قياس نشاط الكيتيناز في العينات البيولوجية

Summary

المعروضة هنا هي طريقة بسيطة لقياس نشاط الكيتيناز في السوائل البيولوجية مثل غسل القصبات الهوائية أو المصل.

Abstract

الكيتيناسيس هي الإنزيمات التي تلتشق الكيتين. حتى في غياب الكيتين، الثدييات لديها كميات كبيرة من الكيتيناالموجودة في الجسم بما في ذلك في خط الأساس. لا يعرف الدور الدقيق للكيتيناز، ولكن كان يعتقد أن تلعب دورا هاما في الهضم والدفاع المضيف ضد المواد الغذائية التي تحتوي على الكيتين ومسببات الأمراض، على التوالي. وقد أظهرت الأعمال الأخيرة، بما في ذلك عملنا، دورا هاما من البروتينات مثل الكيتيناز والكيتينا في الحصانة المضيفة وأمراض الحساسية. الأهم من ذلك، أنشطة الكيتيناز بمثابة علامات حيوية هامة لشدة المرض في مجموعة واسعة من الأمراض بما في ذلك الأمراض الالتهابية من النوع 2 مثل الربو والتليف الرئوي. وبالمثل، فإن المرضى الذين يعانون من اضطرابات وراثية مثل مرض Gaucher قد ارتفعت بشكل ملحوظ مستويات الكيتيناز، والتي لا ترتبط فقط مع شدة المرض ولكن أيضا بمثابة علامة حيوية موثوق بها للفعالية العلاجية. يصف البروتوكول الموضح هنا طريقة بسيطة وسريعة ومباشرة لقياس نشاط الكيتيناز في BAL أو عينات المصل من الفئران ويمكن تكييفها على نطاق واسع مع البشر والكائنات الحية النموذجية الأخرى بسبب الطبيعة المحفوظة للغاية للإنزيمات.

Introduction

الكيتين هو ثاني أكثر السكاريد وفرة على الأرض بعد السليلوز، وهو بمثابة مكون هيكلي رئيسي لمجموعة متنوعة من الكائنات الحية بما في ذلك الهيكل الخارجي للحشرات والفطريات والخميرة والطحالب. بعض الفقاريات لديها أيضا الكيتين¹. الكيتيناسيس هي عائلة من الإنزيمات التي هي قادرة على كسر الكيتين ويتم حفظها بشكل كبير في جميع أنحاء التطور في الأنواع التي تتراوح بين البكتيريا والثدييات^2،3. بالإضافة إلى الكيتيناسيس ، الثدييات لديها أيضا البروتينات الشبيهة الكيتينازي التي تشبه الكيتيناسيس في قدرتها على ربط الكيتين ولكنها تختلف من حيث أنها تفتقر إلى القدرة الأنزيمية على شق الكيتين⁴.

على الرغم من أن الكيتين والكيتيناقد قد تمت دراستهما منذ فترة طويلة - مع التحقيقات التي يعود تاريخها إلى أوائل عام 1900 - كان التركيز الرئيسي على دورها في الحشرات واللافقاريات الأخرى. في الواقع، لم يكن حتى 1960s عندما تم العثور على الفقاريات أن يكون الكيتينا على الإطلاق. باستخدام إجراء بفحص قائم على الشيتوية، تبين أن الكيتيناس موجود في الجهاز الهضمي لعدد من الفقاريات بما في ذلك السحالي والطيور السوداء - وهي ملاحظة يفترض أنها ترجع إلى استهلاك الكائنات التي تحتوي على الكيتين مثل الحشرات⁵ .

الثدييات لها شكلان نشطان من الكيتيناز الأنزيمية: الكيتيناز الثدييات الحمضية (AMCase؛ المعروف أيضا باسم CHIT2 وCHIA) وchitotriosidase (CHIT1)⁴. كل من هذه البروتينات قادرة على تحلل الكيتين. ومع ذلك، CHIT1 هو أكثر نشاطا الأنزيمية في البشر، حيث تقريبا كل من نشاط الكيتيناز مشتق من CHIT1. ⁴ في الفئران، كل من Chit1 وAMCase تسهم على قدم المساواة تقريبا في النشاط الكيتينازي العام⁶. من ناحية أخرى، البروتينات الشبيهة الكيتيناز تفتقر إلى نشاط الكيتيناز.

