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요약

이 연구는 자유롭게 사용할 수있는 이미지 처리 도구를 사용하여 C. elegans에서 시냅스 크기와 현지화, 근육 형태 및 미토콘드리아 모양의 정량적 측정을 설명합니다. 이 접근은 C. elegans에 있는 미래 연구 결과가 유전 돌연변이 결과로 조직과 세포기관 구조 변경의 넓이를 정량적으로 비교하는 것을 허용합니다.

초록

근본적인 질병의 발달을 위한 세포 기계장치를 정의하는 것은 새로운 치료법의 발달을 위해 필수적입니다. 이 기계장치를 해명하기 위하여 빈번하게 이용되는 전략은 후보 유전자에 있는 돌연변이를 소개하고 조직과 세포 기관의 형태에 있는 변경을 질적으로 기술하기 위한 것입니다. 그러나, 질적 설명은 미묘한 표현형 차이를 포착하지 않을 수 있습니다, 인구에있는 개인에 걸쳐 표현형 변화를 잘못 표현 할 수 있습니다, 자주 주관적으로 평가된다. 여기서, 정량적 접근법은 시판되는 생체 이미지 처리 소프트웨어와 결합된 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 사용하여 선충 제대인 예쁜꼬마선충에서 조직 및 소기관의 형태를 연구하기 위해 기술된다. 시냅스 무결성에 영향을 미치는 표현형의 정량적 분석(크기 및 통합 형광 수준), 근육 발달(근육 세포 크기 및 미오신 필라멘트 길이), 미토콘드리아 형태(원형 및 크기)를 이해하기 위해 수행되었습니다. 이 세포 구조에 유전 돌연변이의 효력. 이러한 정량적 접근법은 선충뿐만 아니라 다른 모델 유기체에서 다른 조직 및 세포기관의 형태를 정량적으로 평가하는 데 쉽게 사용될 수 있기 때문에 여기에 기술된 응용 분야에 한정되지 않는다.

서문

선충 제 Caenorhabditis (C. 예쁜 꼬마)는 점점 인간 질병에 관련 된 생물학적 및 분자 과정을 밝히기 위해 모델 시스템으로 활용. 성인 선충은 몸 길이가 1mm에 불과하며 최대 300 개의 계란1의 큰 무리를 생성 할 수 있습니다. 부화 후, C. 예쁜 꼬마는 성인기에 도달하는 데 3-4 일이필요하며 2 주 에서 2 주 정도 살 수 있습니다. 배양의 용이성 으로 인해, C. elegans는 현재 인간 질병에 대한 치료법을 식별하기 위해 비용 효율적이고 신속한 약물 스크리닝을 수행하기위한 생체 내 동물 모델 중 가장 인기있는 모델 중 하나입니다. 또한, 그것의 유전 보존, 잘 정의 된 행동 패러다임, 형광 또는 가벼운 현미경 검사법에 대한 투명한 몸, 유전 조작의 용이성은 쉽게 유전자 돌연변이의 세포 및 분자 결과의 연구를 쉽게 달성 할 수 3. C. elegans 게놈은 인간 유전자와 약 60-80 %의 정형 외과를 공유하며, 그 유전자의 약 40 %는 질병과 관련된 것으로 알려져 있습니다. C. 예쁜꼬마선충에서 모델링되고 연구된 몇몇은 신경퇴행성 질환 (알츠하이머병, 파킨슨병, 근위축성 측삭 경화증, 샤르코-마리-투스 질환), 근육 관련 질환( Duchenne 근 이영양증), 및 대사 성질환 (고혈당증) 2,4. 대부분의 인간 장애에서, 질병 유도 된 세포 및 세포 국소화 및 형태 학적 변화가 발생, 이는 선충 모델에서 쉽게 평가 될 수있다.

형광 마커는 현미경의 밑에 동적 시각화를 위한 조직 및 세포기관을 표지하기 위하여 널리 이용되었습니다. 그러나, C. elegans에서는,유전 돌연변이 때문에 형태학적 불규칙성을 평가하는 전통적인 방법은 시각적인 설명에 크게 의존했습니다. 질적 평가는 현상형 설명의 넓은 범위를 커버 할 수 있지만 (시냅스 형태, GFP 응집, 특정 축삭 모양, 근육 섬유 두께, 기타) 형태 변화의 조감도를 제공, 그들은 덜 적합 다른 그룹에 걸쳐 작은 변화를 비교. 또한, 정성적 평가는 형태학적 이상에 대한 과대 평가 또는 과소 평가로 이어질 수 있는 시각적, 주관적 평가를 기반으로 합니다. 마지막으로, 정성적 관찰은 개인마다 크게 달라질 수 있으므로 데이터 복제에 어려움을 겪을 수 있습니다.

