Quantitative Ansätze zur Untersuchung zellulärer Strukturen und Organelle Morphologie in Caenorhabditis elegans

Zusammenfassung

Diese Studie skizziert quantitative Messungen der synaptischen Größe und Lokalisation, Muskelmorphologie und mitochondrialen Form in C. elegans mit frei verfügbaren Bildverarbeitungswerkzeugen. Dieser Ansatz ermöglicht es zukünftigen Studien in C. elegans, das Ausmaß der strukturellen Veränderungen von Gewebe und Organellen infolge genetischer Mutationen quantitativ zu vergleichen.

Zusammenfassung

Die Definition der zellulären Mechanismen, die der Krankheit zugrunde liegen, ist für die Entwicklung neuartiger Therapeutika von entscheidender Bedeutung. Eine Strategie, die häufig verwendet wird, um diese Mechanismen zu entwirren, besteht darin, Mutationen in Kandidatengenen einzuführen und Veränderungen in der Morphologie von Geweben und Zellorganellen qualitativ zu beschreiben. Qualitative Beschreibungen erfassen jedoch möglicherweise keine subtilen phänotiischen Unterschiede, können phänotypische Unterschiede zwischen Individuen in einer Population falsch darstellen und werden häufig subjektiv bewertet. Hier werden quantitative Ansätze beschrieben, um die Morphologie von Geweben und Organellen in der Nematode Caenorhabditis elegans mittels Laserscanning konfokale Mikroskopie in Kombination mit kommerziell erhältlicher Biobildverarbeitungssoftware zu untersuchen. Eine quantitative Analyse von Phänotypen, die die Synapsenintegrität (Größe und integrierte Fluoreszenzniveaus), die Muskelentwicklung (Muskelzellgröße und Myosin-Filamentlänge) und die mitochondriale Morphologie (Zirkularität und Größe) beeinflussen, wurde durchgeführt, um die Auswirkungen genetischer Mutationen auf diese zellulären Strukturen. Diese quantitativen Ansätze beschränken sich nicht auf die hier beschriebenen Anwendungen, da sie leicht zur quantitativen Bewertung der Morphologie anderer Gewebe und Organellen im Nematoden sowie in anderen Modellorganismen verwendet werden könnten.

Einleitung

Die Nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) wird zunehmend als Modellsystem genutzt, um die biologischen und molekularen Prozesse aufzudecken, die an menschlichen Krankheiten beteiligt sind. Ein erwachsener Nematode hat eine Körperlänge von etwas mehr als 1 mm und kann eine große Brut von bis zu 300 Eiern¹produzieren. Nach dem Schlüpfen benötigen C. elegans nur 3-4 Tage, um das Erwachsenenalter zu erreichen, und leben für etwa 2 bis 3 Wochen². Aufgrund seiner einfachen Kultivierung ist C. elegans derzeit eines der begehrtesten In-vivo-Tiermodelle für die Durchführung kostengünstiger, schneller Arzneimittelscreenings zur Identifizierung von Therapeutika für menschliche Krankheiten. Darüber hinaus machen seine genetische Konservierung, gut definierte Verhaltensparadigmen, transparenter Körper für Fluoreszenz oder Lichtmikroskopie und die Leichtigkeit der genetischen Manipulation das Studium zellulärer und molekularer Folgen genetischer Mutationen leicht erreichbar. ³. Das Genom von C. elegans teilt etwa 60-80% Orthologie mit menschlichen Genen, und etwa 40% dieser Gene sind als krankheitsbedingt bekannt. Einige der menschlichen Krankheiten, die in C. elegans modelliert und untersucht wurden, sind neurodegenerative Erkrankungen (Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, amyotrophe Lateralsklerose, Charcot-Marie-Tooth-Krankheit), muskelassoziierte Erkrankungen ( Duchenne-Muskeldystrophie) und Stoffwechselerkrankungen (Hyperglykämie)^2,4. Bei den meisten menschlichen Störungen treten krankheitsinduzierte Zell- und Organellenlokalisierung und morphologische Veränderungen auf, die leicht im Nematodenmodell bewertet werden können.

Fluoreszierende Marker wurden häufig verwendet, um Gewebe und Organellen für die dynamische Visualisierung unter dem Mikroskop zu kennzeichnen. In C. elegansstützten sich konventionelle Methoden, die morphologische Unregelmäßigkeiten aufgrund genetischer Mutationen bewerten, jedoch weitgehend auf visuelle Beschreibungen. Während qualitative Bewertungen breitere Bereiche phänotypischer Beschreibungen abdecken können (synaptische Morphologie, GFP-Verklumpung, spezifische axonale Form, Muskelfaserdicke usw.) und eine Vogelperspektive auf die morphologischen Veränderungen bieten, eignen sie sich weniger gut für Vergleich kleiner Variationen zwischen verschiedenen Gruppen. Darüber hinaus basieren qualitative Bewertungen auf einer visuellen, subjektiven Bewertung, die zu einer Über- oder Unterschätzung morphologischer Anomalien führen kann. Schließlich können qualitative Beobachtungen auch zwischen Individuen sehr unterschiedlich sein, was zu Schwierigkeiten bei der Datenreplikation führt.

