hızlı bir şekilde 10 – 15 hayvan stok plakadan anestezik damlacık için çözüm kurmadan önce transfer. Bu görüntü ile müdahale edebilir çözüm bulutlu yapar gibi çok fazla OP50 bakteri aktarımı kaçının.
   Not: Eğer anestezik çözelti toplama sırasında kurur, sadece hayvan üzerine% 0,05 tetramisole hidroklorür ikinci bir damla pipet. Hayvanlar anestezik çözelti içinde lateral tarafında yatıyordu eğilimindedir.
9. Agaroz yastığı hemen üstünde konumlandırarak ve yavaşça aşağı bırakarak bir lamel magazini uygulayın. Bu kabarcıkların oluşumunu önleyecek. Bu hayvanları ezebilir gibi lamel magazini için basınç uygulamaz.
10. Slaytları gerinim adıyla etiketleyin.

4. sinaptik morfoloji değerlendirilmesi

Not: arka lateral microtubül (PLM) dokunmatik reseptör nöronlar içinde sinaps bütünlüğü üzerinde MEC-17 ekspresyonu etkileri, sinaptik boyutu ve lokalizasyonu hat tarama konfoksal mikroskobik kullanılarak ölçülmesi ile incelendi. PLM nöronlar (sinaptik bölgeler dahil) UIs115 kullanılarak görselleştirildi ( pmec-17:: tagRFP) transgene (GERINIM: TU4065⁵) ve sinaptik bölge özellikle JsIs37 Ile etiketlenmiş (pmec-7:: SNB-1:: Gfp) (gerinim: NM664 ⁶) . Bu çalışma extrakromozomal MEC-17 ekspresyonu strain BXN507 [cjnEx036 (pmec-4:: MEC-17, pmyo-2:: MCherry); jsIs37; uIs115]⁷' nin senkronize L3 olmayan transjenik ve transjenik hayvanlarında yapılmıştır. Bu çalışmada kullanılan suşların tam listesi Tablo 1' de yer almaktadır.