최근에는 이미지를 정량적으로 분석할 수 있는 사용자 친화적이고 쉽게 사용할 수 있는 여러 가지 계산 알고리즘이 개발되었습니다. 그러나, C. elegans 연구에서, 특히 바디 벽 근육 및 미토콘드리아와 관련하여 몇몇 형태학 연구를 위한 그 같은 심상 분석 소프트웨어의 이용은 뒤쳐졌습니다. C. elegans에있는 근본적인 구조 분석을 개량하기 위하여는, 쉽게 유효한, 오픈 소스 심상 분석 소프트웨어의 몇몇은 근육 미토콘드리아, 바디 벽 근육 및 시냅스에 대한 유전 돌연변이의 효력을 정량적으로 비교하기 위하여 시험되었습니다 형태학. 이러한 실험 절차는 이러한 프로그램(피지, ilastik, CellProfiler, SQUASSH)이 시냅스 크기 및 시냅스 단백질 국소화, 신체 벽 근육 영역 및 섬유질 길이, 및 미토콘드리아 크기의 변화를 평가하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 자세히 설명하고, 선충에 있는 유전 돌연변이 결과로 원형.

프로토콜

1. C. 예쁜꼬마선충 균주의 성장 및 유지 보수

  1. 종자 전충 성장 배지 (NGM, 재료표참조) 층류 캐비닛에서 천천히 성장하는 대장균 균주 OP50의 300 μL을 가진 한천 플레이트.
  2. NGM 한천 플레이트를 라미나 흐름 캐비닛에 두고 건조시면 됩니다.
    참고 : 층류 캐비닛이없는 경우, 플레이트는 벤치에 건조 남아있을 수 있지만 오염하는 경향이있다.
  3. 적어도 20마리의 동물을 OP50 시드 NGM 한천 플레이트 2개에 각각 옮겨 작업 재고를 갖도록 한다. 동물을 옮기는 방법에는 두 가지가 있습니다.
    1. 따기: 열 멸균 픽을 사용하여 동물을 부드럽게 들어 올립니다. 이 방법은 한천 판에서 개별 또는 여러 동물을 선택하는 데 효과적입니다. 따기 때 팁에 박테리아의 작은 긁힌 자국을 갖는 것은 전송하는 데 도움이됩니다.
      참고 : 선택은 유리 파이펫에 내장 된 약 4cm 길이의 백금 와이어의 작은 조각으로 만들어지며 와이어 팁은 '창처럼'평평해져 있습니다. 교차 오염을 방지하기 위해 피킹 사이의 선택을 열 멸균하십시오.
    2. 청크: 멸균 된 주걱을 사용하여 한 접시에서 동물을 포함하는 한천의 작은 사각형을 자르고 거꾸로 새 접시로 옮김.
      참고 : 이 방법은 일반적으로 많은 수의 웜을 옮기고 오염되지 않은 한천을 여러 차례 청크하여 플레이트에서 오염을 제거하는 데 유용합니다. 몇 초 동안 주걱을 불태우고 전송 사이에 100 % 에탄올에 주걱을 침지하여 교차 오염을 피하십시오. 굶주린 판에서 옮기는 것은 기아와 과밀이 세포 및 세포 및 세포 구조의 건강과 형태에 영향을 미칠 수 있기 때문에 권장되지 않습니다.
  4. 표준 성장 온도 (20 °C)에서 웜을 유지합니다. 잘 먹이 웜의 지속적인 공급을 보장하기 위해, 새로운 OP50 시드 플레이트에 웜을 전송 2~ 3 일마다.

2. 나이 동기화 C. 예쁜 꼬마

  1. 인구가 혼잡하지만 굶어 받지 않을 때까지 3-4 NGM 플레이트에 벌레를 유지하십시오.
  2. M9 용액으로 NGM 플레이트에서 웜을 부드럽게 씻으십시오. 그들은 대장균 OP50에충실하기 때문에 계란은 접시에 남아있을 것입니다. 부화한 동물을 모두 제거하기 위해 4개의 추가 세척 단계로 반복합니다.
  3. 벌레가 40분 동안 부화할 수 있도록 합니다.
  4. 접시에 1-2 mL의 M9 용액을 추가하고 부드럽게 소용돌이를 풀어 최근에 부화 한 웜을 느슨하게하십시오.
  5. 최근에 태어난 웜으로 M9 솔루션을 수집하고 웜으로 솔루션을 새로운 NGM 플레이트로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 더했습니다.
  6. NGM 플레이트를 공기에 노출시켜 M9 용액이 증발할 수 있도록 합니다. NGM 플레이트의 오염을 피하기 위해 화염에 인접한 이 작업을 수행하십시오.
  7. 20°C에서 27시간 동안 벌레를 성장시키면 제3애충(L3) 단계로 의 발달을 허용한다. 동기화 된 3 일 된 성인 동물의 경우, 벌레는 애벌레 단계 4에서 수확하고 3 일 동안 더 자라서 3 일 동안 성인 단계에 도달합니다.

