גישות כמותיים ללימוד מבנים סלולאריים ומורפולוגיה ארגונית בקנבאבדיוטיס

Summary

מחקר זה מתאר את המידות הכמותיות של גודל ולוקליזציה, מורפולוגיה שרירים וצורה מיטוכונדרילית ב -C. אלגיה באמצעות כלים זמינים לעיבוד תמונות באופן חופשי. גישה זו מאפשרת לימודים עתידיים ב -C. אלגיה להשוות בין היקף רקמות ושינויים מבניים כתוצאה מוטציות גנטיות.

Abstract

הגדרת מנגנוני הסלולר שבבסיס המחלה חיונית לפיתוח therapeutics הרומן. אסטרטגיה המשמשת לעתים קרובות לפענח מנגנונים אלה היא להחדיר מוטציות בגנים המועמדים ולתאר באופן איכותי שינויים במבנה של רקמות ומרקלים סלולריים. עם זאת, תיאורים איכותניים לא יכולים ללכוד הבדלים עדינים, אולי באופן שונה וריאציות פנויואיות על פני אנשים באוכלוסיה, והם מוערך לעתים קרובות סובייקטיבי. כאן, גישות כמותיים מתוארות כדי ללמוד את המבנה של רקמות ואורגלים באלאואודה caenorditis באמצעות סריקת לייזר מיקרוסקופ קונפוקלית וקד בשילוב עם תוכנות ביולוגיות זמינות מסחרית עיבוד. ניתוח כמותי של פנוטיפים המשפיעים על שלמות הסינפסה (גודל ורמות זריחה משולבת), פיתוח שרירים (גודל תא השריר ואורך הפילמנט רירן), ומורפולוגיה מיטוכונדריאלי (מעגליות וגודל) בוצעה כדי להבין ההשפעות של מוטציות גנטיות על אלה מבנים סלולריים. גישות כמותיים אלה אינן מוגבלות ליישומים המתוארים כאן, שכן ניתן להשתמש בהם כדי להעריך את המבנה של רקמות אחרות ואורגלות בתוך הנימטודה, כמו גם באורגניזמים אחרים במודל.

Introduction

האלמטדה (האלאים) מנוצל יותר ויותר כמערכת מודל לחשיפת התהליכים הביולוגיים והמולקולריים המעורבים במחלות אנושיות. נמטודות מבוגר יש אורך הגוף של רק מעל 1 מ"מ, והוא יכול לייצר דגירה גדולה של עד 300 ביצים¹. לאחר בקיעה, הג דורשים רק 3-4 ימים כדי להגיע לבגרות, ולחיות במשך כ 2-3 שבועות². בשל קלות התפירה, הג הוא אחד המבוקשים ביותר בדגמי בעלי חיים vivo לביצוע הקרנת סמים מהירה וחסכונית כדי לזהות therapeutics למחלות אנושיות. בנוסף, שימור גנטי שלה, הגדרה התנהגות היטב, גוף שקוף עבור מיקרוסקופ אור פלואורסצנטית או קל, וקלות של מניפולציה גנטית להפוך את המחקר של ההשלכות הסלולר והמולקולריים של מוטציות גנטיות בקלות achieveable ³. הגנום C. אלגיה מניות כ 60-80% האורתולוגיה עם הגנים האנושיים, וכ-40% מהגנים האלה ידועים כקשורים למחלות. כמה מחלות אנושיות שהיו מדגם ולמדו בג כוללים הפרעות ניווניות (מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון, טרשת amyotrophic לרוחב, charcot-מארי-שיניים מחלות), מחלות הקשורות שרירים ( ניוון שרירים duchenne), ומחלות מטבולית (היפרגליקמיה)^2,4. ברוב ההפרעות האנושיות, התאמה לוקליזציה תאית וארגונית מחלות ושינויים מורפולוגיים מתרחשים, אשר ניתן בקלות להעריך במודל נמטודות.

סמנים פלורסנט השתמשו באופן נרחב כדי לתייג רקמות ואורגלים להדמיה דינמית מתחת למיקרוסקופ. עם זאת, ב -C. אלגיה, שיטות קונבנציונליות להערכת אי סדירות מורפולוגית בשל מוטציות גנטיות הסתמך במידה רבה על תיאורים חזותיים. בעוד ההערכות האיכותניות יכולות לכסות טווחים רחבים יותר של תיאורים פנותטיים (מורפולוגיה סינפטית, מקלפת מערכות ה-GFP, צורה מסוימת של האקסון, עובי סיבי השריר, וכו ') ולספק את ההשקפה של עין הציפור של שינויים מורפולוגיים, הם פחות מתאימים השוואת וריאציות קטנות בין קבוצות שונות. יתרה מזאת, הערכות איכותניות מבוססות על הערכה חזותית וסובייקטיבית, שעלולה להוביל לחריגה או מתחת להערכות של חריגות מורפולוגיות. לבסוף, תצפיות איכותניות יכולות גם להשתנות במידה רבה בין אנשים, יצירת קשיים עם שכפול נתונים.