In den letzten Jahren wurden eine Reihe benutzerfreundlicher, leicht verfügbarer Rechenalgorithmen entwickelt, die Bilder quantitativ analysieren können. Allerdings ist die Verwendung solcher Bildanalyse-Software für einige morphologische Studien, insbesondere in Bezug auf Körperwandmuskeln und Mitochondrien, in C. elegans Forschung hinkt hinterher. Zur Verbesserung der zugrunde liegenden Strukturanalyse in C. eleganswurden einige der leicht verfügbaren Open-Source-Bildanalyse-Software erprobungsmittelmäßig untersucht, um die Auswirkungen genetischer Mutationen auf Muskelmitochondrien, Körperwandmuskel und Synaptikum quantitativ zu vergleichen. morphologie. Diese experimentellen Verfahren beschreiben im Detail, wie diese Programme (Fiji, ilastik, CellProfiler, SQUASSH) verwendet werden können, um Veränderungen der synaptischen Größe und synaptischen Proteinlokalisierung, Körperwandmuskelbereich und Faserlänge sowie mitochondriale Größe und Zirkularität als Folge genetischer Mutationen im Nematode.

Protokoll

1. Wachstum und Aufrechterhaltung von C. elegans-Stämmen

1. Seed Nematode Growth Medium (NGM, siehe Tabelle der Materialien) Agarplatten mit 300 l des langsam wachsenden E. coli-Stamms OP50 in einem laminaren Strömungsschrank.
2. Lassen Sie die NGM Agarplatten im laminaren Strömungsschrank trocknen.
   HINWEIS: In Ermangelung eines laminaren Strömungsschranks können Platten auf der Bank trocknen gelassen werden, aber sie sind anfälliger für Verunreinigungen.
3. Überträgt mindestens 20 Tiere auf jedes der beiden OP50-samen NGM-Agarplatten, um Arbeitsbestände zu haben. Es gibt zwei Hauptwege, um Tiere zu übertragen.
   1. Kommissionieren: Heben Sie die Tiere vorsichtig mit einem wärmesterilisierten Pick. Diese Methode ist wirksam, um einzelne oder mehrere Tiere aus einer Agarplatte auszuwählen. Ein kleiner Kratzer von Bakterien an der Spitze beim Pflücken hilft bei der Übertragung.
      HINWEIS: Ein Pick besteht aus einem kleinen Stück Platindraht, das etwa 4 cm lang ist und in eine Glaspipette eingebettet ist, wobei die Drahtspitze abgeflacht ist, um "spear-like" zu sein. Wärmesterilisieren Sie die Kommissionierung zwischen der Kommissionierung, um Kreuzkontamination zu verhindern.
   2. Chunking: Mit einem sterilisierten Spachtel ein kleines Quadrat Agar mit den Tieren von einer Platte schneiden und auf den Kopf auf eine neue Platte übertragen.
      HINWEISE: Diese Methode ist im Allgemeinen nützlich, um eine große Anzahl von Würmern zu übertragen und Die Kontamination von Platten durch mehrere Runden von nicht kontaminiertem Agar zu entfernen. Vermeiden Sie Kreuzkontamination, indem Sie den Spachtel für ein paar Sekunden entzünden und den Spachtel zwischen den Transfers in 100% Ethanol eintauchen. Die Übertragung von ausgehungerten Platten wird nicht empfohlen, da Hunger und Überbelegung die Gesundheit und Morphologie zellulärer und subzellulärer Strukturen beeinflussen können.
4. Halten Sie die Würmer bei Standardwachstumstemperatur (20 °C). Um eine kontinuierliche Versorgung mit gut gefütterten Würmern zu gewährleisten, übertragen Sie die Würmer alle 2 bis 3 Tage auf neue OP50-Saatplatten.

2. Alterssynchronisierung C. elegans

1. Pflegen Sie die Würmer auf 3-4 NGM-Platten, bis die Population überfüllt, aber nicht verhungert ist.
2. Waschen Sie die Würmer vorsichtig von der NGM-Platte mit M9-Lösung. Die Eier bleiben auf dem Teller, da sie am E. coli OP50kleben. Wiederholen Sie dies mit vier zusätzlichen Waschschritten, um alle geschlüpften Tiere zu entfernen.
3. Lassen Sie die Würmer für 40 min schlüpfen.
4. Fügen Sie 1-2 ml M9-Lösung auf die Platte und wirbeln Sie sanft, um kürzlich geschlüpfte Würmer zu lösen.
5. Sammeln Sie die M9-Lösung mit kürzlich geborenen Würmern und übertragen Sie die Lösung mit Würmern auf eine frische NGM-Platte.
6. Lassen Sie die M9-Lösung verdampfen, indem Sie die NGM-Platte der Luft aussetzen. Tun Sie dies neben einer offenen Flamme, um eine Kontamination der NGM-Platte zu vermeiden.
7. Die Würmer 27 h bei 20 °C anbauen, um die Entwicklung in die dritte Larvenstufe (L3) zu ermöglichen. Für synchronisierte 3 Tage alte erwachsene Tiere werden die Würmer im Larvenstadium 4 gepflückt und für weitere 3 Tage angebaut, um das 3 Tage alte Erwachsenenstadium zu erreichen.