3. 이미징용 슬라이드 준비

  1. 전자 레인지 안전 병 (초순수 100mL에 3-4g)에 아가로즈 스톡을 3-4 % 준비하십시오.
    참고: 한천은 아가로오스 대신에 같은 농도로 사용할 수 있습니다.
  2. 전자 레인지에 조심스럽게 아가로즈를 녹여 모든 아가로스가 용해 될 때까지 끓이지 않도록주의하십시오 (투명 용액). 응고를 방지하기 위해 용액을 70 °C로 유지하십시오.
    참고 : 아가로즈 주식은 여러 번 사용할 수 있습니다. 아가로즈가 굳어지면 사용하기 전에 다시 가열하십시오.
  3. 파스퇴르 파이펫을 사용하여 녹은 아가로스 한 방울을 현미경 슬라이드에 놓습니다.
    참고: 한천 한 방울에 기포가 떨어지면 패드의 무결성이 저하되지 않도록 하십시오.
  4. 즉시 다른 현미경 슬라이드와 아가로즈 방울을 눌러, 부드럽게 두 슬라이드 사이의 패드로 아가로스를 평평하게.
    참고: 남은 거품은 이 단계에서 제거해야 합니다. 그렇지 않은 경우 동물이 쉽게 거품에 갇히기 쉽기 때문에 새로운 슬라이드를 만들어야합니다. 슬라이드를 누를 때 한천이 옆으로 넘치지 않도록 하십시오.
  5. 아가로스를 1분 동안 말리십시오.
  6. 두 개의 슬라이드를 조심스럽게 분리하여 아가로즈의 손상을 방지하는 동시에 슬라이드 중 하나에 응고 패드를 남깁니다.
    참고: 아가로즈 패드가 있는 슬라이드는 실험 직전에 건조될 수 있기 때문에 항상 신선해야 합니다. 아가로즈 패드의 두께가 일정한지 확인하십시오. 이 이미징을 방해할 수 있기 때문에 패드에 기포 나 균열이 없어야합니다.
  7. 아가로즈 패드의 중앙에 0.05% 테트라미솔 염산염(마취제)의 작은 방울(5-10 μL)을 추가합니다.
  8. 열 멸균 픽을 사용하여 용액이 마르기 전에 스톡 플레이트에서 마취 액적으로 약 10 -15 마리의 동물을 빠르게 옮니다. 이 솔루션흐리게 너무 많은 OP50 박테리아를 전송 하지 마십시오, 이미징을 방해할 수 있는.
    참고 : 마취 용액이 피킹하는 동안 건조되면 동물에 0.05 % 테트라미 솔 염산염의 두 번째 방울을 피펫하십시오. 동물은 마취 용액의 측면 측면에 누워있는 경향이 있습니다.
  9. 아가로즈 패드 바로 위에 놓고 부드럽게 떨어뜨려 커버슬립을 바릅니다. 이것은 거품의 형성을 방지 할 수 있습니다. 동물을 분쇄할 수 있기 때문에 덮개 슬립에 압력을 가하지 마십시오.
  10. 슬라이드에 변형률 이름을 지정합니다.

4. 시냅스 형태 평가

참고: MEC-17의 과발현은 후방 측측 미세소관(PLM) 터치 수용체 뉴런에서 시냅스 무결성에 대한 과발현을 라인 스캐닝 공초점 현미경을 사용하여 시냅스 크기 및 국소화를 정량화하여 연구하였다. PLM 뉴런(시냅스 영역 포함)은 uIs115(Pmec-17::tagRFP) 이식 유전자(변형: TU4065 5)를 사용하여 시각화되었고 시냅스 영역은 jsIs37(Pmec-7:snb-1::GFP)으로 구체적으로 표지되었습니다(변형: NM664 6) . 본 연구는 경색혈 MEC-17 과발현 균주 BXN507[cjnEx036 (Pmec-4:mec-17, Pmyo-2:mCherry); jsIs37; uIs115;7의동기화된 L3 비형질성 및 형질전환 동물에서 수행되었다. 이 연구에 사용된 균주의 전체 목록은 표1에 포함되어 있습니다.