בשנים האחרונות, מספר אלגוריתמים ידידותיים למשתמש, הזמינים בקלות, שיכולים לנתח את התמונות באמצעות כימות. עם זאת, הניצול של תוכנה כגון ניתוח תמונה עבור כמה מחקרים מורפולוגיים, במיוחד ביחס שרירי קיר הגוף והמיטוסים, ב C. מחקרים המחקר הפכה מאחור. כדי לשפר את הניתוח המבני הבסיסיים ב -C. אלגיה, חלק מתוכנת ניתוח התמונה הפתוחה, הקוד הפתוח, היתה שבירה להשוות את ההשפעות של מוטציות גנטיות על המיטו, שריר קיר הגוף וסינפטית ורפולוגיה. אלה הליכים ניסיוניים לתאר בפרוטרוט כיצד תוכניות אלה (פיג'י, אילאסטיק, cellprofiler, squassh) ניתן להשתמש כדי להעריך את השינויים בגודל סינפטית ולוקליזציה של חלבון סינפטית, שריר קיר הגוף באזור ואורך סיבים, וגודל מיטוכונדריאלי ו מעגליות כתוצאה של מוטציות גנטיות ב nematode.

Protocol

1. צמיחה ואחזקה של C. אלגיה זנים

1. זרעים Nematode צמיחה בינונית (NGM, לראות את הטבלה חומרים) אגר צלחות עם 300 μl של החיידק הגדל איטי OP50 זן בארון זרם למינארי.
2. השאירו את לוחות NGM אגר בארון הזרימה למינארי להתייבש.
   הערה: בהיעדר ארון זרימה למינארי, ניתן להשאיר צלחות להתייבש על הספסל, אך הן נוטות יותר לזיהום.
3. העברה לפחות 20 בעלי חיים לכל אחד משני OP50-שופרה לוחיות העבודה של NGM אגר כדי להיות מניות עובד. יש שתי דרכים עיקריות. להעביר בעלי חיים
   1. לקטוף: להרים בעדינות את החיות באמצעות בחירת חום מעוקר. שיטה זו יעילה לבחירת בעלי חיים בודדים או מרובים מצלחת אגר. לאחר שריטה קטנה של חיידקים בקצה בעת איסוף מסייע העברה.
      הערה: הפיק עשוי מחתיכת חוט פלטינה באורך של כ-4 ס מ המוטבע בפיפטה זכוכית, כאשר החוט משוטח להיות ' חנית '. החום מחטא את האפשרות בין קטיף. כדי למנוע זיהום צולב
   2. Chunking: באמצעות מרית מחוטאת, חותכים ריבוע קטן של אגר המכיל את בעלי החיים מצלחת אחת והעביר הפוך לצלחת חדשה.
      הערות: שיטה זו שימושית בדרך כלל להעברת מספר גדול של תולעים, ולהסיר זיהום מצלחות באמצעות סיבובים מרובים של אגר לא מזוהם של chunking. להימנע מפני זיהום על ידי בוער המרית כמה שניות ולאשר את המרית ב 100% אתנול בין העברות. העברת מצלחות מורעבים אינה מומלצת כרעב וצפיפות יתר יכולה להשפיע על הבריאות והמבנה של מבני הסלולר והתת.
4. שמרו על התולעים בטמפרטורת הצמיחה הסטנדרטית (20 ° c). כדי להבטיח אספקה רציפה של תולעים מוזנים היטב, העבירו את התולעים ללוחות הOP50 החדשים מדי 2 עד 3 ימים.

2. הגיל-סנכרון ג. אלגיה

1. לשמור על תולעים על 3-4 NGM צלחות עד האוכלוסייה היא צפופה אבל לא רעב.
2. לשטוף בעדינות את התולעים את הצלחת NGM עם פתרון M9. הביצים יישארו על הצלחת מאז הם לדבוק E. COLI OP50. חזור על הפעולה עם ארבעה צעדי כביסה נוספים כדי להסיר את כל החיות המקווקו.
3. לאפשר לתולעים לבקוע עבור 40 דקות.
4. הוסף 1-2 mL של פתרון M9 לצלחת ומערבולת בעדינות כדי לשחרר תולעים מקווקו לאחרונה.
5. לאסוף את הפתרון M9 עם תולעים שנולדו לאחרונה ולהעביר את הפתרון עם תולעים לצלחת NGM טריים.
6. לאפשר פתרון M9 להתאדות על ידי חשיפת צלחת NGM לאוויר. לעשות את זה ליד להבה פתוחה כדי למנוע זיהום של צלחת NGM.
7. הגדל את התולעים במשך 27 שעות ב -20 ° c כדי לאפשר פיתוח לשלב הזחל השלישי (L3). עבור מסונכרנים בעלי חיים בוגרים בן 3 ימים, התולעים נאספו בשלב הזחל 4, גדל למשך 3 ימים נוספים כדי להגיע לשלב המבוגר בן 3 ימים.