1. Dokunmatik reseptör nöron sinaps Konfokal görüntüleme
   1. Sinaptik bölgeler görüntü için, bir hat kullanarak bir 488 nm ve 552 nm optik pompalanmış yarı iletken Diode lazer ve görüntü yakalama yazılımı ile donatılmış bir konfoksal mikroskop tarama kullanın.
   2. En düşük büyütme kullanarak solucanlar bulun.
   3. Hayvanların başarılı bir şekilde bulunduğu zaman, 40X büyütmeye geçin ve daldırma ortamını uygulayın (Bu çalışmada: 40X/1.10 HC PL APO CS2 çok sürükleyici bir amaç ile su daldırma kullanılmıştır).
   4. TagRFP fluorophore için GFP fluorophore ve 552 Nm (% 1 güç) için 488 nm lazer (% 2 güç) ile heyecan verici fluorophores tarafından sinaptik bölgeyi görselleştirin.
   5. Tüm sinaptik bölgeyi yakalamak için optimum x ve y çerçevesini belirleyin. Çerçeveyi seçerken en uygun piksel boyutunu göz önünde bulundurtığınızdan emin olun. Bu çalışmada 56 nm 'lik tutarlı bir piksel boyutu elde edilmiştir.
   6. Hibrid fotoğraf dedektörü kullanarak görüntüleri yakalamak ve fluorophores aşırı maruz kalmasını önlemek için kazançlar ayarlamak (488 nm uyarma için% 100 ve 552 nm uyarılma için% 15).
   7. Kullanılan belirli bir hedefe bağlı olarak optimum z-Step boyutunu kullanarak tüm SYNAPSE kapsayacak şekilde z-yığını görüntüleri toplayın. Bu çalışmada 0,211 nm 'lik optimum z-Step boyutu kullanılmıştır.
      Not: tüm görüntülerin entegre floresan ölçümlerine ve karşılaştırmasına izin vermek için sıkı durumda alındığından emin olun. Bu, microskopi parametrelerini tüm yakalanan görüntüler (örn. lazer ve dedektör ayarları, piksel boyutu, tarama hızı ve optimum z-Step boyutu) boyunca özdeş tutarak yapılabilir. Optimum ayarlar amaca bağlıdır ve Nyquist hesap makinesi (https://svi.nl/NyquistCalculator) gibi erişilebilir Biyoinformatik programlar kullanılarak hesaplanabilir. Etiket görüntüleri sistematik olarak, bu yararlı olacaktır düzenlemek ve dosya adını temel alarak işlemek Biyoinformatik yazılım kullanırken.
2. Sinaptik bölgenin ölçülmesini
   1. Sinaptik bölgeyi analiz etmek için görüntüleri TIFF dosyaları olarak dışa aktarın. Imagej gibi Java tabanlı görüntüleme işleme yazılımı kullanılabilir (Bu çalışmada, ımagej 'deki MRG görüntü dönüştürme makrosunu kullanıldı).
   2. Sinslerin boyutu ve entegre floresan yoğunluğu düzeyleri, CellProfiler-3.1.5 ile elde edilen z-yığınlarının toplam yoğunluğundan ölçülmüştür. Görüntüleri CellProfiler 3.1.5 yazılımına yükleyin. Gerekirse, resimler görüntü dosyası adlarına göre filtrelenebilir.
   3. Ad ve tür modülünü ayarlayın. İsteğe bağlı olarak, hesaplanan verileri uygun şekilde düzenlemek için meta verileri görüntü etiketinden ayıklayın.
   4. UIs115 (pmec-17:: tagrfp) transgene 'den ifade edilen diffik tagrfp kullanarak bu bölgenin elle tanımı ile sinaptik bölgesini belirleyin. Bu ilgili modül CellProfiler-3.1.5 ardışık düzen ekleyerek yapılabilir.
   5. Elle tanımlanan SYNAPSE boyutunu ve fluoresans ölçmek için, Ölçü nesnesi boyutu ve Şekil ve Ölçü nesne yoğunluğu modülü ardışık düzen ekleyin.
   6. Matematiksel Hesaplama modülünü ekleyerek göreli entegre floresan yoğunluğunu hesaplayın. JsIs37 'den elde edilen entegre yoğunluklu üniteleri (Pmec-7:: SNB-1:: GFP) uIs115 için elde edilen entegre üniteler ile bölün (pmec-17:: tagrfp).
   7. Ölçümleri ve hesaplamaları dışa aktarın.