3. Vorbereitung von Dias für die Bildgebung

1. Bereiten Sie 3-4% w/v Agarose-Lager in einer Mikrowellen-sicheren Flasche (3-4 g in 100 ml Reinstwasser) vor.
   HINWEIS: Agar kann anstelle von Agarose bei gleicher Konzentration verwendet werden.
2. Die Agarose vorsichtig in einer Mikrowelle schmelzen und darauf achten, nicht zu überkochen, bis sich alle Agarose auflöst (klare Lösung). Halten Sie die Lösung bei 70 °C, um eine Erstarrung zu verhindern.
   HINWEIS: Agarose-Lager kann mehrmals verwendet werden. Vor Gebrauch aufwärmen, wenn sich die Agarose verfestigt hat.
3. Mit einer Pasteur-Pipette einen Tropfen geschmolzener Agarose auf ein Mikroskopschlitten legen.
   HINWEIS: Vermeiden Sie Luftblasen im Abwurf des Agars, da diese die Integrität des Pads stören.
4. Drücken Sie sofort das Agarose-Tröpfchen mit einem anderen Mikroskopschlitten nach unten, wobei Sie die Agarose sanft in ein Pad zwischen den beiden Dias abflachen.
   HINWEIS: Alle übrig gebliebenen Blasen sollten in dieser Phase entfernt werden. Wenn nicht, sollten neue Rutschen gemacht werden, da Tiere leicht in den Blasen stecken bleiben können. Vermeiden Sie einen Überlauf des Agars zur Seite, wenn Sie auf die Rutsche drücken.
5. Lassen Sie die Agarose 1 min trocknen.
6. Trennen Sie die beiden Dias sorgfältig, um Schäden an der Agarose zu vermeiden, während Sie das erstarrte Pad auf einer der Dias lassen.
   HINWEIS: Dias mit Agarose-Pads sollten immer kurz vor dem Experiment frisch zubereitet werden, da sie austrocknen können. Stellen Sie sicher, dass das Agarose-Pad eine gleichbleibende Dicke aufweist. Es sollte keine Luftblasen oder Risse im Pad geben, da dies die Bildgebung stören kann.
7. Fügen Sie einen kleinen Tropfen (5-10 l) von 0,05% Tetramisolehydrochlorid (Anästhetika) in die Mitte des Agarose-Pads.
8. Mit wärmesterilisierter Pickung schnell ca. 10 – 15 Tiere von der Stockplatte auf das Anästhetikum tröpft, bevor die Lösung austrocknet. Vermeiden Sie die Übertragung zu viel OP50-Bakterien, da dies die Lösung trüb macht, was die Bildgebung stören kann.
   HINWEIS: Wenn die Anästhesielösung während der Kommissionierung austrocknet, pipette einfach einen zweiten Tropfen von 0,05% Tetramisolehydrochlorid auf die Tiere. Die Tiere neigen dazu, auf ihrer Seitlichen Seite in der Anästhesielösung zu liegen.
9. Tragen Sie einen Coverslip auf, indem Sie ihn direkt über dem Agarose-Pad positionieren und sanft nach unten fallen lassen. Dies verhindert die Bildung von Blasen. Setzen Sie den Deckel nicht unter Druck, da dies die Tiere zerquetschen kann.
10. Beschriften Sie die Folien mit dem Dehnungsnamen.

4. Bewertung der synaptischen Morphologie

HINWEIS: Die Auswirkungen der MEC-17-Überexpression auf die Synapsenintegrität in den hinteren lateralen Mikrotubuli (PLM)-Touchrezeptor-Neuronen wurden untersucht, indem die synaptische Größe und Lokalisierung mittels Konfokalmikroskopie für das Linienscannen quantifiziert wurde. Die PLM-Neuronen (einschließlich der synaptischen Regionen) wurden mit dem transgenen uIs115(Pmec-17::tagRFP) (Stamm: TU4065⁵) visualisiert und der synaptische Bereich wurde speziell mit jsIs37(Pmec-7::snb-1::GFP) (Stamm: NM664) gekennzeichnet. ⁶) . Diese Studie wurde bei synchronisierten L3-nicht-transgenen und transgenen Tieren des extrachromosomalen MEC-17-Überexpressionsstamms BXN507 [cjnEx036(Pmec-4::mec-17, Pmyo-2::mCherry); jsIs37; uIs115]⁷durchgeführt. Eine vollständige Liste der in dieser Studie verwendeten Stämme ist in Tabelle 1enthalten.