3. הכנת שקופיות להדמיה

1. הכינו 3-4% w/v agarose מניות בבקבוק בטוח מיקרוגל (3-4 g ב 100 mL של מים באולטרסאונד).
   הערה: ניתן להשתמש באגר במקום של העלה באותו ריכוז.
2. ממיסים את הצמח בזהירות במיקרוגל, מטפלים לא מעל הרתיחה, עד שהכול מתמוסס (פתרון ברור). שמור על הפתרון ב 70 ° צ' כדי למנוע מיצוק.
   הערה: ניתן להשתמש במלאי Agarose מספר פעמים. החום לפני השימוש אם הצמח התחזק.
3. באמצעות הפיפטה פסטר, מניחים טיפה של הצמח נמס על שקופית המיקרוסקופ.
   הערה: להימנע מהצורך בועות אוויר טיפה של אגר כמו אלה לשבש את היושרה של הפנקס.
4. לחצו מיד את ה-droplet עם מגלשת מיקרוסקופ אחרת, שיטוח בעדינות את הצמח לתוך משטח בין שתי השקופיות.
   הערה: יש להסיר את כל הבועות הנותרים בשלב זה. אם לא, שקופיות חדשות יש לעשות כמו בעלי חיים יכולים בקלות להיתקע בועות. להימנע מגלישה של אגר בצד בעת לחיצה על השקופית.
5. להשאיר את הצמח להתייבש במשך 1 דקות.
6. הפרד בזהירות את שתי השקופיות כדי למנוע נזק לצמח, תוך השארת הלוח המתחזק באחת השקופיות.
   הערה: יש להכין שקופיות עם תחבושות מוכנות תמיד טריות בדיוק לפני הניסוי כפי שניתן לייבש. ודא שלוח האגקם מכיל עובי עקבי. לא צריך להיות בועות אוויר או סדקים בתוך הלוח כמו זה עלול להפריע הדמיה.
7. הוסף טיפה קטנה (5-10 μL) של 0.05% הידרוכלוריד (הרדמה) למרכז של כרית agarose.
8. באמצעות חום-מעוקר לקטוף, במהירות להעביר כ 10-15 בעלי חיים מלוח המניות ל-droplet הרדמה לפני הפתרון מתייבש. הימנע להעביר יותר מדי חיידקים OP50 זה עושה את הפתרון מעונן, אשר יכול להפריע הדמיה.
   הערה: אם פתרון ההרדמה מתייבש תוך כדי הקטיף, פשוט הפיפטה השני של 0.05% הידרוכלוריד על החיות. בעלי החיים נוטים לשכב על הצד הצדדי שלהם בתמיסה של ההרדמה.
9. החלת שמיכות על ידי מיקום אותו מעל הלוח הגבוה ובעדינות להפיל אותו. זה ימנע היווצרות של בועות. לא להחיל לחץ על שמיכות כי זה עלול למחוץ את החיות.
10. סמן את השקופיות עם שם הנבג.

4. הערכת מורפולוגיה סינפטית

הערה: ההשפעות של הביטוי היתר של MEC-17 על שלמות סינפסה בתוך מיקרוכדורית לרוחב האחורי (plm) קולטן לגעת נוירונים נחקרו על ידי כימות את הגודל הסינפטית ולוקליזציה באמצעות שורה סריקת קונפוקלית מיקרוסקופ. הנוירונים PLM (כולל אזורי סינפטיות) היו דמיינו באמצעות uIs115 (pmec-17:: tagRFP) transgene (זן: TU4065⁵) ואת האזור סינפטית היה מתויג במיוחד עם jsIs37 (pmec-7:: SNB-1:: GFP) (זן: NM664 ^{5 מטרים}לשעה . מחקר זה בוצע מסונכרן הבלתי-טרנסגניים ובעלי חיים טרנסגניים של כרומוזום משני מסוג MEC-17 ביטוי overexpression [cjnEx036 (Pmec-4:: MEC-17, Pmyo-2:: mCherry); jsIs37; uIs115]⁷. רשימה מלאה של זנים המשמשים במחקר זה נכלל בטבלה 1.