  1. 터치 수용체 뉴런 시냅스의 공초점 이미징
    1. 시냅스 영역을 이미지화하려면 488 nm 및 552 nm 광학 펌핑 반도체 다이오드 레이저에 결합된 라인 스캐닝 공초점 현미경을 사용하고 이미지 캡처 소프트웨어를 장착합니다.
    2. 가장 낮은 배율을 사용하여 웜을 찾습니다.
    3. 동물이 성공적으로 배치되면, 40배 배율로 전환하고 침지 배지를 적용합니다(본 연구에서는 40X/1.10 HC PL APO CS2 다중 몰입용 목표가 사용되었습니다).
    4. GFP 플루오로폴에 대한 488 nm 레이저(2% 전력)와 태그RFP 형광단에 대해 552 nm(1% 전력)로 형광단을 흥미롭게 하여 시냅스 영역을 시각화합니다.
    5. 전체 시 냅 스 영역을 캡처 하는 최적의 x 와 y 프레임을 결정 합니다. 프레임을 선택할 때 최적의 픽셀 크기를 고려해야 합니다. 본 연구에서는, 56 nm의 일관된 픽셀 크기를 얻었다.
    6. 하이브리드 광 검출기를 사용하여 이미지를 캡처하고 형광단의 과다 노출을 방지하기 위해 이득을 설정합니다 (488 nm 여기의 경우 100 %, 552 nm 여기의 경우 15 %).
    7. 사용된 특정 목표에 따라 최적의 z-step 크기를 사용하여 전체 시냅스를 커버하기 위해 z-stack 이미지를 수집합니다. 본 연구에서는 0.211 nm의 최적 z-스텝 크기를 사용했습니다.
      참고: 통합 형광 정량화 및 비교가 허용되도록 모든 이미지가 엄격한 조건에서 촬영되었는지 확인합니다. 이는 캡처된 모든 이미지(예: 레이저 및 검출기 설정, 픽셀 크기, 스캔 속도 및 최적의 z-step 크기)에서 현미경 파라미터를 동일하게 유지하여 수행할 수 있습니다. 최적의 설정은 목표에 따라 다르며 나이퀴스트 계산기(https://svi.nl/NyquistCalculator)와 같은 접근 가능한 생물정보학 프로그램을 사용하여 계산할 수 있습니다. 체계적으로 이미지를 레이블, 이것은 구성하고 파일 이름을 기반으로 파일을 처리하는 생물 정보학 소프트웨어를 사용할 때 유용합니다.
  2. 시 냅 스 영역의 정량화
    1. 시냅스 영역을 분석하려면 이미지를 TIFF 파일로 내보냅니다. ImageJ와 같은 자바 기반 이미징 프로세싱 소프트웨어는, 사용될 수 있다(본 연구에서는, ImageJ에서 MRI 영상 변환 매크로가 사용되었다).
    2. 시냅스의 크기 및 통합형형광강도 수준은 CellProfiler-3.1.5를 사용하여 얻은 z-스택의 합 강도로부터 측정하였다. 이미지를 CellProfiler3.1.5 소프트웨어에 로드합니다. 필요한 경우 이미지 파일 이름을 기반으로 이미지를 필터링할 수 있습니다.
    3. 이름 및 유형 모듈을 설정합니다. 선택적으로 이미지 레이블에서 메타데이터를 추출하여 계산된 데이터를 적절하게 구성합니다.
    4. uIs115(Pmec-17:tagRFP) 이식유전자로부터 발현된 확산 태그RFP를 사용하여 이 영역의 손으로 정의함으로써 시냅스 영역을 결정한다. 이 작업은 관련 모듈을 CellProfiler-3.1.5 파이프라인에 추가하여 수행할 수 있습니다.
    5. 손으로 정의된 시냅스의 크기와 형광을 측정하려면 개체 크기 및 모양 측정을 추가하고 개체 강도 모듈을 파이프라인에 측정합니다.
    6. 수학 계산 모듈을 추가하여 상대 적재형 형광 강도를 계산합니다. uIs115(Pmec-17:tagRFP)에대해 얻은 통합 단위로 jsIs37(Pmec-7:snb-1:GFP)에서 얻은 통합 강도 단위를 나눕니다.
    7. 내보내기 측정 및 계산.