تفرز Chit1 أساسا من قبل الضامة وغالبا ما تعتبر استجابة مناعية لمسببات الأمراض التي تحتوي على الكيتين⁷. وقد ثبت أيضا أن الإنزيم تشارك في نضج الخلايا الأحادية في كل من M1 و M2 الأنواع الفرعية الضامة، حتى من دون وجود الكيتين الركيزة⁸. وعلاوة على ذلك، فإنه قد تشارك أيضا في نضج الخلايا المناعية الأخرى بما في ذلك T مساعد نوع 2 (Th2) الخلايا والحمضات - كما تبين أن يكون الحال في عدوى الرئة cryptococcal⁹. وتشير هذه الدراسات إلى دور معقد من الكيتيناسيس في الجهاز المناعي.

في السنوات الأخيرة، تم العثور على مستويات Chit1 لتكون بمثابة علامة حيوية هامة للتقدم لأكثر من 40 أمراض بشرية مختلفة بما في ذلك أمراض التخزين الليسوسومية، والأمراض المعدية، وأمراض الجهاز التنفسي، وأمراض الغدد الصماء، والقلب والأوعية الدموية الأمراض، والأمراض العصبية، وغيرها (استعرض^10). في العديد من هذه الأمراض، ومستويات Chit1 هي توقع قوي لشدة المرض والفعالية العلاجية¹⁰.

كما اكتسبت الكيتينا سمعة كعلامة حيوية للعديد من الحالات الطبية بما في ذلك مرض Gaucher، وقد وضعت أدوات واختبارات لتسهيل اختبار وجود الكيتيناز. وتشمل الأساليب القديمة إجراء Schales، بروتوكول تكييفها من اختبار الجلوكوز في الدم، وطريقة حمض الدينتيروساليك 3،5 (DNS). ومع ذلك، فإن هذه الأساليب غالبا ما تكون حساسة للوقت وصعبة من الناحية التقنية¹¹. يتطلب الإجراء لكلا الاختبارين الحد من المواد المؤكسدة غير العضوية، الفيريسيد في حالة إجراء Schales على سبيل المثال، مما يؤدي إلى تغيير اللون الذي لا يمكن قياسه إلا من حيث الطيف. بالإضافة إلى ذلك، كلا الاختبارين ينطوي على التدفئة أو خطوة الغليان التي تستغرق وقتا طويلا وضرورية للون لتطوير^12،13.

وصف هنا هو اختبار الفلورة سريعة وبسيطة لتحديد مستويات الكيتينازي في عينات الثدييات^14،15. اثنين من العينات المستخدمة هنا تشمل المصل وسوائل غسل القصبات الهوائية (BAL)؛ كما تم قياس نشاط الكيتيناز في عينات حليب الثدي والبول، ويمكن إجراء هذه التقنية في هذا النوع من العينات وكذلك في أي سائل بيولوجي آخر^16،17.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

وقد أجريت جميع الإجراءات الحيوانية بموجب بروتوكول وافق عليه المركز في كلية الطب بجامعة ييل.

1. مجموعة عينة الماوس

1. التخدير
   1. تخدير الفئران باستخدام الكيتامين والإكسلازين (100 ملغ/كغ من الكيتامين و10 ملغ/كغ من إكسلازين).
2. جمع عينات الدم
   1. تأكد من عمق التخدير بعدم الاستجابة لقرصة اصبع القدم.
   2. فتح تجويف الصدر جراحيا لفضح القلب.
   3. أدخل إبرة 26.5 غرام في البطين الأيسر وجمع الدم في حقنة.
      ملاحظة: عادة، يمكن حصاد حوالي 0.5-1 مل من الدم من فأر صحي 20-25 غرام.
   4. جمع الدم في أنابيب الهيبارية، لجمع البلازما، أو أنابيب غير الهيبارية لجمع المصل.
3. مجموعة من سائل غسل القصبات الهوائية (BAL)
   1. لجمع BAL، وجعل قطع عمودي على الرقبة لفضح القصبة الهوائية.
   2. قم باستئصال القصبة الهوائية بقسطرة 22 G وتأمينها بقوة باستخدام سلسلة من أجل منع التسرب من أنف الماوس.
   3. حقن ببطء اثنين من aliquots من محلول الفوسفات المعقمة المخزنة بالوقود (PBS، 0.75 مل لكل منهما) في الرئتين عن طريق القصبة الهوائية واسترداد مرة أخرى.
   4. تجمع aliquots والحفاظ على الجليد لمزيد من التحليل.
4. معالجة العينات البيولوجية.
   1. عينة الدم: إما طازجة (البلازما) أو بعد السماح التخثر لمدة 4 ح (المصل)، الطرد المركزي في 600 × ز لمدة 10 دقائق. خذ supernatant وإما تجميد للتخزين أو استخدامها للتجربة.
   2. BAL: الطرد المركزي العينة في 350 × ز لمدة 5 دقائق. خذ supernatant وإما تجميد للتخزين أو استخدامها للتجربة.