5. vücut duvar kas yapısını ölçmek

1. Vücut duvar kas yapısının floresans görüntüleme
   1. Miyozin liflerini Gfp ile etiketlemek için transgene stEx30 (pmyo-3:: Gfp:: MYO-3 + rol-6 (su1006))⁸' i taşıyan bir gerinim (örneğin, RW1596) alın.
      Not: transgeni hayvanların içine giriş, zaten transgeni ifade eden hayvanlarla veya gonad 'ın distal koluna mikroenjeksiyon DNA 'sına geçerek elde edilebilir. Bu transgeni rol-6 mutasyonu tarafından indüklenen ' Rolling ' fenotipi kasların görselleştirilmesini kolaylaştırır. Vücut duvar kasları genellikle onların lateral kenarlarından birinde yalan çünkü normalde vahşi tip hayvanların görünümünden önleyen dorsal ve ventral taraf boyunca çalıştırın. Rol-6 (su1006) allel hayvanların büküm indükler, böylece görüntüleme için bazı kaslar hücreleri açığa.
   2. Görüntü hayvanların yüksek çözünürlüklü bir bağlantılı cihaz kamera (CCD), 40X objektif veya daha yüksek, GFP filtre ve edinme yazılımı ile birlikte bir floresan mikroskop kullanarak.
   3. Aşırı doymuş görüntüleri önlemek için pozlama süresini ve aydınlatma yoğunluğunu ayarlayın.
   4. Yakalamak ve en az bir tam görünür oblik kas hücresi içeren hayvanın bir bölümünden kas (400X büyütme) görüntüleri kaydedin. Eksik veya odağı olmayan bölümler tek bir kas hücresi ile bölgelerden kaçının. Ayrıca aşırı anterior ve posterior bölgelerin görüntüleri hariç, ve vulva bitişik bölgeler.
      Not: hayvan tek bir görünür tam kas hücresi yoksa, yavaşça tam bir hücreyi açığa çıkarmak gibi hayvan açmak için lamel magazini kaydırın.
2. Kas hücre alanının ölçümü
   1. Fiji yazılım⁹ (sürüm 2.0.0 Bu çalışmada kullanılan) görüntü açın.
   2. Dikkatle tek bir oblik kas hücresi etrafında izlemek için Çokgen seçimi kullanın. İzleme geliştirmek için çapa nokta sürükleyerek sonunda Çokgen satırını ayarlayın.
   3. Yazılımın üst kısmındaki analiz sekmesine gidin ve seçimin alanını hesaplamak için Ölçü 'i tıklayın. Alanı ve diğer ölçümleri içeren ayrı bir sonuç tablosu gösterilecektir. Sonuçlar tablosundan alan ölçümü eksikse, analiz sekmesinin altında ölçümler Ayarla 'ya gidin ve alan kutusunun işaretlenip işaretli olmadığını kontrol edin. Benzer şekilde, gerekli olmayan diğer ölçümleri işaretini kaldırın.
   4. Dejenere/eksik bölgeye sahip kas hücreleri için, eksik bölgeyi çokgen seçim aracıyla izleyin ve Ölçü yeniden tıklayın. Hücre içinde birden çok boşluk varsa, her boşluğu ayrı olarak izleyin.
   5. Gap alanının tüm tek kas hücresine oranını hesaplayın. Yüksek oran hücre içinde büyük boşluklar nedeniyle kas dejenerasyonu daha yüksek bir ölçüde gösterir. Eğer eksik bölgeler yoksa, yaygın olarak vahşi tip hayvanlarda görüldüğü gibi, oran sıfır olarak hesaplanır.
      Not: bir kontrol olarak, kas yapısı kusurları için de görsel olarak puan ve nicel ölçümü ile sonuçları karşılaştırın. Bu özellikle, gerinim laboratuvarda ilk kez çalışılırsa yararlıdır. Fenotipik Puanlama için, filamat bütünlüğünü dayalı kusurlu ya da değil-kusurlu olarak hayvanları değerlendirmek. Örneğin, farklı filament çizgi kaybı olan hayvanlar, GFP küme, ya da yapısal arıza nedeniyle kas hücreleri içinde boşluklar, arızalı olarak puan olacaktır.
3. Miyozin fiber uzunluğunun segmentasyon ve ölçülemesi
   1. Gerekirse, önce dosyaları dönüştürün. TIF Fiji veya başka bir yazılım paketi kullanarak. TIFF dosyalarını istediğiniz konuma kaydedin.
   2. Açık ilastik¹⁰ (ücretsiz yazılım, sürüm 1.3.2 https://www.ilastik.org/indirilebilir).
   3. Bir kez ilastik, seçin piksel sınıflandırması altında Yeni Proje Oluştur . Yazılım, projenin kaydedilmesini isteyecektir. Projeyi yeniden adlandırın ve istediğiniz konuma kaydedin.