1. הדמיה קונמיקוד של הסינפסות של קולטן מגע
   1. כדי לדמות את אזורי סינפטית, להשתמש קו סריקת מיקרוסקופ קונפוקלית וקד מצמידים 488 ננומטר ו 552 ננומטר שאוב semi-מנצח דיודות לייזר דיודה מצויד עם תוכנה לכידת תמונה.
   2. אתרו את התולעים בהגדלה הנמוכה ביותר.
   3. כאשר בעלי החיים ממוקמים בהצלחה, לעבור להגדלה 40X ולהחיל בינונית טבילה (במחקר זה: 40X/1.10 HC PL CS2 היעד רב מקיפה עם טבילה במים היה בשימוש).
   4. המחש את אזור הסינפטיות על ידי מרגש fluorophores עם 488 ננומטר לייזר (2% כוח) עבור GFP fluorop, ו 552 nm (1% כוח) עבור tagRFP fluorop,.
   5. קביעת מסגרת x ו-y אופטימלית ללכידת אזור הסינפטית כולו. הקפד לשקול את גודל הפיקסל האופטימלי בעת בחירת המסגרת. במחקר זה, גודל פיקסל עקבי של 56 nm הושגה.
   6. לכידת תמונות באמצעות גלאי תמונה היברידית ולהגדיר את רווחי כדי למנוע חשיפה יתר של fluorophores (100% עבור 488 העירור ננומטר ו 15% עבור 552 ננומטר הריגוש).
   7. לאסוף תמונות z-מחסנית כדי לכסות את הסינפסה כולו, באמצעות גודל הצעד האופטימלי z בהתאם למטרה הספציפית בשימוש. במחקר זה, בגודל מיטבי z-step של 0.211 ננומטר שימש.
      הערה: ודא שכל התמונות מצולמות בתנאים מחמירים כדי לאפשר כימות קרינה והשוואה של משולב. זה יכול להיעשות על ידי שמירה על פרמטרים מיקרוסקופית זהה בכל התמונות שנתפסו (כלומר, הגדרות לייזר וגלאי, גודל פיקסל, מהירות סריקה, וגודל מיטבי z-step). הגדרות אופטימליות תלויות במטרה וניתן לחשב אותן באמצעות תוכניות ביואינפורמטיקה נגישות, כגון מחשבון נייקוויסט (https://svi.nl/NyquistCalculator). הוספת תוויות לתמונות באופן שיטתי, פעולה זו תהיה שימושית בעת השימוש בתוכנה ביואינפורמטיקה שתארגן ותעבד קבצים המבוססים על שם קובץ.
2. קוונפיקציה של האזור הסינפטית
   1. כדי לנתח את אזור הסינפטיות, לייצא תמונות כקבצי TIFF. ניתן להשתמש בתוכנת עיבוד הדמיה מבוססת Java, כגון ImageJ, (במחקר זה, שימוש במאקרו המרת תמונת MRI ב-ImageJ).
   2. הגודל ואת רמות העוצמה של הקרינה הפלואורסצנטית משולבים של הסינפסות נמדדו מעוצמת הסכום של ז ' ה שהושגו-ערימות עם CellProfiler-3.1.5. לטעון את התמונות לתוך תוכנת CellProfiler 3.1.5. במקרה הצורך, ניתן לסנן תמונות בהתבסס על שמות של קובצי תמונה.
   3. הגדר את המודול ' שם וסוג '. לחלופין, חלץ את המטא-נתונים מתווית התמונה כדי לארגן נתונים מחושבים בהתאם.
   4. לקבוע את האזור סינפטיות בהגדרה יד של אזור זה באמצעות tagRFP מפוזר מבוטא uIs115 (Pmec-17:: tagrfp) transgene. זה יכול להיעשות על ידי הוספת מודול לגבי הצינור CellProfiler-3.1.5.
   5. כדי למדוד את הגודל ואת הקרינה הפלואורסצנטית מוגדרת היד המוגדרת, להוסיף את גודל האובייקט ואת הצורה ולמדוד את מודול עוצמת האובייקט לצינור.
   6. חשב את עוצמת הזריחה המשולבת היחסית על-ידי הוספת המודול חישוב מתמטי . לחלק את יחידות אינטנסיביות משולב שהתקבלו מ jsIs37 (Pmec-7:: snb-1:: GFP) על ידי יחידות משולבות שהתקבלו עבור UIs115 (pmec-17:: tagrfp).
   7. ייצוא מדידות וחישובים.