2. تشيتيناسي أسي

ملاحظة: العلم وراء اختبار بسيط نسبيا. يتم شق الركيزة غير الفلورية بواسطة الكيتيناز النشط الأنزيمية لإنتاج منتج فلورسنت، والذي يقاس بعد ذلك كعلامة غير مباشرة لنشاط الكيتيناز. الكيتيناسيس داخل العينات كسر الركيزة 4-ميثيلومبيالريل-د-N، N'-diacetylchitobiose موجودة في المخزن المؤقت McIlvain 1X. يتم إطلاق جزيء الفلورسنت 4-ميثيلومبيالميريل. من خلال قياس الفلورة الكلي لكل بئر، نحصل على قياس دقيق للكيتيناز النشط في كل عينة. لأن انهيار الكيتين عن طريق الكيتينا هو رد فعل مائي، وقف العازلة، خليط من 0.3 M الجلايسين وهيدروكسين (12.0 غرام / لتر في درجة الحموضة 10.6)، ينتهي انهيار الكيتين عن طريق خلق بيئة أساسية جدا للإنزيم للعمل.

1. إعداد الركائز والمعايير والحلول.
   1. جهزوا مخزن (ماكيلفين) المؤقت يتكون المخزن المؤقت McIlvain من 0.1 M سيترات و 0.2 M الفوسفات عند درجة الحموضة من 5.2. تمييع بنسبة 1:1 ل1x McIlvain العازلة.
   2. حل كل من 4-ميثيلومبيالميريل-د-N، ن-diacetylchitobiose و 4-ميثيلومبيالريلريل ß-D-N، N'، N"-triacetylchitotriose في 1X McIlvain العازلة إلى تركيز 500 درجة مئوية لكل منهما.
      ملاحظة: يمكن تخزين محلول المخزون عند -20 درجة مئوية لمزيد من الاستخدامات؛ أفضل المخزنة في aliquots.
   3. حل القياسية، 4-methylumbelliferone، إلى تركيز 0.1 mM في وقف العازلة (خليط من 0.3 M الجلايسين وهيدروكسيد الصوديوم (12.0 غرام / لتر في درجة الحموضة 10.6)) لإنشاء الحل القياسية منحنى الأسهم.
2. إنشاء لوحة الحل العمل.
   1. الجمع بين 1X McIlvain العازلة والشيتين الركيزة 4-ميثيلومبيالميريل-D-N، N'-diacetylchitobiose لخلق حل العمل. لكل 10 عينات، مزيج 100 درجة مئوية من الركيزة مع 2.17 مل من 1X McIlvain العازلة. انظر الجدول 1 للاطلاع على حسابات إضافية استناداً إلى حجم العينة.
      ملاحظة: استخدام 4-ميثيلومبيلميريل ß-D-N، N'، N"-triacetylchitotriose للعينات البشرية. في حين أن كلا الركائز يمكن أن تكون مشعبة إما من قبل إنزيمات الإنسان أو الماوس، وقد تم تعيينها إما لعينات الإنسان أو الماوس على أساس كفاءة الانقسام⁶.
   2. ماصة 95 درجة مئوية من حل العمل في كل بئر من لوحة 96 جيدا.
3. إضافة عينات من العينات الحيوية إلى حل العمل.
   1. بعد ذلك، أضف 5 ميكرولتر من عينة الاختبار (الدم/BAL/lysate الأنسجة/السوائل البيولوجية الأخرى) إلى كل بئر.
   2. امزج العينة في حل العمل للحصول على نتائج أكثر دقة وموثوقية.
      ملاحظة: وينبغي تشغيل العينات في التكرارات/الثلاثية مع إيلاء اهتمام خاص للآثار المحتملة على الحافة. يجب أن تكون جميع العينات قبل تسخينها لتقليل تأثير الحافة. كما ينطوي على فحص رد فعل بين الكيتينافية في العينة والركيزة في حل العمل، فمن الأفضل للعمل بسرعة نسبيا لتقليل الفرق في الوقت بين عندما يتم مطلي العينة الأولى ومطلي العينة الأخيرة. ينصح ماصة متعددة القنوات.
4. الحضانة عند 37 درجة مئوية
   1. يُغطّى الطبق ويُرجّ لفترة وجيزة (5 ق).
   2. حضانة لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. وهذا يسمح لرد الفعل الأنزيمي أن يحدث.
5. إعداد المنحنى القياسي.
   1. في حين أن العينات هي الحضانة، وإعداد تخفيف تسلسلي من 4-methylumbelliferone، وهو معيار غالبا ما تستخدم في تحديد الفلورمتري من نشاط الإنزيم.
   2. تخفيف مخزون الحل القياسي في وقف العازلة إلى تركيز 5 μM.
   3. إجراء سلسلة من التخفيفات على النحو المبين في الجدول 2. إضافة المكونات في المبلغ المشار إليه ومزيج جيدا.
      ملاحظة: يساعد المنحنى القياسي على ضمان سقوط العينات المقاسة في النطاق الخطي للمنحنى القياسي.
6. إيقاف رد الفعل مع وقف العازلة.
   1. إضافة 200 درجة مئوية من وقف العازلة إلى كل بئر لوقف رد الفعل.
7. لوحة المعايير.
   1. إضافة 300 درجة مئوية من كل معيار لكل بئر في التكرارات على نفس اللوحة.
8. قراءة لوحة باستخدام قارئ الفلورومتري.
   1. قراءة لوحة في الإثارة من 360 نانومتر, وانبعاث 455 نانومتر.