1. Konfokale Bildgebung von Touch-Rezeptor-Neuronen-Synapsen
   1. Um die synaptischen Bereiche abzubilden, verwenden Sie ein Zeilenraster-Konfokalmikroskop, das an einen 488 nm und 552 nm optisch gepumpten Halbleiterdiodenlaser gekoppelt und mit Bildaufnahmesoftware ausgestattet ist.
   2. Suchen Sie die Würmer mit der niedrigsten Vergrößerung.
   3. Wenn die Tiere erfolgreich aufgestellt sind, wechseln Sie auf eine 40X Vergrößerung und wenden Sie Tauchmittel auf (in dieser Studie wurde ein 40X/1.10 HC PL APO CS2 Multi-Immersive Objektiv mit Wassereintauchen verwendet).
   4. Visualisieren Sie die synaptische Region, indem Sie die Fluorophore mit einem 488 nm Laser (2% Leistung) für das GFP-Fluorophor und 552 nm (1% Leistung) für das TagRFP-Fluorophor begeistern.
   5. Bestimmen Sie den optimalen x- und y-Frame, um den gesamten synaptischen Bereich zu erfassen. Achten Sie bei der Auswahl des Rahmens darauf, die optimale Pixelgröße zu berücksichtigen. In dieser Studie wurde eine konsistente Pixelgröße von 56 nm ermittelt.
   6. Erfassen Sie Bilder mit einem hybriden Fotodetektor und stellen Sie die Gewinne ein, um eine Überbelichtung der Fluorophore zu verhindern (100% für 488 nm Anregung und 15% für 552 nm Anregung).
   7. Sammeln Sie Z-Stack-Bilder, um die gesamte Synapse abzudecken, mit der optimalen Z-Schritt-Größe, abhängig von dem spezifischen Ziel verwendet. In dieser Studie wurde eine optimale Z-Schrittgröße von 0,211 nm verwendet.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Bilder unter strengen Bedingungen aufgenommen werden, um eine integrierte Fluoreszenzquantifizierung und -vergleich zu ermöglichen. Dies kann durch die Identische Mikroskopieparameter für alle aufgenommenen Bilder (z. B. Laser- und Detektoreinstellungen, Pixelgröße, Scangeschwindigkeit und optimale Z-Schritt-Größe) erfolgen. Optimale Einstellungen hängen vom Objektiv ab und können mit zugänglichen Bioinformatik-Programmen wie dem Nyquist-Rechner (https://svi.nl/NyquistCalculator berechnet werden. Label-Bilder systematisch, wird dies nützlich sein, wenn Bioinformatik-Software verwendet wird, die Dateien auf der Grundlage des Dateinamens organisiert und verarbeitet.
2. Quantifizierung der synaptischen Region
   1. Um den synaptischen Bereich zu analysieren, exportieren Sie Bilder als TIFF-Dateien. Java-basierte Bildverarbeitungssoftware wie ImageJ kann verwendet werden (in dieser Studie wurde das MRT-Bildkonvertierungsmakro in ImageJ verwendet).
   2. Die Größe und die integrierte Fluoreszenzintensität der Synapsen wurden anhand der Summenintensität der erhaltenen Z-Stacks mit CellProfiler-3.1.5 gemessen. Laden Sie die Bilder in die CellProfiler3.1.5-Software. Bei Bedarf können Bilder basierend auf Bilddateinamen gefiltert werden.
   3. Richten Sie das Modul Name und Typ ein. Extrahieren Sie optional die Metadaten aus der Bildbeschriftung, um berechnete Daten entsprechend zu organisieren.
   4. Bestimmen Sie die synaptische Region durch Handdefinition dieser Region mithilfe des diffusen tagRFP, ausgedrückt aus dem transgen uIs115 (Pmec-17::tagRFP). Dies kann durch Hinzufügen des Bezugsmoduls zur CellProfiler-3.1.5-Pipeline erfolgen.
   5. Um die Größe und Fluoreszenz der handdefinierten Synapse zu messen, fügen Sie der Pipeline das Modul Objektgröße und -form messen und das Objektintensitätsmodul messen hinzu.
   6. Berechnen Sie die relative integrierte Fluoreszenzintensität, indem Sie das Modul Math berechnen hinzufügen. Teilen Sie die aus jsIs37(Pmec-7::snb-1::GFP) erhaltenen integrierten Intensitätseinheiten durch die integrierten Einheiten, die für uIs115 (Pmec-17::tagRFP)erhalten wurden.
   7. Exportieren von Messungen und Berechnungen.