5. מבנה שריר קיר הגוף

1. הדמיה פלואורסצנטית של מבנה הגוף שריר קיר
   1. להשיג זן (למשל, RW1596) נושאת את StEx30 הטרנסגנים (Pmyo-3:: gfp:: myo-3 + rol-6 (su1006))⁸, אשר תוויות רירן סיבים עם gfp.
      הערה: מבוא של הטרנסגנים לבעלי חיים יכול להיות מושגת על ידי חציית מתח של עניין עם בעלי חיים שכבר מבטאים את המשגר, או הזרקת דנ א לזרוע המרוחק של הגונאדה. "מתגלגל" הפנוטיפ שנגרם על ידי rol-6 מוטציה ב-transgene זה מאפשר את ההדמיה של השרירים. שרירי הקיר הגוף לרוץ לאורך הצדדים הגוגאיים כי הם בדרך כלל מנעה מן התצוגה בחיות מסוג פראי כי הם בדרך כלל לשכב על אחד הצדדים שלהם לרוחב. ה -rol-6 (su1006) אלל גורם לפיתול של בעלי החיים, ובכך לחשוף כמה תאי שרירים להדמיה.
   2. התמונה בעלי חיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטית בשילוב עם ברזולוציה גבוהה טעונה מצמידים המכשיר מצלמה (CCD), 40X אובייקטיבי או גבוה יותר, מסנן GFP ותוכנה לרכישה.
   3. התאימו את זמן החשיפה ואת עוצמת התאורה כדי למנוע תמונות רוויה.
   4. לכידת ושמירה של תמונות של השרירים (400 x הגדלה) מקטע של בעל החיים המכיל לפחות אחד מושלם לראות תא השריר האלכסוני. הימנע מאזורים בעלי תא שריר יחיד שאינו שלם או מקטעים שאינם מרוכזים. גם להוציא תמונות מאזורים הקדמי והאחורי קיצוניים, ואזורים הסמוכים הפות.
      הערה: אם לבעל החיים אין תא שריר מושלם לעין, החלק בעדינות את הכיסויים כדי להפוך את בעל החיים כדי לחשוף תא שלם.
2. מדידה של שטח תא שריר
   1. פתח את התמונה בתוכנת פיג'י⁹ (גירסה 2.0.0 שימש במחקר זה).
   2. השתמש בקטע המצולע כדי לעקוב בזהירות מסביב לתא שריר בודד אלכסוני. כוונן את קו המצולע בסוף על-ידי גרירת נקודת העיגון כדי לשפר את העקיבה.
   3. עבור לניתוח לשונית בחלק העליון של התוכנה ולחץ על מדידה כדי לחשב את אזור הבחירה. טבלת תוצאות נפרדת המכילה את האזור ומדידות אחרות יוצגו. אם מדידת האזור חסרה בטבלת התוצאות, עבור לקביעת המידות תחת הכרטיסיה ניתוח ובדוק שתיבת האזור מתיקלת. כמו כן, פרוש מדידות אחרות שאינן נחוצות.
   4. עבור תאי שריר עם אזור מנוון/חסר, עקוב אחר האזור החסר באמצעות כלי בחירת המצולע ולחץ על מדידה שוב. אם יש מספר מרווחים בתא, עקוב אחר כל מרווח בנפרד.
   5. לחשב את היחס של אזור הפער על כל תא שריר יחיד. יחס גבוה מעיד על מידה גבוהה יותר של ניוון שרירים עקב פערים גדולים בתוך התא. אם אין אזורים חסרים, כפי שניתן לראות בחיות מסוג פראי, היחס יחושב כאפס.
      הערה: כפקד, ציון גם עבור פגמים במבנה השריר חזותית ולהשוות את התוצאות עם המדידה הכמותית. זה שימושי במיוחד אם המתח הוא לומדים בפעם הראשונה במעבדה. העריכו את החיות כפגומות או לא-פגומות בהתבסס על שלמות החוטים. לדוגמה, בעלי חיים עם אובדן של סטריציות פילמנט ברורים, הגפינג של GFP, או פערים בתוך תאי שריר עקב התמוטטות מבנית, יהיה הבקיע כמו פגום.
3. פילוח וקוונפיקציה של אורך סיבים רירן
   1. במקרה הצורך, המירו תחילה קבצים. טיף באמצעות פיג'י או חבילת תוכנה אחרת. שמרו את קובצי ה-TIFF במיקום הרצוי.
   2. פתח ilastik¹⁰ (תוכנה חופשית, גירסה 1.3.2 ניתן להוריד מ https://www.ilastik.org/).
   3. במהלך ilastik, בחר בסיווג הפיקסלים תחת צור פרוייקטחדש. התוכנה תציג בקשה לשמירה על הפרוייקט. שנה את שם הפרוייקט ושמור אותו במיקום הרצוי.
      הערה: יש ליצור פרוייקט חדש רק פעם אחת בלבד. פילוח הבא ניתן לבצע באמצעות אותו פרוייקט. כדי להשתמש באותן הגדרות פרוייקט, עבור אל הכרטיסיה פרוייקט בחלק העליון ולחץ על ' פתח פרוייקט ' כדי לגשת לקובץ project.
   4. צריך להיות 5 כרטיסיות בלוח השמאלי (נתוני קלט, בחירת תכונה, הדרכה, חיזוי ייצוא ועיבוד אצווה). בכרטיסיה נתוני קלט, לחץ על הוסף חדש ולאחר מכן הוסף תמונה (ות) נפרדת. כוונו את החלון המוקפץ לתיקייה המכילה את קובצי TIFF ובחרו בתמונה לפתיחה.
   5. בכרטיסיה הבאה שלהלן (בחירת תכונות), לחץ על בחירת תכונות כדי לבחור את כל תכונות הפיקסלים, המצוין על-ידי תיבות תיקקות ירוקות. בחירת הפיקסלים בשלב זה משמשת להבחנה בין מחלקות הפיקסלים השונות בשלב הבא.
      הערה: בחירת תכונת הפיקסלים תלויה ברזולוציית התמונה. מכאן, המפתחים מציעים לבחור את כל או כמה תכונות ככל האפשר, אם הכוח עיבוד היתר הזמן.
   6. לוח ההדרכה הבא מאפשר סיווג של מחלקות אובייקטים שונות המבוססות על פיקסלים. במקרה זה, שני השיעורים הם בודדים GFP הביע רירן סיבים ורקע בלתי רצוי או קצוות מטושטשים. לחץ על הוספת תווית כדי לקבל את התווית הראשונה. החלה על מספר חוטים. להתחלת הכשרת מסווג
      הערה: לחיצה כפולה על התווית מאפשרת שינוי שם (לדוגמה, שינוי שם ' תווית 1 ' ל-' פילמנט '). לחיצה כפולה על התיבה הצבעונית מאפשרת צבעים לשרטוט ולהצגת ההסתברות שישונו. גודל ברירת המחדל של מברשת הצבע הוא 1, למרות שהגודל יכול להיות מוגבר ל-61. אם הפיקסל הלא נכון צויר, פשוט השתמש בכלי מחק כדי להסיר את הציור. ניתן להשתמש בפקדי לוח מקשים (-) ו-(Shift +) כדי להגדיל ולהקטין את התמונה, בהתאמה. מקשי החיצים משמשים לניווט סביב התמונה.
   7. הוסף תווית שניה ושנה את שמו לרקע. השתלי מעל רקעים וחללים לא רצויים בין החוטים.
   8. לחץ על עדכון חי וודא שסיווג זה נעשה על-ידי התוכנה כהלכה. הוסף יותר scrawls ולכוונן את האימונים במידת הצורך.
      הערה: חשוב לפקוח עין על סיבים ממוזגים וקצוות מטושטשים (כגון קו גוף) בשלב זה. שפר את התחזית כאן ככל האפשר כדי להגדיל את הדיוק של מדידות. הדיוק חיזוי תלוי גם ברזולוציית התמונה, כמו פיקסלים באיכות נמוכה יותר קשה יותר להקניט בנפרד. הוא גם אופציונלי, אך מומלץ להפעיל את שיטת הסינון בפונקציה ' הצע תכונות ' לצד ' בקרת עדכון חי '.
   9. לאחר מסווג הכשרה התבצע כראוי, ללכת התחזית ייצוא פאנל. לחץ על בחר באפשרות ' ייצוא הגדרות תמונה ' עם הסתברות למקור.
   10. השתמש בהגדרות הבאות. החלק החתוך x ו- y תיקתק, ו- c ביטול התיקתק. ערכי ההתחלה והעצירה עבור c צריכים להיות 0 ו-1, בהתאמה. לתקתק ולהמיר סוג נתונים בהמרות ל-8 סיביות לא חתומות, לסמן את הפקודה [min, max] ולהשתמש בערכי ברירת המחדל. שנה את התבנית של וידאו קובץ הפלט ל-PNG, ושנה את שם הקובץ והספריה כרצונך.
   11. סגור את חלון הגדרות הייצוא וייצא את התמונה הספציפית שכרגע מחולקת.
   12. פתחו את תמונת ה-PNG השמורה בתוכנת פיג'י. התמונה אמורה להופיע בשחור-לבן.
   13. כוונן את סף התמונה באמצעות הגדרות ברירת המחדל.
   14. החל את תוסף השלד (2D/3D, ולאחר מכן לנתח שלד). טבלה נפרדת של תוצאות תוצג, הכוללת אורך ענף. אורך הענף מייצג את אורך הסיבים. נתונים אחרים בתוצאות יכולים גם להיות שימושיים, כגון מרחק אוקלידי.
       הערה: השמט סיבים באורכים של 0 יקרומטר או יותר מ-250 יקרומטר, מכיוון שמידות אלה אינן אפשריות בבחינה פיזיולוגית.