5. 체내 벽 근육 구조 정량화

  1. 신체 벽 근육 구조의 형광 이미징
    1. 이식 유전자 stEx30(Pmyo-3:gfp::myo-3 + rol-6(su1006))을운반하는 균주(예를 들어, RW1596)를 구하고, 이는 GFP로 미오신 섬유를 라벨을 붙인다.
      참고 : 동물로의 이식 유전자의 도입은 이미 이식 유전자를 발현하는 동물과 관심의 변형을 교차하거나 고나드의 말단 암에 DNA를 마이크로 주입함으로써 달성 될 수 있습니다. 이 이식유전자에서 rol-6 돌연변이에 의해 유도된 '압연' 표현형은 근육의 시각화를 용이하게 한다. 바디 벽 근육은 일반적으로 그들의 측면 측의 한에 있기 때문에 야생 형 동물의 보기에서 일반적으로 배제되는 등쪽과 복부 측을 따라 실행됩니다. rol-6(su1006) 알레일은 동물의 비틀림을 유도하여 이미징을 위한 일부 근육 세포를 노출시다.
    2. 고해상도 충전 된 결합 장치 카메라 (CCD), 40X 목표 이상, GFP 필터 및 획득 소프트웨어와 결합된 형광 현미경을 사용하여 동물을 이미지화.
    3. 노출 시간 및 조명 강도를 조정하여 과포화 이미지를 방지합니다.
    4. 적어도 하나의 완전한 가시 경사 근육 세포를 포함하는 동물의 섹션에서 근육 (400배 배율)의 이미지를 캡처하고 저장합니다. 불완전하거나 초점이 벗어난 단면도 근육 세포가 있는 지역을 피하십시오. 또한 극단적 인 전방 및 후방 영역, 외음부에 인접한 영역에서 이미지를 제외합니다.
      참고: 동물에게 완전한 근육 세포가 하나도 없는 경우 커버슬립을 부드럽게 밀어 동물을 돌려 완전한 세포를 노출시십시오.
  2. 근육 세포 영역의 측정
    1. 피지 소프트웨어 9에서 이미지를 엽니 다 (버전 2.0.0이 연구에서 사용되었다).
    2. 다각형 선택을 사용하여 단일 경사 근육 셀 주위를 조심스럽게 추적합니다. 추적을 개선하기 위해 앵커 점을 드래그하여 끝에 있는 다각형의 선을 조정합니다.
    3. 소프트웨어 상단의 분석 탭으로 이동하여 측정값을 클릭하여 선택 영역을 계산합니다. 면적 및 기타 측정값을 포함하는 별도의 결과 표가 표시됩니다. 결과 테이블에서 영역 측정값이 누락된 경우 분석 탭 아래의 측정 설정으로 이동하여 영역 확인란이 선택되었는지 확인합니다. 마찬가지로 필요하지 않은 다른 측정값을 선택 취소합니다.
    4. 퇴화/누락된 영역이 있는 근육 세포의 경우 다각형 선택 도구를 사용하여 누락된 영역을 추적하고 다시 측정을 클릭합니다. 셀 내에 여러 간격이 있는 경우 각 간격을 개별적으로 추적합니다.
    5. 전체 단일 근육 셀에 대한 간격 영역의 비율을 계산합니다. 높은 비율은 세포 내의 큰 간격 때문에 근육 변성의 더 높은 범위를 나타냅니다. 야생형 동물에서 흔일반적으로 볼 수 있듯이 누락된 영역이 없는 경우 비율은 0으로 계산됩니다.
      참고: 대조군으로서, 근육 구조 결함에 대한 점수는 시각적으로 도표로 하고 결과를 정량적 측정과 비교한다. 이것은 균주가 실험실에서 처음으로 연구되는 경우에 특히 유용합니다. 표현형 채점의 경우, 필라멘트의 무결성에 따라 동물을 결함이 있거나 결함이 없는 것으로 평가합니다. 예를 들어, 뚜렷한 필라멘트 줄무늬, GFP 응집, 또는 구조적 고장으로 인한 근육 세포 내의 간격이 있는 동물은 결함으로 채점될 것입니다.
  3. 미오신 섬유 길이의 세분화 및 정량화
    1. 필요한 경우 먼저 파일을 로 변환합니다. 피지 또는 다른 소프트웨어 패키지를 사용하여 tif. TIFF 파일을 원하는 위치에 저장합니다.
    2. 열기 ilastik10 (무료 소프트웨어, 버전 1.3.2 https://www.ilastik.org/ 다운로드 할 수 있습니다).
    3. ilastik에서 새 프로젝트 만들기에서 픽셀 분류를 선택합니다. 소프트웨어가 프로젝트를 저장하라는 메시지를 표시합니다. 프로젝트 이름을 변경하고 원하는 위치에 저장합니다.