5. Quantifizierung der Körperwandmuskelstruktur

1. Fluoreszenzbildgebung der Körperwandmuskelstruktur
   1. Erhalten Sie einen Stamm (z. B. RW1596), der das Transgen stEx30 (Pmyo-3::gfp::myo-3 + rol-6(su1006))⁸trägt, der Myosinfasern mit GFP kennzeichnet.
      HINWEIS: Die Einführung des Transgens in Tiere kann erreicht werden, indem entweder ein Voninteressemitstamm mit Tieren, die bereits das Transgen ausdrücken, oder mikroinjiziert DNA in den distalen Arm des Gonaden. Der durch die Rol-6-Mutation in diesem Transgen induzierte "rollende" Phänotyp erleichtert die Visualisierung der Muskeln. Die Körperwandmuskeln verlaufen entlang der rückenförmigen und ventralen Seiten, die normalerweise von der Sicht bei Wildtieren ausgeschlossen sind, weil sie in der Regel auf einer ihrer Seiten liegen. Das Rol-6(su1006) Allel induziert eine Verdrehung der Tiere und setzt so einige Muskelzellen für die Bildgebung frei.
   2. Stellen Sie die Tiere mit einem Fluoreszenzmikroskop in Verbindung mit einer hochauflösenden charged gekoppelten Gerätekamera (CCD), 40X objektiv oder höher, GFP-Filter- und Erfassungssoftware auf.
   3. Passen Sie die Belichtungszeit und Die Beleuchtungsstärke an, um übersättigte Bilder zu vermeiden.
   4. Erfassen und speichern Sie Bilder von Muskeln (400X Vergrößerung) von einem Abschnitt des Tieres, der mindestens eine vollständig sichtbare schräge Muskelzelle enthält. Vermeiden Sie Regionen mit einer einzelnen Muskelzelle, die unvollständig ist, oder Abschnitte, die nicht im Fokus stehen. Schließen Sie auch Bilder aus extremen vorderen und hinteren Regionen und Regionen aus, die an die Vulva angrenzen.
      HINWEIS: Wenn das Tier keine einzige sichtbare vollständige Muskelzelle hat, schieben Sie vorsichtig den Coverslip, um das Tier zu drehen, um eine vollständige Zelle freizulegen.
2. Messung des Muskelzellbereichs
   1. Öffnen Sie das Bild in Fidschi-Software⁹ (Version 2.0.0 wurde in dieser Studie verwendet).
   2. Verwenden Sie die Polygonauswahl, um eine einzelne schräge Muskelzelle sorgfältig nachzuverfolgen. Passen Sie die Linie des Polygons am Ende an, indem Sie den Ankerpunkt ziehen, um die Ablaufverfolgung zu verbessern.
   3. Wechseln Sie oben in der Software zur Registerkarte Analysieren, und klicken Sie auf Messen, um den Bereich der Auswahl zu berechnen. Eine separate Ergebnistabelle mit dem Bereich und anderen Messungen wird angezeigt. Wenn die Flächenmessung in der Ergebnistabelle fehlt, gehen Sie unter der Registerkarte Analysieren zu Messungen festlegen, und überprüfen Sie, ob das Bereichsfeld angekreuzt ist. Deaktivieren Sie auch andere Messungen, die nicht benötigt werden.
   4. Verfolgen Sie bei Muskelzellen mit einem degenerierten/fehlenden Bereich den fehlenden Bereich mit dem Polygonauswahlwerkzeug, und klicken Sie erneut auf Messen. Wenn sich mehrere Lücken innerhalb der Zelle befinden, verfolgen Sie jede Lücke separat.
   5. Berechnen Sie das Verhältnis der Lückenfläche zur gesamten Einzelmuskelzelle. Ein hohes Verhältnis deutet auf ein höheres Ausmaß der Muskeldegeneration aufgrund großer Lücken in der Zelle hin. Wenn keine Regionen fehlen, wie sie bei Wildtieren häufig zu beobachten sind, würde das Verhältnis als Null berechnet.
      HINWEIS: Als Kontrolle, Punkten Sie auch für Muskelstrukturdefekte visuell und vergleichen Sie die Ergebnisse mit der quantitativen Messung. Dies ist besonders nützlich, wenn die Sorte zum ersten Mal im Labor untersucht wird. Bewerten Sie die Tiere bei der phänotischen Bewertung aufgrund der Integrität der Filamente als defekt oder nicht fehlerhaft. Beispielsweise würden Tiere mit verlustbaren Filamentstorten, GFP-Klumpen oder Lücken in Muskelzellen aufgrund struktureller Ausfälle als defekt bewertet.
3. Segmentierung und Quantifizierung der Myosinfaserlänge
   1. Konvertieren Sie ggf. zuerst Dateien in . mit Fidschi oder einem anderen Softwarepaket. Speichern Sie die TIFF-Dateien an einem gewünschten Speicherort.
   2. Open ilastik¹⁰ (freie Software, Version 1.3.2 kann von https://www.ilastik.org/ heruntergeladen werden).
   3. Sobald Sie in ilastik sind, wählen Sie Pixelklassifizierung unter Neues Projekt erstellen . Die Software fordert das Speichern des Projekts auf. Benennen Sie das Projekt um, und speichern Sie es an einem gewünschten Speicherort.
      HINWEIS: Ein neues Projekt muss nur einmal erstellt werden. Nachfolgende Segmentierung kann mit demselben Projekt durchgeführt werden. Um dieselben Projekteinstellungen zu verwenden, wechseln Sie oben auf die Registerkarte Projekt, und klicken Sie auf Projekt öffnen, um auf die Projektdatei zuzugreifen.
   4. Es sollten 5 Registerkarten auf dem linken Bereich vorhanden sein (Eingabedaten, Feature-Auswahl, Schulung, Vorhersageexport und Batch-Verarbeitung). Klicken Sie auf der Registerkarte Eingabedaten auf Neu hinzufügen und dann separate Bilder hinzufügen. Leiten Sie das Popupfenster in den Ordner mit den TIFF-Dateien, und wählen Sie das zu öffnende Bild aus.
   5. Klicken Sie auf der nächsten Registerkarte unten (Feature-Auswahl ) auf Features auswählen, um alle Pixel-Features auszuwählen, die durch grüne Kontrollkästchen angezeigt werden. Die Pixelauswahl in diesem Schritt wird verwendet, um die verschiedenen Pixelklassen im nächsten Schritt zu unterscheiden.
      HINWEIS: Die Auswahl der Pixel-Features hängt von der Bildauflösung ab. Daher schlagen die Entwickler vor, alle oder so viele Funktionen wie möglich auszuwählen, wenn die Rechenleistung und die Zeit es zulassen.
   6. Das folgende Trainingsbedienfeld ermöglicht die Klassifizierung verschiedener Objektklassen basierend auf Pixeln. In diesem Fall sind die beiden Klassen die einzelnen GFP-exemitenden Myosinfilamente und unerwünschten Hintergrund oder verschwommene Kanten. Klicken Sie auf Label hinzufügen, um das erste Etikett zu erhalten. Scrawl über eine Reihe von Filamenten, um Klassifier-Training zu beginnen.
      HINWEIS: Ein Doppelklick auf die Bezeichnung ermöglicht eine Namensänderung (z. B. Umbenennung von 'Label 1' in 'filament'). Durch Doppelklicken auf das farbige Feld können Farben für Zeichnungs- und Wahrscheinlichkeitsanzeigen geändert werden. Die Standardgröße des Pinsels ist 1, obwohl die Größe auf 61 erhöht werden kann. Wenn das falsche Pixel gezeichnet wurde, verwenden Sie einfach das Werkzeug des Löschens, um die Zeichnung zu entfernen. Tastatursteuerungen (-) und (Shift +) können zum Vergrößern bzw. Verkleinern des Bildes verwendet werden. Pfeiltasten werden verwendet, um durch das Bild zu navigieren.
   7. Fügen Sie eine zweite Bezeichnung hinzu, und benennen Sie sie in Backgroundum. Kriechen über unerwünschte Hintergründe und Räume zwischen den Filamenten.
   8. Klicken Sie auf Live Update und stellen Sie sicher, dass die Klassifizierung durch die Software korrekt durchgeführt wurde. Fügen Sie weitere Crawls hinzu und stimmen Sie das Training bei Bedarf fein abstimmen.
      HINWEIS: Es ist wichtig, in diesem Schritt auf zusammengeführte Fasern und verschwommene Kanten (z. B. Körperlinie) zu achten. Verbessern Sie hier die Vorhersage so weit wie möglich, um die Genauigkeit der Messungen zu erhöhen. Die Vorhersagegenauigkeit hängt auch von der Bildauflösung ab, da Pixel in Bildern niedriger Qualität schwieriger auseinander zu necken sind. Es ist auch optional, wird jedoch empfohlen, die Filtermethode in der Funktion Features vorschlagen neben dem Live Update-Steuerelement auszuführen.
   9. Sobald der Trainingsklassifier angemessen durchgeführt wurde, gehen Sie zum Vorhersageexport-Bedienfeld. Klicken Sie auf Bildeinstellungen exportieren mit Wahrscheinlichkeiten als Quelle auswählen.
   10. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen. Ausschnitt-Subregion x und y angekreuzt und c unticked. Die Start- und Stoppwerte für c sollten 0 bzw. 1 sein. Markieren und konvertieren Sie den Datentyp in Transformationen in nicht signierte 8-Bit, ticken Sie neu [min, max] und verwenden Sie die Standardwerte. Ändern Sie das Format des Ausgabedateivideos in PNG, und benennen Sie die Datei und das Verzeichnis nach Belieben um.
   11. Schließen Sie das Fenster mit den Exporteinstellungen, und exportieren Sie das bestimmte Bild, das gerade segmentiert wurde.
   12. Öffnen Sie das gespeicherte PNG-Image in der Fidschi-Software. Das Bild sollte in Schwarzweiß angezeigt werden.
   13. Passen Sie den Schwellenwert des Bildes mit den Standardeinstellungen an.
   14. Wenden Sie das Skelettierungs-Plugin an (Skeletonize 2D/3D, und analysieren Sie dann Skelett). Es wird eine separate Ergebnistabelle angezeigt, die die Verzweigungslänge enthält. Die Verzweigungslänge stellt die Faserlänge dar. Andere Daten in den Ergebnissen könnten ebenfalls nützlich sein, z. B. euklidische Entfernung.
       ANMERKUNG: Lassen Sie Fasern mit Längen von 0 m oder mehr als 250 m aus, da diese Größen physiologisch nicht möglich sind.

