Medición de la actividad de la chitinasa en muestras biológicas

Resumen

Aquí se presenta un método sencillo para medir la actividad de la chitinasa en fluidos biológicos como el lavado broncoalveolar o el suero.

Resumen

Las chitinasas son las enzimas que se paran la quitina. Incluso en ausencia de quitina, los mamíferos tienen cantidades significativas de chitinasis presentes en el cuerpo, incluso al inicio. El papel preciso de la chitinasa no se conoce, sin embargo se creía que desempeña un papel importante en la digestión y la defensa del huésped contra los alimentos y patógenos que contienen quitina, respectivamente. El trabajo reciente, incluido el nuestro, ha demostrado un importante papel de las proteínas de chitinasa y las proteínas similares a las chitinasas en la inmunidad al huésped y las enfermedades alérgicas. Es importante destacar que las actividades de la chitinasa sirven como biomarcadores importantes de la gravedad de la enfermedad en una amplia gama de enfermedades, incluidas enfermedades inflamatorias de tipo 2 como el asma y la fibrosis pulmonar. Del mismo modo, los pacientes con trastornos genéticos como la enfermedad de Gaucher tienen niveles significativamente elevados de chitinasa, que no sólo se correlacionan con la gravedad de la enfermedad, sino que también sirven como un biomarcador fiable para la eficacia terapéutica. El protocolo descrito aquí describe una manera simple, rápida y directa de medir la actividad de la chitinasa en BAL o muestras séricas de ratones y puede ser ampliamente adaptado a sujetos humanos y otros organismos modelo debido a la naturaleza altamente conservada de las enzimas.

Introducción

La quitina es el segundo polisacárido más abundante en la tierra después de la celulosa, sirviendo como un componente estructural importante de una variedad de organismos incluyendo el exoesqueleto de insectos, hongos, levaduras y algas; algunos vertebrados también tienen quitina¹. Las chitinasas son una familia de enzimas que son capaces de descomponer la quitina y están altamente conservadas a lo largo de la evolución en especies que van desde bacterias hasta mamíferos^2,3. Además de las chitinasis, los mamíferos también tienen proteínas similares a las chitinasas que son similares a las chitinasas en su capacidad para unir la quitina pero difieren en que carecen de capacidad enzimática para cortar la quitina^4.

Aunque la quitina y las chitinasis han sido estudiadas durante mucho tiempo, con investigaciones que se remontan a principios de 1900, el enfoque principal ha estado en su papel en insectos y otros invertebrados. De hecho, no fue hasta la década de 1960 cuando se encontró que los vertebrados tenían chitinasis en absoluto. Utilizando un ensayo a base de chitobiase, se demostró que las chitinasas se encuentran en el tracto digestivo de una serie de vertebrados, incluyendo lagartos y mirlos, una observación que se presume que se debe al consumo de organismos que contienen quitina como insectos⁵ .

Los mamíferos tienen dos formas enzimáticamente activas de chitinasa: chitinasa de mamíferoá ácida (AMCase; también conocida como CHIT2 y CHIA) y chitotriosidasa (CHIT1)⁴. Ambas proteínas son capaces de hidrolizar la quitina. Sin embargo, CHIT1 es más activo en los seres humanos, donde casi toda la actividad chitinasa se deriva de CHIT1. ⁴ En ratones, tanto Chit1 como AMCase contribuyen casi por igual a la actividad general de la chitinasa⁶. Por otro lado, las proteínas similares a la chitinasa carecen de actividad de la chitinasa.

Chit1 se secreta principalmente por macrófagos y a menudo se considera como una respuesta inmune a los patógenos que contienen quitina⁷. La enzima también ha demostrado estar implicada en la maduración de monocitos en los subtipos de macrófagos M1 y M2, incluso sin la presencia de la quitina^desustrato 8. Además, también puede estar involucrado en la maduración de otras células inmunitarias, incluyendo t helper tipo 2 (Th2) células y eosinófilos, como se demostró que era el caso en la infección pulmonar criptocócica⁹. Estos estudios apuntan a un papel complejo de las chitinasas en el sistema inmunológico.

En los últimos años, se ha encontrado que los niveles de Chit1 sirven como un importante biomarcador de progresión para más de 40 enfermedades humanas diferentes, incluyendo enfermedades de almacenamiento lisosomal, enfermedades infecciosas, enfermedades respiratorias, enfermedades endocrinológicas, enfermedades neurológicas y otras (revisadas¹⁰). En muchas de estas enfermedades, los niveles de Chit1 son un fuerte predictor de la gravedad de la enfermedad y la eficacia terapéutica¹⁰.

Como las chitinasis se han ganado una reputación como un biomarcador para numerosas condiciones médicas incluyendo la enfermedad de Gaucher, se han desarrollado herramientas y ensayos para facilitar las pruebas de presencia de chitinasa. Los métodos más antiguos incluyen el procedimiento de Schales, un protocolo adaptado de una prueba de glucosa en sangre y el método de ácido dinitrosalicílico 3,5 (DNS). Sin embargo, estos métodos son a menudo sensibles al tiempo y técnicamente difíciles¹¹. El procedimiento para ambas pruebas requiere la reducción de oxidantes inorgánicos, ferricyanida en el caso del procedimiento de los Schales, por ejemplo, produciendo un cambio de color que sólo puede medirse espectrofotométricamente. Además, ambas pruebas implican un paso de calentamiento o ebullición que consume mucho tiempo y es necesario para que el color se desarrolle^12,13.