6. מורפולוגיה מיטוכונדריאלי

הערה: לקוונפיקציה של מורפולוגיה מיטוכונדריאלי, מחקר זה השתמשו BXN038⁷ זן המכיל את UIs115 (pmec-17:: tagrfp)⁵ העברה כדי להמחיש את נוירונים Plm ו jsIs609 (pmec-4:: MLS:: gfp)¹¹ להמחיש המיטומטר במיוחד בתוך הנוירונים PLM. מחקר זה בוצע מסונכרן בגיל 3 יום תולעים בוגרים, אבל בוצע בהצלחה בגילאים אחרים, כמו גם ברקמות אחרות⁷.

1. הדמיה פלואורסצנטית של המיטומטר בתוך הנוירונים PLM
   1. כדי למדוד גודל וצורה שינויים של המיטו, בתוך הנוירונים PLM, להמחיש הן את העצב הרקע ואת המיטומטר באמצעות הניאון הטרנסגנים.
   2. כדי לצלם את תא העצב plm, להשתמש במיקרוסקופ קונפוקלית מצמידים ל488 ננומטר ו 552 ננומטר שאוב למחצה דיודה לייזר דיודות מנצח מצויד בתוכנה לכידת תמונה.
   3. צלם את התולעת לפי שלבים 4.1.1-4.1.4 לעיל, והבטחת תנאי חשיפה לא מ.
   4. כדי להמחיש את כל העצב, ייתכן שיהיה צורך בתמונה מרוצפת. כדי להשיג זאת, השתמש בתוכנה עם אפשרות לסרוק אריח כדי לאתר ולשחרר סמן בפינה אחת של תא העצב ולאחר מכן לאתר את הקצה הנגדי ושחרר את הסמן השני. התוכנה יחשב את המספר האופטימלי של אריחים הדרושים כדי ללכוד את האזור הנדרש.
      הערה: כדי להקטין את זמן הסריקה, לעתים קרובות קל יותר לאתר נוירונים העוקבים אחר מישור אחד, והתוצאה היא פחות אריחים.
   5. לזוג את סריקת האריח עם מחסנית Z, קבעו את המגבלות הנמוכות והעליונות לפני תחילת סריקת האריח, וודאו שגודל הפרוסה האופטימלי מוגדר.
   6. להבטיח רזולוציה ממוטבת, כמו פילוח יהיה מעודן יותר עם רזולוציות גבוהות יותר (כאן, ברזולוציה של 3224 x 3224 פיקסלים נעשה שימוש).
      הערה: בעוד uIs115 (Pmec-17:: tagRFP) transgene משמש כדי לסמן את plm ובהצלחה למקם את המצלמה, זה לא בהכרח צריך להיות מצולם בשל הזריחה ברקע קל נצפתה מן JsIs609 (pmec-4:: MLS:: gfp) בתוך האקסון של PLM. לפיכך, ניתן לצמצם את זמן הסריקה וההדמיה על-ידי הסרת מסנן 552 ננומטר מהניסוי.
2. מקטעי אובייקט באמצעות SQUASSH
   1. להמיר קבצי תמונה לתמונות . tiff וליצור הקרנות אינטנסיביות מקסימלית מ-Z-ערימות באמצעות תוכנת הדמיה של פיג'י. חתוך תמונות לגודל המינימלי תוך שהוא עדיין מכיל את תא העצב המלא כדי להפחית את העומס החישובית ולהפחית את רעשי הרקע.
      הערה: עבור תוצאות הנציג, רק המיטוטרים בתוך התהליכים הארוכים של האקסון נחשבו, כך גוף התא וכל המיטו, בתוך לא נכללו כל תמונה.
   2. בעזרת מאקרו הפסיפס SQUASSH עבור ImageJ, בצע פיצול ברגמן מפלח¹² על התחזיות המרביות. מדריך מפורט להתקנה וליישום של מאקרו זה זמין באתר הפסיפס (http://mosaic.mpi-cbg.de/) והמתואר על ידי ריזק ואח ' 2014¹³. התהליך של פילוח תמונה מתואר בקצרה להלן.
      הערה: פילוח זה מזהה אובייקטים (במקרה זה מיטוכונדניים בודדים) על הסף של עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית, ומאפשר מדידה מדויקת של כל גודל וצורה של אובייקטים בודדים.
   3. הסרת רעשי רקע מתמונה באמצעות שיטת הכדור המתגלגל, בה משתמש חלון המוגדר על-ידי המשתמש על-פני התמונה ומחזק את אומדן עוצמת הרקע המקומית מהעוצמה הנפוצה ביותר בכל חלון. פעולה זו מתקנת עוצמות רקע שאינן מכוונות.
   4. השתמש בזיהוי אובייקטים כדי למצוא בערך אזורים של התמונה המכילים אובייקטים (מיטוכונמיטוa) של עניין, בהתבסס על עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית ומספר הפיקסלים. הפרמטרים השולטים בשלב זה הם הסדרה ועוצמת העצם המינימלית.