6. Quantifizierung der mitochondrialen Morphologie

ANMERKUNG: Für die Quantifizierung der mitochondrialen Morphologie verwendete diese Studie den BXN038 7-Stamm, der den uIs115(Pmec-17::tagRFP)⁵ Transgen enthält, um die PLM-Neuronen und jsIs609 (Pmec-4::MLS::GFP)¹¹ zu visualisieren. Mitochondrien speziell innerhalb der PLM-Neuronen zu visualisieren. Diese Studie wurde in synchronisierten 3 Tage alten erwachsenen Würmern durchgeführt, wurde aber erfolgreich in anderen Altersgruppen durchgeführt, sowie in anderen Geweben⁷.

1. Fluoreszenzbildgebung von Mitochondrien in den PLM-Neuronen
   1. Um Größen- und Formveränderungen von Mitochondrien innerhalb der PLM-Neuronen zu messen, visualisieren Sie sowohl das Hintergrundneuron als auch die Mitochondrien mit fluoreszierenden Transgenen.
   2. Um das PLM-Neuron abzubilden, verwenden Sie ein konfokales Mikroskop, das an einen 488 nm und 552 nm optisch gepumpten Halbleiterdiodenlaser gekoppelt ist und mit Bildaufnahmesoftware ausgestattet ist.
   3. Stellen Sie den Wurm gemäß den Schritten 4.1.1-4.1.4 oben vor, um nicht sättliche Expositionsbedingungen zu gewährleisten.
   4. Um das gesamte Neuron zu visualisieren, kann ein gekacheltes Bild benötigt werden. Um dies zu erreichen, verwenden Sie Software mit einer Kachel-Scan-Option, um einen Marker an einer Ecke des Neurons zu lokalisieren und fallen zu lassen und dann das entgegengesetzte Ende zu lokalisieren und den anderen Marker fallen zu lassen. Die Software berechnet die optimale Anzahl von Kacheln, die benötigt werden, um den gewünschten Bereich zu erfassen.
      HINWEIS: Um die Scanzeit zu reduzieren, ist es oft einfacher, Neuronen zu finden, die einer einzelnen Ebene folgen, was zu weniger Kacheln führt.
   5. Um den Kachelscan mit einem Z-Stack zu koppeln, legen Sie vor dem Starten des Kachelscans die unteren und oberen Grenzwerte fest, und stellen Sie sicher, dass die optimale Slice-Größe festgelegt ist.
   6. Stellen Sie sicher, dass die Auflösung optimiert ist, da die Segmentierung mit höheren Auflösungen verfeinert wird (hier wurde eine Auflösung von 3224 x 3224 Pixeln verwendet).
      HINWEIS: Während das transgene uIs115(Pmec-17::tagRFP) verwendet wird, um das PLM zu markieren und die Kamera erfolgreich zu positionieren, muss es nicht unbedingt aufgrund einer leichten Hintergrundfluoreszenz abgestellt werden, die von den jsIs609(Pmec-4::MLS::GFP) beobachtet wurde. Transgen innerhalb des PLM-Axons selbst. So kann die Scan- und Bildzeit reduziert werden, indem der 552 nm Filter aus dem Experiment entfernt wird.
2. Objektsegmentierung mit SQUASSH
   1. Konvertieren Sie Bilddateien in .tiff-Bilder und erzeugen Sie maximale Intensitätsprojektionen von Z-Stacks mit Fidschi-Bildgebungssoftware. Schneiden Sie Bilder auf die minimale Größe zu, während Sie immer noch das gesamte Neuron enthalten, um die Rechenlast zu reduzieren und Hintergrundgeräusche zu reduzieren.
      HINWEIS: Für die repräsentativen Ergebnisse wurden nur Mitochondrien innerhalb der langen axonalen Prozesse berücksichtigt, so dass der Zellkörper und alle darin inneren Mitochondrien von jedem Bild ausgeschlossen wurden.
   2. Führen Sie die Split Bregman-Segmentierung¹² mithilfe des SQUASSH-Makros der Mosaik-Suite für ImageJ auf den maximalen Projektionen aus. Eine ausführliche Anleitung zur Installation und Anwendung dieses Makros finden Sie auf der Mosaic-Website (http://mosaic.mpi-cbg.de/) und beschrieben von Rizk et al. 2014¹³. Der Prozess der Bildsegmentierung wird im Folgenden kurz beschrieben.
      HINWEIS: Diese Segmentierung identifiziert Objekte (in diesem Fall einzelne mitochondrion) über einem Schwellenwert der Fluoreszenzintensität, was eine genaue Messung der Größe und Form jedes einzelnen Objekts ermöglicht.
   3. Entfernen Sie Hintergrundrauschen aus einem Bild mithilfe der Rolling Ball-Methode, bei der sich ein benutzerdefiniertes Fenster über das Bild bewegt und die lokale Hintergrundintensitätsschätzung aus der am häufigsten auftretenden Intensität in jedem Fenster zuschreibt. Dadurch werden ungleichmäßige Hintergrundintensitäten korrigiert.
   4. Verwenden Sie die Objekterkennung, um ungefähr Bereiche des Bildes zu finden, die Objekte (Mitochondrien) von Interesse enthalten, basierend auf der Fluoreszenzintensität und der Anzahl der Pixel. Die Parameter, die diesen Schritt steuern, sind die Regularisierung und die minimale Objektintensität.