      Not: yeni bir proje yalnızca bir kez oluşturulması gerekir. Sonraki segmentasyon aynı projeyi kullanarak yapılabilir. Aynı proje ayarlarını kullanmak için en üstteki Proje sekmesine gidin ve proje dosyasına erişmek için Açık Proje 'yi tıklatın.
   4. Sol panelde 5 sekme olmalıdır (giriş verisi, özellik seçimi, eğitim, tahmin verme ve toplu Işleme). Giriş verisi sekmesinde, Yeni Ekle 'yi tıklatın ve sonra ayrı resim (ler) ekleyin . Açılır pencereyi TIFF dosyalarını içeren klasöre yönlendirin ve açılacak görüntüyü seçin.
   5. Aşağıdaki sekmede (özellik seçimi), yeşil işaretlenmiş kutularla gösterilen tüm piksel özelliklerini seçmek için Özellikler 'i tıklatın. Bu adımda piksel seçimi, sonraki adımda farklı piksel sınıflarını ayırt etmek için kullanılır.
      Not: piksel Özellik seçimi görüntü çözünürlüğüne bağlıdır. Bu nedenle, geliştiriciler tüm veya mümkün olduğunca çok sayıda özellik seçmek için öneririz, Eğer işlem gücü ve zaman izni.
   6. Aşağıdaki eğitim paneli piksellere göre farklı nesne sınıfların sınıflandırılmasına izin verir. Bu durumda, iki sınıf bireysel GFP-ifade miyosin filamin ve istenmeyen arka plan veya bulanık kenarlar vardır. İlk etikete sahip olmak için etiket Ekle 'ye tıklayın. Sınıflandırıcısı eğitim başlamak için filamat bir dizi üzerinde scrawl.
      Not: etiketi çift tıklatarak ad değişikliği (örneğin, ' Etiket 1 ' ' filament ') yeniden adlandırılmasına izin verir. Renkli kutuyu çift tıklatarak çizim ve olasılık ekranların değiştirilmesi için renkler sağlar. Boyut 61 için yükseltilebilir, ancak boya fırçası varsayılan boyutu 1 ' dir. Yanlış piksel çizilmiş, sadece çizim kaldırmak için Silgi aracını kullanın. Klavye kontrolleri (-) ve (Shift +) görüntüyü yakınlaştırmak ve uzaklaştırmak için sırasıyla kullanılabilir. Ok tuşları görüntünün etrafında gezinmek için kullanılır.
   7. İkinci bir etiket ekleyin ve arka planayeniden adlandırın. İstenmeyen arka planlar ve filamat arasındaki boşluklar üzerinde scrawl.
   8. Canlı güncellemeye tıklayın ve sınıflandırmanın yazılım tarafından doğru şekilde yapıldığını emin olun. Gerekirse daha fazla scrawls ve ince ayar eğitim ekleyin.
      Not: Bu adımda birleştirilmiş lifler ve bulanık kenarlar (gövde çizgisi gibi) için bir göz tutmak önemlidir. Ölçümlerin doğruluğunu artırmak için mümkün olduğunca burada tahmin geliştirin. Düşük kalitede görüntülerin pikselleri ayrı kızdırmak daha zordur olarak tahmin doğruluğu da görüntü çözünürlüğüne bağlıdır. Aynı zamanda isteğe bağlıdır, ancak canlı güncelleme denetiminin yanında önerilen Özellikler işlevinde filtre yöntemini çalıştırması önerilir.
   9. Eğitim Sınıflandırıcısı yeterli gerçekleştirildikten sonra tahmin verme paneline gidin. Kaynak olarak olasılıklar ile görüntü ayarlarını Dışa Aktar 'ı seçin .
   10. Aşağıdaki ayarları kullanın. Cut-out alt bölgesi x ve y işaretli ve c işaretlenmemeli. Başlangıç ve durdurma değerleri c 0 ve 1, sırasıyla olmalıdır. Tick ve dönüştürme veri türü imzasız 8-bit, Tick renormalize [min, Max] ve varsayılan değerleri kullanın. Çıkış dosyası video formatını PNG olarak değiştirin ve dosyayı ve dizini istediğiniz gibi yeniden adlandırın.
   11. Dışa aktarma ayarları penceresini kapatın ve yalnızca bölümlenmiş olan belirli bir görüntüyü dışa aktarın.
   12. Kaydedilmiş PNG görüntüsünü Fiji yazılımında açın. Görüntü siyah ve beyaz olarak görünmelidir.
   13. Varsayılan ayarları kullanarak görüntünün eşiğini ayarlayın.
   14. Çerçeve yapısı çıkarma eklentisi uygulayın (skeletonize 2D/3D, ve sonra iskelet analiz). Dal uzunluğunu içeren ayrı bir sonuç tablosu görüntülenecektir. Dal uzunluğu fiber uzunluğunu temsil eder. Sonuçlarındaki diğer veriler de Euclidean mesafesi gibi yararlı olabilir.
       Not: Bu boyutlarda fizyolojik olarak mümkün olmadığı için 0 μm veya 250 μm ' den fazla uzunlukları olan lifleri atlayın.