Aquí se describe un ensayo fluorado rápido y simple para determinar los niveles de chitinasa en muestras de mamíferos^14,15. Dos de las muestras utilizadas aquí incluyen suero y líquidos de lavado broncoalveolar (BAL); la actividad de la chitinasa también se ha medido en muestras de leche materna y orina, y la técnica se puede realizar en ese tipo de muestras, así como en cualquier otro fluido biológico^16,17.

Protocolo

Todos los procedimientos de animales se realizaron bajo un protocolo aprobado por la IACUC en la Escuela de Medicina de la Universidad de Yale.

1. Colección de muestras de ratón

1. Anestesia
   1. Anestetizar ratones usando ketamina y xilazina (100 mg/kg de ketamina y 10 mg/kg de xilazina).
2. Recogida de muestras de sangre
   1. Confirme la profundidad de la anestesia por falta de respuesta a un pellizco del dedo del pie.
   2. Abra quirúrgicamente la cavidad torácica para exponer el corazón.
   3. Inserte una aguja de 26,5 G en el ventrículo izquierdo y recoja sangre en una jeringa.
      NOTA: Típicamente, alrededor de 0.5–1 ml de sangre se pueden cosechar de un ratón saludable de 20-25 g.
   4. Recoger la sangre en tubos heparinizados, para la recolección de plasma, o tubos no heparinizados para la recolección de suero.
3. Recolección de líquido de lavado broncoalveolar (BAL)
   1. Para recoger el BAL, haga un corte vertical en el cuello para exponer la tráquea.
   2. Canúrre la tráquea con un catéter de 22 G y fíjela firmemente con una cuerda para evitar fugas por la nariz del ratón.
   3. Inyectar lentamente dos alícuotas de solución salina estéril con fosfato (PBS, 0,75 ml cada una) en los pulmones a través de la tráquea y recuperarlas.
   4. Piscina alícuotas y mantener en hielo para su análisis posterior.
4. Procesamiento de las muestras biológicas.
   1. Muestra de sangre: fresco (plasma) o después de permitir la coagulación durante 4 h (suero), centrífuga a 600 x g durante 10 min. Tome el sobrenadante y congele para almacenarlo o usarlo para experimentar.
   2. BAL: Centrifugar la muestra a 350 x g durante 5 min. Tome el sobrenadante y congele para almacenarlo o usarlo para experimentar.

2. Ensayo de chitinase

NOTA: La ciencia detrás del ensayo es relativamente simple. Un sustrato no fluorescente es cegado por chitinasa enzimáticamente activa para producir un producto fluorescente, que luego se mide como un marcador indirecto de actividad de la chitinasa. Las chitinasas dentro de las muestras descomponen el sustrato 4-methylumbelliferyl-D-N, N'-diacetylchitobiose presente en el 1x tampón McIlvain. Se libera una molécula fluorescente 4-methylumbelliferyl. Al medir la fluorescencia total de cada pozo, obtenemos una medición precisa de la chitinasa activa en cada muestra. Debido a que la descomposición de la quitina por chitinasa es una reacción hidrolítica, el tampón de parada, una mezcla de 0,3 M de glicina y NaOH (12,0 g/L a pH 10,6), termina la descomposición de la quitina creando un entorno que es demasiado básico para que la enzima funcione.