3- تحليل البيانات

1. طرح الفراغات
   1. متوسط قيم التخفيفات القياسية المكررة التي ليس لها 4-ميثيلبيليفييرون. طرح هذه القيمة من كافة القيم المسجلة الأخرى.
2. تأخذ متوسط من التكرارات التقنية ورسم المعايير.
   1. متوسط القراءتين لكل تركيز ورسم بياني متوسط القراءة حسب التركيز.
      ملاحظة: يجب أن تبدو المؤامرة الناتجة خطية ولها قيمة R² قريبة من 1. إذا لم يكن كذلك، قد يكون من الضروري إعادة المعايير وإعادة قراءة لوحة لضمان جودة تحليل البيانات.
3. توحيد قيم القراءة.
   1. إنشاء خط مناسب لبيانات المعايير المرسومة. تقسيم قراءة العينات حسب ميل الخط الأنسب.
4. مقارنة القيم من مجموعة التحكم ومجموعة المتغيرات.
   1. استخدم اختبار t أو ANOVA لأكثر من مجموعتين لتحديد ما إذا كان الفرق بين المجموعات مهم إحصائيًا. القيم سوف تأخذ وحدات nmol / مل · ح.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

النتائج المبينة هنا هي من دراسة قياس نشاط الكيتينازي في المصل وعينات BAL من النوع البري (C57BL/6) وChit1 الفئران المعدلة وراثيا (على خلفية C57BL/6) أن overexpress الجين Chit1 على المروج الدوكسيسيكلين. وتظهر بياناتنا أن كلا من عينات المصل وBAL لها نشاط الكيتيناز القابل للكشف عند خط الأساس 698.2 ± 189.9 نمول/مل·ح و 485.7...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

وقد برز نشاط الكيتينازي كعلامة حيوية هامة للتنبؤ بخطورة المرض، وتطور المرض، والفعالية العلاجية ووجود مسببات أمراض محددة¹⁸. على الرغم من أن العديد من النظريات المفترضة منذ فترة طويلة حول دور الكيتينالم لم يتم إثباتها تجريبيا¹⁹، قدمت دراسات جديدة رؤى هامة في دور ال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-methylumbelliferone	Sigma	M1381	Standard: commonly used in flourimetric assays for determination of enzyme activity
4MU-GlcNAc2	Sigma	M9763	fluorescent chitinase substrate for use in mouse samples
4MU-GlcNAc3	Sigma	M5639	fluorescent chitinase substrate for use in human samples
Citric Acid-monohydrate			for use in McIlvain Buffer
Glycine			for use in Stop Buffer at a concentration of 0.3 M
Na2HPO4xH2O			for use in McIlvain Buffer
NaOH			for use in Stop Buffer at a concentration of 12 g/L
Vision Plate: Non-sterile, untreated black 96 well plate	4titude	4ti-0224