6. mitokondriyal morfolojisi ölçmek

Not: mitokondriyal morfolojinin ölçülmesine yönelik olarak, bu çalışmada uIs115 (pmec-17:: tagRFP)⁵ transgeni içeren BXN038⁷ gerinim PLM nöronları ve JsIs609 görselleştirmek için kullanılmıştır (PMEC-4:: MLS:: Gfp)¹¹ Özellikle PLM nöronlar içinde mitokondri görselleştirmek için. Bu çalışma senkronize 3 gün eski yetişkin solucanlar yapılmıştır, ancak başarıyla diğer yaşlarda, yanı sıra diğer dokularda gerçekleştirildi⁷.

1. PLM nöronlar içinde mitokondri floresans görüntüleme
   1. PLM nöronlar içinde mitokondri boyutunu ve şekil değişikliklerini ölçmek için, floresan transgenes kullanarak arka plan nöron ve mitokondri hem görselleştirin.
   2. PLM nöron görüntü için, 488 nm ve 552 nm optik pompalanmış yarı iletken Diode lazer ve görüntü yakalama yazılımı ile donatılmış bir Konfokal mikroskop kullanın.
   3. Görüntü Worm adımları başına 4.1.1-4.1.4 yukarıda, olmayan doygunlaştırıcı pozlama koşulları sağlanması.
   4. Tüm nöron görselleştirmek için, karo bir görüntü gerekebilir. Bunu elde etmek için, bir kutucuk tarama seçeneği ile yazılım kullanarak nöronun bir köşesinde bir marker bulun ve bırakın ve ardından ters ucunu bulun ve diğer işaretleyiciyi bırakın. Yazılım gerekli alanı yakalamak için gerekli fayans optimum sayısını hesaplayacak.
      Not: tarama süresini azaltmak Için, genellikle tek bir düzlem takip nöronların bulmak daha kolay, daha az fayans sonuçlanan.
   5. Bir Z yığınıyla döşeme taramasını çift için, döşeme taramasını başlatmadan önce alt ve üst sınırları ayarlayın ve en iyi dilim boyutunun ayarlandığından emin olun.
   6. Segmentasyon daha yüksek çözünürlüklerde (burada, 3224 x 3224 piksel çözünürlük kullanıldı) daha rafine olacak şekilde çözünürlüğü, optimize edilir emin olun.
      Not: uIs115 (pmec-17:: tagRFP) transgene, PLM 'i işaretlemek ve kamerayı başarıyla konumlandırmak için kullanıldığında, JsIs609 (pmec-4:: MLS:: Gfp) tarafından gözlenen hafif arka plan floresans nedeniyle görüntülenmesine gerek yoktur. PLM Axon içinde transgeni. Bu nedenle, tarama ve görüntüleme süresi 552 nm filtresini deneyden kaldırarak azaltılabilir.
2. SQUASSH kullanarak nesne segmentasyon
   1. Görüntü dosyalarını . tiff görüntülerine dönüştürün ve Fiji görüntüleme yazılımını kullanarak Z yığınlarından maksimum yoğunluk projeksiyonları oluşturun. Hala Hesaplamalı yükü azaltmak ve arka plan gürültüsünü azaltmak için tam nöron içeren iken minimum boyuta kırpma görüntüleri.
      Not: temsili sonuçlar Için, uzun akal süreçler içinde sadece mitokondri kabul edildi, bu nedenle hücre gövdesi ve içinde herhangi bir mitokondri her görüntü dışlandı.
   2. Imagej için Mosaic Suite squassh makrosunu kullanarak, maksimum projeksiyonlara bölünmüş Bregman segmentasyon¹² gerçekleştirin. Bu makroda kurulum ve uygulama için ayrıntılı bir kılavuz Mozaik web sitesinde (http://mosaic.mpi-cbg.de/) ve Rizk ve ark. 2014¹³tarafından tarif edilebilir. Görüntü segmentasyon süreci kısa aşağıda açıklanmıştır.
      Not: Bu segmentasyon nesneleri tanımlar (Bu durumda bireysel mitokondrion) Floresan yoğunluğu bir eşik üzerinden, her bir nesne boyutu ve şekli doğru ölçmek için izin.
   3. Kullanıcı tanımlı pencerenin görüntü üzerinde hareket ettiği Rolling Ball yöntemini kullanarak bir görüntüden arka plan gürültüsünü kaldırın, her penceredeki en sık görülen yoğunluğun yerel arka plan yoğunluğu tahminini Tanrı. Bu, düzensiz arka plan yoğunlukları düzeltir.
   4. Floresan şiddetine ve piksel sayısına bağlı olarak, ilgi, nesnelerin (mitokondri) içeren bölgeleri kabaca bulmak için nesne algılaması kullanın. Bu adımı yöneten parametreler regularization ve minimum nesne yoğunluğuyla aynıdır.