1. Prepare los sustratos, estándares y soluciones.
   1. Preparen el buffer de McIlvain. El tampón de McIlvain se compone de citrato de 0,1 M y fosfato de 0,2 M a un pH de 5,2. Diluir en una proporción de 1:1 para 1x amortiguador McIlvain.
   2. Disolver 4-methylumbelliferyl-D-N, N'-diacetylchitobiose y 4-methylumbelliferyl -D-N, N', N"-triacetylchitotriose en 1x McIlvain Buffer a una concentración de 500 m cada uno.
      NOTA: La solución de stock se puede almacenar a -20 oC para usos posteriores; mejor almacenado en alícuotas.
   3. Disolver estándar, 4-metilumbelliferona, a una concentración de 0,1 mM en tampón de tope (mezcla de 0,3 M de glicina y NaOH (12,0 g/L a pH 10,6)) para crear la solución de stock de curva estándar.
2. Cree y pelar la solución de trabajo.
   1. Combine 1 x tampón de McIlvain y sustrato de quitina 4-methylumbelliferyl-D-N, N'-diacetylchitobiose para crear la solución de trabajo. Por cada 10 muestras, mezcle 100 ml de sustrato con 2,17 ml de 1 l de tampón McIlvain. Consulte la Tabla 1 para obtener cálculos adicionales basados en el tamaño de la muestra.
      NOTA: Utilice 4-methylumbelliferyl -D-N, N', N"-triacetilchitotriose para muestras humanas. Mientras que ambos sustratos pueden ser acuchillados por enzimas humanas o de ratón, se hanasignado para muestras humanas o de ratón basadas en la eficiencia del escote 6.
   2. Pipetear 95 l de solución de trabajo en cada pocal de una placa de 96 pocillos.
3. Agregue muestras de bioespecímenes a la solución de trabajo.
   1. A continuación, añadir 5 l de la muestra de prueba (sangre/BAL/lisato tisado/otro líquido biológico) a cada poca.
   2. Mezcle la muestra en la solución de trabajo para obtener los resultados más precisos y fiables.
      NOTA: Las muestras deben ejecutarse en duplicados/triplicados con especial atención a los posibles efectos de borde. Todas las muestras deben precalentarse para minimizar el efecto de borde. Como el ensayo implica una reacción entre las chitinasas en la muestra y el sustrato en la solución de trabajo, es mejor trabajar con relativa rapidez para minimizar la diferencia de tiempo entre el momento en que se chapa la primera muestra y la última muestra. Se recomienda pipeta multicanal.
4. Incubar a 37oC.
   1. Cubra el plato y agite brevemente (5 s).
   2. Incubar la placa a 37oC durante 15 min. Esto permite que la reacción enzimática tenga lugar.
5. Prepare la curva estándar.
   1. Mientras las muestras están incubando, preparar una dilución en serie de 4-metilumbelliferone, un estándar utilizado a menudo en la determinación fluorimétrica de la actividad enzimática.
   2. Diluir el stock de la solución estándar en tampón de tope a una concentración de 5 m.
   3. Realice una serie de diluciones como se indica en la Tabla2. Agregue los componentes en la cantidad indicada y mezcle bien.
      NOTA: La curva estándar ayuda a garantizar que las muestras medidas caigan en el rango lineal de la curva estándar.
6. Detenga la reacción con el búfer de parada.
   1. Añadir 200 l de tampón de parada a cada pozo para detener la reacción.
7. Placa los estándares.
   1. Añadir 300 s de cada estándar por pozo en duplicados en la misma placa.
8. Lea la placa con un lector fluorométrico.
   1. Lea la placa a una excitación de 360 nm, y una emisión de 455 nm.

3. Análisis de datos

1. Restar los espacios en blanco
   1. Promedio de los valores de las diluciones estándar duplicadas que no tienen 4-metilumbelliferone. Reste este valor de todos los demás valores registrados.
2. Tome el promedio de réplicas técnicas y trace los estándares.
   1. Promedio de las dos lecturas para cada concentración y graficar la lectura promedio por concentración.
      NOTA: La gráfica resultante debe parecer lineal y tener un valor R² cercano a 1. Si no lo hace, puede ser necesario rehacer las normas y volver a leer la placa para garantizar la calidad del análisis de datos.
3. Estandarizar los valores de lectura.
   1. Cree la línea de ajuste más adecuada para los datos de normas trazados. Divida las lecturas de las muestras por la pendiente de la línea de mejor ajuste.
4. Compare los valores del grupo de control y el grupo de variables.
   1. Utilice una prueba t o Un ANOVA, para más de dos grupos, para determinar si la diferencia entre grupos es estadísticamente significativa. Los valores tomarán las unidades nmol/mL-h.

Resultados

Los resultados mostrados aquí provienen de un estudio que mide la actividad de la chitinasa en muestras de suero y BAL de tipo silvestre (C57BL/6) y ratones transgénicos Chit1 (sobre fondo C57BL/6) que sobreexpresan el gen Chit1 en un promotor de doxiciclina. Nuestros datos muestran que tanto las muestras de suero como de BAL tienen una actividad de chitinasa detectable en la línea de base 698,2 a 189,9 nmol/mL-h y 485,7 a 114 nmol/ml-h, respectivamente. La sobreexpresión del gen Chit1 utilizando doxiciclina en el ag...

Discusión

La actividad chitinasa ha surgido como un biomarcador importante para predecir la gravedad de la enfermedad, la progresión de la enfermedad, la eficacia terapéutica y la presencia de patógenos específicos^18. Aunque muchas de las teorías de largo postulado sobre el papel de las chitinasis no han sido probadas experimentalmente¹⁹, nuevos estudios han proporcionado información importante sobre el papel de las chitinasis y las chitinasas como proteínas en varias enfermed...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-methylumbelliferone	Sigma	M1381	Standard: commonly used in flourimetric assays for determination of enzyme activity
4MU-GlcNAc2	Sigma	M9763	fluorescent chitinase substrate for use in mouse samples
4MU-GlcNAc3	Sigma	M5639	fluorescent chitinase substrate for use in human samples
Citric Acid-monohydrate			for use in McIlvain Buffer
Glycine			for use in Stop Buffer at a concentration of 0.3 M
Na2HPO4xH2O			for use in McIlvain Buffer
NaOH			for use in Stop Buffer at a concentration of 12 g/L
Vision Plate: Non-sterile, untreated black 96 well plate	4titude	4ti-0224