      HINWEIS: Die Regularisierung wird verwendet, um die Segmentierung kleiner Intensitäten, geräuschinduzierter Spitzen zu vermeiden, und der minimale Objektintensitätsschwellenwert hilft, die subzellulären Organellen aus der Fluoreszenz des Hintergrundgewebes zu definieren. Dies sind die beiden wichtigsten Parameter, die manipuliert werden, um eine optimale Segmentierung der Mitochondrien zu finden, und der Optimierungsprozess neigt dazu, Versuch und Fehler verschiedener Parameter für ein Testbild zu sein, gefolgt von manueller Inspektion.
   5. Verwenden Sie die Software, um die lokalen Hintergrundintensitäten um jedes Objekt zu schätzen, um die Berechnung der optimalen Segmentierung zu unterstützen.
   6. Messen Sie einzelne Objekte auf Größe, Umfang, Länge über Pixelzahl sowie Signalintensität und x/y-Position auf dem Bild. Um Messungen in der Größe (nm) zu berechnen, berücksichtigen Sie die Pixelgröße des Originalbildes.
      HINWEIS: Für jedes Experiment müssen zunächst optimale Parameter berechnet werden. Um die Genauigkeit der Segmentierung zu gewährleisten, ist es ratsam, eine SQUASSH-Analyse an einem Testbild durchzuführen und die Genauigkeit der Segmentierung manuell zu überprüfen. Das Makro stellt Ausgabedateien bereit, die die einzelnen Objekte anzeigen, die auf dem Originalbild identifiziert wurden, und durch genaue Überprüfung dieser Objekte und Anpassen der Parameter wird eine genaue Segmentierung sichergestellt. Die definierten Parameter müssen dann für das gesamte Experiment zur Vergleichbarkeit verwendet werden. Die für die repräsentativen Ergebnisse verwendeten Parameter sind in Tabelle 2enthalten.
   7. Öffnen Sie die Analysesoftware Fidschi oder ImageJ, navigieren Sie zum Mosaik-Makrocontainer und öffnen Sie das SQUASSH-Menü.
      1. Öffnen Sie das Untermenü Hintergrundsubtraktion, und stellen Sie sicher, dass Hintergrund entfernen? aktiviert ist. Die Standardeinstellung für die Fenstergröße ist 10.
      2. Legen Sie die gewünschte Regularisierung und minimale Objektintensität, Kanal 1-Werte fest, um Objekte am besten zu identifizieren und zu segmentieren (siehe Schritt 6.2.4). Kanal-2-Werte sind für Objekte, die mit einem einzelnen Transgen markiert sind, nicht erforderlich.
      3. Klicken Sie auf die Schätzung von PSF aus objektiven Eigenschaften, um die Punktstreufunktion basierend auf den Eigenschaften des Mikroskops zu schätzen. Dies hilft bei der Segmentierung eng liegender Objekte, indem der Einfluss jedes Pixels auf das benachbarte Pixel berücksichtigt wird.
         HINWEIS: Die Subpixelsegmentierung wurde in diesem Experiment aufgrund der erhöhten Auslastung der Computerverarbeitungsleistung nicht verwendet. Zellmasken wurden auch nicht verwendet, da das Axon leicht zu definieren ist. Diese Einstellungen sind nützlich für komplexere Gewebe und zum Definieren von Objekten auf Zellbasis.
      4. Stellen Sie bei Visualisierungsoptionen sicher, dass Objektumrisse und Speichern von Objekt- und Bildmerkmalen aktiviert sind. Stellen Sie für die spätere Verwendung in Grafik- und Statistiksoftware sicher, dass die richtige Anzahl von Bedingungen eingegeben wird.
   8. Suchen Sie den Ordner mit .tiff-Bildern, und führen Sie das Makro aus. Dieser Vorgang kann auf einem einzelnen Bild oder auf einem Stapel von Bildern pro Genotyp in einem Ordner durchgeführt werden. Ausgabedateien befinden sich zusammen mit den Originalbildern im Ordner.
3. Analyse und Messung der Form
   1. Verwenden Sie die Ausgabe von SQUASSH, um eine aufgeschlüsselte Objektdatendatei .csv bereitzustellen, die jedes einzelne Objekt pro Zeile einschließlich seiner Messungen bereitstellt, wie oben beschrieben.
      HINWEIS: Während dieser Makroprozess Objektmessungen automatisiert, ist es immer wichtig, Ausgabebilder nach der SQUASSH-Segmentierung manuell zu überprüfen, um sicherzustellen, dass das Makro Mitochondrien ordnungsgemäß identifiziert hat.
   2. Um die Form jeder Mitochondrien zu analysieren, verwenden Sie ein zweidimensionales Maß für Sphärizität, Zirkularität,um die Abweichung des Objekts von einem perfekten Kreis zu schätzen.
      ANMERKUNG: Zirkularität ist eine Funktion von Fläche und Umfang (Kreis ( 4 x) x (Fläche/Umfang²), wobei 1 = ein perfekter Kreis und 0 = eine gerade Linie. Dies kann mit einer Formel in Grafiken und statistischer Software erreicht werden.
   3. Um die Varianz in Größe und Form im Pool der Mitochondrien zu bestimmen, berechnen Sie Histogramme und eine angepasste Gaußsche Verteilung mit Grafiken und statistischer Software, mit Behältern von 0,2 m für mitochondriale Größe und 0,05 für mitochondriale Zirkularität.