      הערה: הסדרה משמש כדי למנוע הפחתת עוצמה קטנה, פסגות מושרה ברעש, ואת סף עוצמת העצם המינימלי מסייע להגדיר את האורגלים התאיים מפני הזריחה של רקמת הרקע. אלה הם שני הפרמטרים העיקריים כי הם מניפולציות כדי למצוא מפלח אופטימלי של המיטו, ואת תהליך האופטימיזציה נוטה להיות ניסוי וטעייה של פרמטרים שונים עבור תמונת מבחן, ואחריו בדיקה ידנית.
   5. השתמש בתוכנה כדי להעריך את עוצמות הרקע המקומיות סביב כל אובייקט כדי לסייע בחישוב של פילוח אופטימלי.
   6. מדידת עצמים בודדים עבור גודל, היקף, אורך באמצעות מספר פיקסל, כמו גם עוצמת אות ומיקום x/y על התמונה. כדי לחשב את המידות בגודל (nm), פקטור בגודל הפיקסל של התמונה המקורית.
      הערה: עבור כל ניסוי, יש לחשב תחילה פרמטרים אופטימליים. כדי להבטיח דיוק של פילוח, מומלץ לבצע ניתוח SQUASSH בתמונת מבחן ולבדוק באופן ידני את הדיוק של פילוח. המאקרו מספק קובצי פלט המציגים את האובייקטים הבודדים שזוהו על התמונה המקורית, ובודק את הפרמטרים הללו באופן מקרוב וכוונון לתביעה יבטיחו פילוח מדויק. יש להשתמש בפרמטרים המוגדרים עבור הניסוי כולו לצורך השוואת ההשוואה. הפרמטרים המשמשים עבור תוצאות הנציג נכללים בטבלה 2.
   7. פתח את תוכנת הניתוח של פיג'י או ImageJ, נווט אל מיכל המאקרו פסיפס ופתח את התפריט SQUASSH.
      1. פתח את תפריט המשנה ' חיסור רקע ' וודא שהסרת רקע? מסומנת. ברירת המחדל עבור גודל חלון היא 10.
      2. הגדר את עוצמת האובייקט הסדרה והמינימום הרצויה , ערוץ 1 ערכים לזיהוי ולאובייקטי מקטעים מהטובים ביותר (ראה שלב 6.2.4). אין צורך בערכי ערוץ 2 עבור אובייקטים המסומנים באמצעות העברה בודד.
      3. לחץ על PSF הערכה מתוך מאפיינים אובייקטיביים כדי להעריך את הפונקציה התפשטות נקודה בהתבסס על מאפייני המיקרוסקופ. הדבר מסייע לפילוח של אובייקטים ממוקמים באופן צמוד על-ידי חשבונאות להשפעה של כל פיקסל בפיקסל השכן שלו.
         הערה: לא נעשה שימוש בפילוח של פיקסל משנה בניסוי זה בשל העומס המוגבר בעוצמת העיבוד של המחשב. כמו כן, לא נעשה שימוש במסיכות תא כאשר האקסון מוגדר בקלות. הגדרות אלה שימושיות לרקמות מורכבות יותר ולהגדרת אובייקטים בתא לפי בסיס התא.
      4. לאפשרויות ויזואליזציה, ודא שקווי מתאר של אובייקט ושמירת אובייקט ומאפייני תמונה נבדקים. לשימוש מאוחר יותר בגרפיקה ובתוכנה סטטיסטית, ודא שמספר התנאים הנכון הוא קלט.
   8. אתר את התיקיה עם תמונות . tiff והפעל את המאקרו. ניתן לבצע תהליך זה על תמונה בודדת או על קבוצה של תמונות לכל סוג של גנוטיפ הממוקם בתוך תיקיה. קבצי פלט יהיה ממוקם בתיקיה יחד עם התמונות המקוריות.
3. ניתוח ומדידות צורה
   1. השתמש בפלט מ-SQUASSH כדי לספק קובץ נתונים . csv של אובייקט מפורט, המספק כל אובייקט בודד בכל שורה, כולל המידות שלו כמתואר לעיל.
      הערה: בעוד שתהליך מאקרו זה מבצע לאוטומטית מדידות אובייקט, חשוב תמיד לבדוק ידנית תמונות פלט לאחר פילוח SQUASSH כדי להבטיח שהמאקרו זיהה כראוי את המיטו,.
   2. כדי לנתח את הצורה של כל המיטו, להשתמש במדד דו מימדי לספרוגניות, מעגליות, כדי לאמוד את הסטייה של האובייקט ממעגל מושלם.
      הערה: מעגליות היא פונקציה של שטח והיקף (מעגליות = (4 x π) x (אזור/היקף²) שם 1 = עיגול מושלם 0 = קו ישר. ניתן להשיג זאת באמצעות נוסחה בגרפיקה ובתוכנה סטטיסטית.
   3. כדי לקבוע את השונות בגודל ובצורה על פני המאגר של המיטומטר, לחשב היסטורגרמות והתפלגות גאוסימלית מותאמת באמצעות גרפיקה ותוכנה סטטיסטית, עם סלים של 0.2 יקרומטר עבור גודל מיטוכונדריאלי ו 0.05 עבור מעגליות מיטוכונדריאלי.