      참고: 새 프로젝트는 한 번만 만들어야 합니다. 후속 세분화는 동일한 프로젝트를 사용하여 수행할 수 있습니다. 동일한 프로젝트 설정을 사용하려면 상단의 프로젝트 탭으로 이동하여 프로젝트 열기를 클릭하여 프로젝트 파일에 액세스합니다.
    4. 왼쪽 패널에는 5개의 탭(입력 데이터, 기능 선택, 교육, 예측 내보내기 및 배치 처리)이 있어야 합니다. 입력 데이터 탭에서 새 추가를 클릭한 다음 별도의 이미지 추가를 클릭합니다. 팝업 창을 TIFF 파일이 포함된 폴더로 이동한 다음 열 이미지를 선택합니다.
    5. 아래 의 다음 탭 (기능 선택)에서 기능 선택을 클릭하여 녹색 선택 상자로 표시된 모든 픽셀 피처를 선택합니다. 이 단계의 픽셀 선택은 다음 단계에서 다양한 픽셀 클래스를 구분하는 데 사용됩니다.
      참고: 픽셀 기능 선택은 이미지 해상도에 따라 다릅니다. 따라서 개발자는 처리 능력과 시간이 허용되는 경우 가능한 한 많은 기능을 선택하도록 제안합니다.
    6. 다음 교육 패널에서는 픽셀을 기반으로 다양한 개체 클래스를 분류할 수 있습니다. 이 경우, 두 클래스는 개별 GFP 표현 myosin 필라멘트 및 원치 않는 배경 또는 흐린 가장자리이다. 레이블 추가를 클릭하여 첫 번째 레이블을 지정합니다. 분류자 훈련을 시작하기 위해 필라멘트의 숫자를 통해 크롤링.
      참고: 레이블을 두 번 클릭하면 이름을 변경할 수 있습니다(예: '레이블 1'을 '필라멘트'로 이름 바꾸기). 색상 상자를 두 번 클릭하면 드로잉 및 확률 표시의 색상을 변경할 수 있습니다. 페인트 브러시의 기본 크기는 1이지만 크기는 61로 늘릴 수 있습니다. 잘못된 픽셀이 그려진 경우 지우개 도구를 사용하여 도면을 제거하면 됩니다. 키보드 컨트롤(-) 및 (Shift +)을 사용하여 이미지를 확대 및 축소할 수 있습니다. 화살표 키는 이미지 주위를 탐색하는 데 사용됩니다.
    7. 두 번째 레이블을 추가하고 배경을이름으로 바꿉니다. 필라멘트 사이의 원치 않는 배경과 공간을 스크롤링합니다.
    8. 라이브 업데이트를 클릭하고 소프트웨어에서 분류가 올바르게 수행되었는지 확인합니다. 크롤링을 더 추가하고 필요한 경우 교육을 미세 조정합니다.
      참고: 이 단계에서는 병합된 섬유와 흐릿한 가장자리(예: 본선)를 주의 깊게 유지하는 것이 중요합니다. 측정의 정확도를 높이기 위해 여기에서 가능한 한 예측을 개선합니다. 낮은 품질의 이미지의 픽셀은 구분하기가 더 어렵기 때문에 예측 정확도는 이미지 해상도에 따라 달라집니다. 또한 선택 사항이지만 라이브 업데이트 컨트롤 옆에 있는 기능 제안 함수에서 필터 메서드를 실행하는 것이 좋습니다.
    9. 교육 분류기가 적절하게 수행되면 예측 내보내기 패널로 이동하십시오. 확률을 소스로 내보내기 이미지 설정 선택을 클릭합니다.
    10. 다음 설정을 사용합니다. 잘라내기 하위 영역 x 및 y를 체크하고 c를 선택 해제합니다. c의 시작 및 중지 값은 각각 0과 1이어야 합니다. 변환에서 데이터 형식을 선택 및 변환하여 서명되지 않은 8비트로 변환하고, 틱 [최소, 최대]를 다시 정규화하고 기본값을 사용합니다. 출력 파일 비디오의 형식을 PNG로 변경하고 원하는 대로 파일 및 디렉터리 이름을 바꿉니다.
    11. 내보내기 설정 창을 닫고 방금 분할된 특정 이미지를 내보냅니다.
    12. 피지 소프트웨어에서 저장된 PNG 이미지를 엽니다. 이미지가 흑백으로 표시되어야 합니다.
    13. 기본 설정을 사용하여 이미지의 임계값을 조정합니다.
    14. 스켈레톤 화 플러그인을 적용합니다(스켈레톤화 2D/3D, 다음 스켈레톤 분석). 분기 길이를 포함하는 별도의 결과 테이블이 표시됩니다. 분기 길이는 섬유 길이를 나타냅니다. 결과의 다른 데이터도 유클리드 거리와 같은 유용할 수 있습니다.
      참고: 이 크기는 생리적으로 가능하지 않기 때문에 길이가 0 μm 이상 또는 250 μm 이상의 섬유를 생략하십시오.