Ergebnisse

C. elegans ist ein idealer Modellorganismus für die Untersuchung der Morphologie verschiedener Gewebe und Organellen aufgrund seiner Einfachheit, bekannten Zellabstammung, Transparenz und verfügbaren Werkzeugen. Hier bieten wir quantitative Ansätze für die Untersuchung von Organellen (z.B. Mitochondrien) und Geweben, einschließlich Synapsen und Muskeln mit Live-Fluoreszenz-Bildgebung und kostenloser Bio-Bildverarbeitungssoftware.

Diskussion

Morphologische Variationen wurden häufig durch manuelleS Zählen von spürbaren Unterschieden oder unter Verwendung beliebiger Schwellenwerte zur Bestimmung von Defekten im Vergleich zu einem Wildtyp-Phänotyp bewertet. In jüngerer Zeit wurden jedoch quantitative Methoden für vergleichende Studien der Morphologie verwendet, um Veränderungen auf zellulärer und subzellulärer Ebene unvoreingenommen genau zu messen und zu beschreiben. Die Fähigkeit, subtile, aber biologisch relevante Unterschiede zwischen Phänotypen ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar-agar	Merck	1.01614.1000
Agarose	Invitrogen	16500-500
Confocal microscope	Leica	TCS SP8	Inverted platform
Fluorescence microscope	Carl Zeiss AG	Zeiss Axio Imager M2
Glass coverslips #1	Thermo scientifique	MENCS22221GP
Glass coverslips #1.5	Zeiss	474030-9000-000	Made by SCHOTT
Glass slides	Thermo scientifique	MENS41104A/40
Light LED	Schott	KL 300 LED
Stereo Microscope	Olympus	SZ51
Tryptone (Peptone from casein)	Merck	107213	Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium
Yeast Extract	Merck	103753	Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium
Sodium chloride	Merck	106404	Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium
Peptone (Peptone from meat)	Merck	107214	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Agar	Sigma	A1296	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Sodium chloride	Merck	106404	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Cholesterol	Sigma	C8667-25G	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Calcium chloride	Merck	102382	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Magnesium sulfate	Merck	105886	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Dipotassium phosphate	Merck	105101	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Potassium dihydrogen phosphate	Merck	104873	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Disodium phosphate	Merck	106586	Ingredients for M9 buffer
Sodium chloride	Merck	106404	Ingredients for M9 buffer
Potassium dihydrogen phosphate	Merck	104873	Ingredients for M9 buffer
Magnesium sulfate	Merck	105886	Ingredients for M9 buffer
Pasteur pipette	Corning	CLS7095D5X-200EA
Petri dishes	Corning	CLS430589-500EA
Platinum wire	Sigma	267201-2G
Spatula	Met-app	2616
Tetramisole hydrochloride	Sigma	L9756-5G