      Not: düzensizliği küçük yoğunluğu, gürültü kaynaklı zirveleri segmentleme önlemek için kullanılır ve minimum nesne yoğunluğu eşik arka plan doku floresans gelen hücre altı organelleri tanımlamak için yardımcı olur. Bu mitokondri optimum segmentasyon bulmak için manipüle edilen ana iki parametre, ve optimizasyon süreci test görüntü için farklı parametrelerin deneme ve hata olma eğilimindedir, manuel muayene izledi.
   5. En iyi segmentasyon hesaplaması yardımcı olmak için her nesne çevresindeki yerel arka plan yoğunlukları tahmin etmek için yazılımı kullanın.
   6. Boyut, çevre, piksel numarası ile uzunluk, hem de görüntü üzerinde sinyal yoğunluğu ve x/y konumu için bireysel nesneleri ölçün. Boyuttaki ölçümleri (Nm) hesaplamak için, orijinal görüntünün piksel boyutunda faktör.
      Not: her deneme Için, en iyi parametrelerin ilk hesaplanması gerekir. Segmentasyon doğruluğunu sağlamak için, bir test görüntüsünde bir SQUASSH analizi gerçekleştirmek ve segmentasyon doğruluğunu el ile incelemek için tavsiye edilir. Makro, özgün görüntüde tanımlanan bireysel nesneleri gösteren çıktı dosyaları sağlar ve bu yakından incelemek ve uygun parametreleri ayarlamak doğru bir segmentasyon sağlayacaktır. Tanımlı parametreler daha sonra tüm deneme için karşılaştırılabilir kullanılmalıdır. Temsili sonuçlar için kullanılan parametreler Tablo 2' de yer alır.
   7. Fiji veya ımagej analiz yazılımını açın, Mosaic makro kapsayıcısına gidin ve SQUASSH menüsünü açın.
      1. Arka plan çıkarma alt menüsünü açın ve arka plan kaldırma emin olun? işaretli. Pencere boyutu için varsayılan değer 10 ' dır.
      2. Nesneleri en iyi tanımlamak ve segmentlere ayırmak için istenen regularization ve Minimum nesne yoğunluğunu, Kanal 1 değerlerini ayarlayın (bkz. Adım 6.2.4). Kanal 2 değerleri tek bir transgene ile işaretlenmiş nesneler için gerekli değildir.
      3. Mikroskop özelliklerine göre nokta yayılma fonksiyonunu tahmin etmek için objektif özelliklerinden tahmin PSF 'yi tıklayın. Bu, komşu pikseldeki her pikselin etkisi için muhasebe tarafından yakından bulunan nesnelerin segmentasyonunu sağlar.
         Not: alt piksel segmentasyon , bu denemede bilgisayar işleme gücünün artan yükü nedeniyle kullanılmadı. Akon kolayca tanımlandığından hücre maskeleri de kullanılmaz. Bu ayarlar daha karmaşık dokular için yararlıdır ve hücreler hücre temelinde nesneleri tanımlamak için.
      4. Görselleştirme seçenekleri için nesne anahatlarını emin olun ve nesne ve görüntü özelliklerini kaydet denetlenir. Grafik ve istatistiksel yazılım daha sonra kullanmak için, koşulların doğru sayıda giriş olduğundan emin olun.
   8. . Tiff görüntüleri ile klasörü bulun ve makroyu çalıştırın. Bu işlem, tek bir görüntüde veya bir klasör içinde bulunan genotip başına bir resim toplu işlemi üzerinde gerçekleştirilebilir. Çıktı dosyaları orijinal görüntülerle birlikte klasörde yer alacak.
3. Şekil Analizi ve ölçümleri
   1. Yukarıda açıklandığı gibi ölçümleri de dahil olmak üzere satır başına her bir nesne sağlayan bir dökümü nesne Data . csv dosyası sağlamak için squassh çıktısını kullanın.
      Not: Bu makro işlemi nesne ölçümleri otomatikleştirir, ancak makro doğru mitokondri tanımlandığından emin olmak için SQUASSH segmentasyon sonra çıktı görüntüleri el ile denetlemek için her zaman önemlidir.
   2. Her mitokondri şeklini analiz etmek için, objenin mükemmel bir çemberden sapmasını tahmin etmek için iki boyutlu bir ölçü kullanın.
      Not: döngü alanı ve çevre (circularity = (4 x π) x (alan/çevre²) bir işlevdir nerede 1 = mükemmel bir daire ve 0 = düz bir çizgi. Bu grafik ve istatistiksel yazılım bir formül kullanılarak elde edilebilir.
   3. Mitokondri havuzu boyunca boyut ve şeklin farkını belirlemek için, grafik ve istatistiksel yazılımları kullanarak histogramları ve donatılmış bir Gauss dağıtımını hesaplayın, mitokondriyal boyut için 0,2 μm ve mitokondriyal döngü için 0,05.