6. 미토콘드리아 형태 정량화

참고: 미토콘드리아 형태정량화를 위해, 이 연구는 uIs115(Pmec-17::tagRFP)를 포함하는 BXN0387 균주를 사용하여 PLM 뉴런과 jsIs609(Pmec-4:MLS::GFP)11을 시각화했습니다. 특히 PLM 뉴런 내에서 미토콘드리아를 시각화합니다. 이 연구는 동기화 된 3 일 된 성인 벌레에서 수행 되었다, 하지만 성공적으로 다른 나이에 수행 되었습니다., 뿐만 아니라 다른 조직에서7.

  1. PLM 뉴런 내의 미토콘드리아의 형광 이미징
    1. PLM 뉴런 내에서 미토콘드리아의 크기와 모양 변화를 측정하려면 형광 성 전유전자를 사용하여 배경 뉴런과 미토콘드리아를 시각화합니다.
    2. PLM 뉴런을 이미지화하려면 488 nm 및 552 nm 광학 펌핑 된 반도체 다이오드 레이저에 결합된 공초점 현미경을 사용하고 이미지 캡처 소프트웨어를 장착합니다.
    3. 위의 4.1.1-4.1.4 단계에 따라 웜을 이미지화하여 포화되지 않은 노출 조건을 보장합니다.
    4. 전체 뉴런을 시각화하기 위해 타일 이미지가 필요할 수 있습니다. 이를 위해 타일 스캔 옵션이 있는 소프트웨어를 사용하여 뉴런의 한 쪽 모서리에 마커를 찾아 놓은 다음 반대쪽 끝을 찾아 다른 마커를 놓습니다. 소프트웨어는 필요한 영역을 캡처하는 데 필요한 타일의 최적의 수를 계산합니다.
      참고: 스캔 시간을 줄이기 위해 단일 평면을 따르는 뉴런을 찾는 것이 더 쉬워지므로 타일수가 줄어듭니다.
    5. 타일 스캔을 Z 스택과 결합하려면 타일 스캔을 시작하기 전에 하한및 상한을 설정하고 최적의 슬라이스 크기가 설정되어 있는지 확인합니다.
    6. 세분화가 더 높은 해상도로 더 세분화될 수 있도록 해상도를 최적화합니다(여기서는 3224 x 3224 픽셀의 해상도가 사용됨).
      참고: uIs115(Pmec-17::tagRFP) 이식 유전자는 PLM을 표시하고 카메라를 성공적으로 배치하는 데 사용되지만 jsIs609(Pmec-4:MLS::GFP)에서 관찰된 약간의 배경 형광으로 인해 반드시 이미지화될 필요는 없습니다. PLM 축색 자체 내에서 이식유전자를 이식합니다. 따라서, 실험으로부터 552 nm 필터를 제거함으로써 스캐닝 및 이미징 시간을 줄일 수 있다.
  2. SQUASSH를 사용한 오브젝트 세분화
    1. 피지 이미징 소프트웨어를 사용하여 이미지 파일을 .tiff 이미지로 변환하고 Z 스택에서 최대 강도 투영을 생성합니다. 전체 뉴런을 포함하면서 이미지를 최소 크기로 자르면 계산 부하를 줄이고 배경 잡음이 줄어듭니다.
      참고 : 대표적인 결과를 위해 긴 축색 과정 내의 미토콘드리아 만 고려되었기 때문에 세포 체와 미토콘드리아 내의 미토콘드리아는 각 이미지에서 제외되었습니다.
    2. ImageJ에 대한 모자이크 스위트 SQUASSH 매크로를 사용하여 최대 투영에서 분할 브레그맨 분할12를 수행합니다. 이 매크로의 설치 및 응용 프로그램에 대한 자세한 가이드는 모자이크 웹 사이트 (http://mosaic.mpi-cbg.de/)에서 사용할 수 있으며 Rizk 등 201413에의해 설명됩니다. 이미지 세분화 과정은 아래와 같습니다.
      참고: 이 세분화는 형광 강도의 임계값을 초과하여 객체(이 경우 개별 미토콘드리아)를 식별하여 각 개별 개체의 크기와 모양을 정확하게 측정할 수 있도록 합니다.
    3. 사용자가 정의한 창이 이미지를 가로질러 이동하는 롤링 볼 방법을 사용하여 이미지에서 배경 노이즈를 제거하여 각 창에서 가장 자주 발생하는 강도에서 로컬 배경 강도 추정값에 대한 대칭을 부여합니다. 이렇게 하면 고르지 않은 배경 강도가 수정됩니다.
    4. 개체 감지를 사용하여 형광 강도 및 픽셀 수에 따라 관심 있는 개체(미토콘드리아)가 포함된 이미지 영역을 대략으로 찾습니다. 이 단계를 제어하는 매개 변수는 정규화 및 최소 개체 강도입니다.
      참고: 정규화는 작은 강도, 소음 유발 피크를 분할하는 것을 피하기 위해 사용되며, 최소 개체 강도 임계값은 배경 조직 형광에서 세포소기관을 정의하는 데 도움이됩니다. 이들은 미토콘드리아의 최적 세분화를 찾기 위하여 조작되는 주요 2개의 매개변수이고, 최적화 프로세스는 수동 검사에 선행된 시험 심상에 대한 다른 매개변수의 시행착오인 경향이 있습니다.
    5. 소프트웨어를 사용하여 각 개체 주위의 로컬 배경 강도를 추정하여 최적의 세분화 계산을 돕습니다.
    6. 픽셀 번호를 통한 크기, 둘레, 길이, 이미지의 신호 강도 및 x/y 위치에 대한 개별 개체를 측정합니다. 크기(nm)의 측정값을 계산하려면 원본 이미지의 픽셀 크기를 계수합니다.
      참고: 각 실험에 대해 최적의 매개변수를 먼저 계산해야 합니다. 세분화의 정확성을 보장하려면 테스트 이미지에서 SQUASSH 분석을 수행하고 세분화의 정확도를 수동으로 검사하는 것이 좋습니다. 매크로는 원본 이미지에서 식별된 개별 개체를 보여주는 출력 파일을 제공하며 이러한 개체를 면밀히 검사하고 매개 변수를 조정하면 정확한 세분화가 보장됩니다. 그런 다음 비교가능성을 위해 전체 실험에 정의된 매개변수를 사용해야 합니다. 대표 결과에 사용되는 매개 변수는 표2에 포함되어 있습니다.
    7. 피지 또는 ImageJ 분석 소프트웨어를 열고 모자이크 매크로 컨테이너로 이동하여 SQUASSH 메뉴를 엽니다.
      1. 배경 빼기 빼기 메뉴를 열고 배경 제거를 선택합니다. 창 크기의 기본값은 10입니다.
      2. 원하는 정규화 및 최소 오브젝트 강도, 채널 1 값을 설정하여 객체를 가장 잘 식별하고 세그먼트화합니다(6.2.4 단계 참조). 단일 이식유전자로 표시된 개체에는 채널 2 값이 필요하지 않습니다.
      3. 객관적인 특성에서 PSF 추정을 클릭하여 현미경의 특성에 따라 포인트 확산 함수를 추정합니다. 이렇게 하면 각 픽셀이 인접한 픽셀에 미치는 영향을 고려하여 밀접하게 위치한 개체를 세분화하는 데 도움이 됩니다.
        참고: 컴퓨터 처리 능력의 부하증가로 인해 이 실험에서는 하위 픽셀 세분화가 사용되지 않았습니다. 셀 마스크는 축세포가 용이하게 정의됨에 따라 서도 사용되지 않았다. 이러한 설정은 보다 복잡한 조직에 유용하며 세포 단위로 개체를 정의하는 데 유용합니다.
      4. 시각화 옵션의 경우 개체 윤곽선을 확인하고 개체 및 이미지 특성 저장을 선택합니다. 나중에 그래픽 및 통계 소프트웨어에서 사용하려면 정확한 조건 수가 입력되었는지 확인하십시오.
    8. .tiff 이미지가 있는 폴더를 찾아 매크로를 실행합니다. 이 프로세스는 개별 이미지 또는 폴더 내에 있는 유전자형별 이미지 배치에서 수행할 수 있습니다. 출력 파일은 원본 이미지와 함께 폴더에 있습니다.
  3. 형상 분석 및 측정
    1. SQUASSH의 출력을 사용하여 위에서 설명한 대로 측정을 포함하여 행당 각 개별 개체를 제공하는 항목별 개체 데이터 .csv 파일을 제공합니다.
      참고: 이 매크로 프로세스는 개체 측정을 자동화하지만 SQUASSH 분할 후 출력 이미지를 수동으로 확인하여 매크로가 미토콘드리아를 올바르게 식별했는지 확인하는 것이 항상 중요합니다.
    2. 각 미토콘드리아의 모양을 분석하려면 구도, 원형에 대한 2차원 측정값을 사용하여 완벽한 원에서 개체의 편차를 추정합니다.
      참고: 원형은 면적 및 둘레(원형 = (4 x π)x (영역/둘레 2) 여기서 1 = 완벽한 원및 0 = 직선의 함수입니다. 이는 그래픽 및 통계 소프트웨어의 수식을 사용하여 달성할 수 있습니다.
    3. 미토콘드리아 풀의 크기와 모양 차이를 확인하려면 미토콘드리아 크기의 경우 0.2 μm, 미토콘드리아 원형의 경우 0.05μm의 빈으로 그래픽 및 통계 소프트웨어를 사용하여 히스토그램과 장착된 가우시안 분포를 계산합니다.