תוצאות

ג. אלגיה הוא אורגניזם מודל אידיאלי ללימוד מורפולוגיה של רקמות ואורגלות שונות בשל פשטותו, השושלת הידועה של התאים, השקיפות והכלים הזמינים. כאן, אנו מספקים גישות כמותיים ללימוד אורגלים (למשל, המיטוa) ורקמות, כולל הסינפסות והשרירים באמצעות הדמיה של קרינה בשידור חי ותוכנו...

Discussion

וריאציות מורפולוגית העריכו לעתים קרובות באמצעות ספירה ידנית של הבדלים מורגש או שימוש בספי שרירותי כדי לקבוע פגמים בהשוואה לסוג פראי הפנוטיפים. לאחרונה, עם זאת, שיטות כמותיים שימשו למחקרים השוואתיים של המבנה כדי למדוד במדויק ולתאר שינויים ברמה התאית התאית בצורה לא משוחדת. היכולת לזהות הב?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar-agar	Merck	1.01614.1000
Agarose	Invitrogen	16500-500
Confocal microscope	Leica	TCS SP8	Inverted platform
Fluorescence microscope	Carl Zeiss AG	Zeiss Axio Imager M2
Glass coverslips #1	Thermo scientifique	MENCS22221GP
Glass coverslips #1.5	Zeiss	474030-9000-000	Made by SCHOTT
Glass slides	Thermo scientifique	MENS41104A/40
Light LED	Schott	KL 300 LED
Stereo Microscope	Olympus	SZ51
Tryptone (Peptone from casein)	Merck	107213	Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium
Yeast Extract	Merck	103753	Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium
Sodium chloride	Merck	106404	Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium
Peptone (Peptone from meat)	Merck	107214	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Agar	Sigma	A1296	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Sodium chloride	Merck	106404	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Cholesterol	Sigma	C8667-25G	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Calcium chloride	Merck	102382	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Magnesium sulfate	Merck	105886	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Dipotassium phosphate	Merck	105101	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Potassium dihydrogen phosphate	Merck	104873	Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Disodium phosphate	Merck	106586	Ingredients for M9 buffer
Sodium chloride	Merck	106404	Ingredients for M9 buffer
Potassium dihydrogen phosphate	Merck	104873	Ingredients for M9 buffer
Magnesium sulfate	Merck	105886	Ingredients for M9 buffer
Pasteur pipette	Corning	CLS7095D5X-200EA
Petri dishes	Corning	CLS430589-500EA
Platinum wire	Sigma	267201-2G
Spatula	Met-app	2616
Tetramisole hydrochloride	Sigma	L9756-5G