Sonuçlar

C. elegans basitliği, bilinen hücre sırtı, şeffaflık ve mevcut araçlar nedeniyle farklı dokuların ve organellerin morfolojisi okumak için ideal bir model organizmadır. Burada, canlı floresan görüntüleme ve ücretsiz biyo-görüntü işleme yazılımı kullanarak sinaps ve kaslar dahil olmak üzere organeliler (örneğin mitokondri) ve dokularda eğitim için nicel yaklaşımlar sağlıyoruz.

Norma...

Tartışmalar

Morfolojik varyasyonlar sıklıkla fark edilen farklılıklar el ile sayma veya vahşi tip fenotüre kıyasla kusurları belirlemek için rasgele eşikleri kullanarak değerlendirilir. Daha yakın zamanda, ancak, niceliksel Yöntemler, tarafsız bir şekilde hücresel ve subhücresel düzeyde değişiklikleri doğru ölçmek ve açıklamak için morfolojinin karşılaştırmalı çalışmaları için kullanılmıştır. Fenotürleri arasında ince henüz biyolojik olarak alakalı farklar tanımlamak için yeteneği çevr...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar-agar	Merck	1.01614.1000
Agarose	Invitrogen	16500-500
Confocal microscope	Leica	TCS SP8	Inverted platform
Fluorescence microscope	Carl Zeiss AG	Zeiss Axio Imager M2
Glass coverslips #1	Thermo scientifique	MENCS22221GP
Glass coverslips #1.5	Zeiss	474030-9000-000	Made by SCHOTT
Glass slides	Thermo scientifique	MENS41104A/40
Light LED	Schott	KL 300 LED
Stereo Microscope	Olympus	SZ51
Tryptone (Peptone from casein)	Merck	107213	Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium
Yeast Extract	Merck	103753	Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium
Sodium chloride	Merck	106404	Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium
Peptone (Peptone from meat)	Merck	107214	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Agar	Sigma	A1296	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Sodium chloride	Merck	106404	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Cholesterol	Sigma	C8667-25G	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Calcium chloride	Merck	102382	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Magnesium sulfate	Merck	105886	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Dipotassium phosphate	Merck	105101	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Potassium dihydrogen phosphate	Merck	104873	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Disodium phosphate	Merck	106586	Ingredients for M9 buffer
Sodium chloride	Merck	106404	Ingredients for M9 buffer
Potassium dihydrogen phosphate	Merck	104873	Ingredients for M9 buffer
Magnesium sulfate	Merck	105886	Ingredients for M9 buffer
Pasteur pipette	Corning	CLS7095D5X-200EA
Petri dishes	Corning	CLS430589-500EA
Platinum wire	Sigma	267201-2G
Spatula	Met-app	2616
Tetramisole hydrochloride	Sigma	L9756-5G