결과

C. 예쁜꼬마선충은 단순성, 알려진 세포 계수, 투명성 및 사용 가능한 도구로 인해 다양한 조직 및 세포기관의 형태를 연구하기위한 이상적인 모델 유기체입니다. 여기에서는 살아있는 형광 이미징 및 무료 생체 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 시냅스와 근육을 포함한 세포기관(예: 미토콘드리아) 및 조직을 연구하기 위한 정량적 접근법을 제공합니다.

토론

형태학적 변화는 눈에 띄는 차이의 수동 계산을 통해 자주 평가되거나 야생 형 표현형에 비해 결함을 결정하기 위해 임의의 임계값을 사용하여 평가되었습니다. 그러나 최근에는 형태학의 비교 연구를 통해 세포 및 세포 내 하위 수준변화를 편견 없는 방식으로 정확하게 측정하고 설명하는 정량적 방법이 사용되고 있습니다. 표현형 간의 미묘하면서도 생물학적으로 관련된 차이를 식별하는 능력...

공개

저자는 경쟁적인 이해관계가 없다고 선언합니다.

감사의 말

노이만 연구소의 회원들에게 귀중한 토론과 의견을 주신 것에 감사드립니다. 일부 균주는 연구 인프라 프로그램의 NIH 사무실 (P40 OD010440)에 의해 투자되는 CGC에 의해 제공되었다. 저자는 C. 예쁜 꼬마에대한 풍부한 정보에 대한 WormBase 감사, 모나시 마이크로 이미징인정, 모나시 대학, 계측의 제공에 대한, 교육 및 기술 지원. 이 작품은 CMTAA 연구 보조금 (2015 및 2018)에 의해 지원되었으며, NHMRC 프로젝트 보조금 1101974 및 1099690 B.N에 수여.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Agar-agarMerck1.01614.1000
AgaroseInvitrogen16500-500
Confocal microscopeLeicaTCS SP8Inverted platform
Fluorescence microscopeCarl Zeiss AGZeiss Axio Imager M2
Glass coverslips #1Thermo scientifiqueMENCS22221GP
Glass coverslips #1.5Zeiss474030-9000-000Made by SCHOTT
Glass slidesThermo scientifiqueMENS41104A/40
Light LEDSchottKL 300 LED
Stereo MicroscopeOlympusSZ51
Tryptone (Peptone from casein)Merck107213Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium
Yeast ExtractMerck103753Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium
Sodium chlorideMerck106404Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium
Peptone (Peptone from meat)Merck107214Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
AgarSigmaA1296Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Sodium chlorideMerck106404Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
CholesterolSigmaC8667-25GIngredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Calcium chlorideMerck102382Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Magnesium sulfateMerck105886Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Dipotassium phosphateMerck105101Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Potassium dihydrogen phosphateMerck104873Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Disodium phosphateMerck106586Ingredients for M9 buffer
Sodium chlorideMerck106404Ingredients for M9 buffer
Potassium dihydrogen phosphateMerck104873Ingredients for M9 buffer
Magnesium sulfateMerck105886Ingredients for M9 buffer
Pasteur pipetteCorningCLS7095D5X-200EA
Petri dishesCorningCLS430589-500EA
Platinum wireSigma267201-2G
SpatulaMet-app2616
Tetramisole hydrochlorideSigmaL9756-5G

참고문헌

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