Biyolojik Örneklerde Konitinaz Aktivitesinin Ölçülmesi

Özet

Burada bronkoalveolar lavaj veya serum gibi biyolojik sıvılarda kitinaz aktivitesini ölçmek için basit bir yöntemdir.

Özet

Chitinases kitin cleave enzimleridir. Hatta kitin yokluğunda, memeliler bazada da dahil olmak üzere vücutta mevcut chitinases önemli miktarda var. Konitinazın kesin rolü bilinmemektedir, ancak sırasıyla kitin içeren gıda ve patojenlere karşı sindirim ve konak savunmaönemli bir rol oynadığına inanılmaktadır. Son çalışmalar, bizim de dahil olmak üzere, konak bağışıklık ve alerjik hastalıklarda konitinaz ve konitinaz benzeri proteinlerin önemli bir rol göstermiştir. Daha da önemlisi, kitinaz aktiviteleri astım ve pulmoner fibrozis gibi tip 2 inflamatuar hastalıklar da dahil olmak üzere çok çeşitli hastalıklarda hastalık şiddetinin önemli biyobelirteçleri olarak hizmet vermektedir. Benzer şekilde, Gaucher hastalığı gibi genetik bozuklukları olan hastalar önemli ölçüde yüksek kitinaz düzeyleri var, hangi sadece hastalığın şiddeti ile ilişkili değil, aynı zamanda terapötik etkinliği için güvenilir bir biyomarker olarak hizmet vermektedir. Burada özetlenen protokol, BAL veya fare lerin serum örneklerindeki kitinaz aktivitesini ölçmenin basit, hızlı ve basit bir yolunu açıklar ve enzimlerin yüksek derecede korunmuş doğası nedeniyle insan deneklere ve diğer model organizmalara yaygın olarak adapte edilebilir.

Giriş

Chitin selüloz sonra yeryüzünde ikinci en bol polisakkarit, böceklerin dış iskelet ilerlerken dahil olmak üzere organizmaların çeşitli önemli bir yapısal bileşeni olarak hizmet vermektedir, mantarlar, maya, ve yosun; bazı omurgalılar da chitin¹var. Chitinases kitin yıkmak yeteneğine sahip enzimler bir aile ve son derece bakterilerden memelilere kadar türlerde evrim boyunca korunur^2,3. Chitinases ek olarak, memeliler de chitin bağlamak için yeteneklerini chitinases benzer ama onlar chitin cleave enzimatik yeteneği eksikliği farklı olan kitinaz benzeri proteinler var⁴.

Her ne kadar chitin ve chitinases uzun incelenmiş olsa da-1900'lerin başına kadar uzanan araştırmalar ile-ana odak böcekler ve diğer omurgasızlar rollerini olmuştur. Aslında, 1960'lara kadar omurgalıların chitinases olduğu tespit edildi. Chitobiare bazlı bir test kullanılarak, kitinazların kertenkeleler ve karakuşlar da dahil olmak üzere omurgalıların sindirim sisteminde bulunduğu gösterilmiştir— bu gözlem, böcekler gibi kitin içeren organizmaların tüketimine bağlı olduğu varsayımına yol açtı⁵ .

Memelilerin iki enzimatik aktif kromozom formu vardır: asidik memeli kitinaz (AMCase; chit2 ve CHIA olarak da bilinir) ve kitotriosidaz (CHIT1)⁴. Bu proteinlerin her ikisi de kitin hidrolize yeteneğine sahiptir. Ancak, CHIT1 insanlarda daha enzimatik olarak aktiftir, hemen hemen tüm kitinaz aktivitesi CHIT1 türetilmiştir. ⁴ Farelerde, hem Chit1 hem de AMCase neredeyse eşitgenel kitinaz aktivitesine katkıda 6. Öte yandan, kitinaz benzeri proteinlerde kitinaz aktivitesi yok.

Chit1 esas olarak makrofajlar tarafından salgılanır ve genellikle chitin içeren patojenlere karşı bağışıklık yanıtı olarak kabul edilir⁷. Enzim ayrıca substrat kitin^varlığıolmadan bile, hem M1 ve M2 makrofaj alt tipleri içine monositlerin olgunlaşmadahil olduğu gösterilmiştir 8 . Ayrıca, aynı zamanda T yardımcı tip 2 de dahil olmak üzere diğer bağışıklık hücrelerinin olgunlaşma dahil olabilir (Th2) hücreleri ve eozinofiller—kriptokok akciğer^enfeksiyonu9 durumda olduğu gösterilmiştir . Bu çalışmalar bağışıklık sisteminde chitinases karmaşık bir rolüne işaret.

Son yıllarda, Chit1 düzeyleri lisozomal depolama hastalıkları, bulaşıcı hastalıklar, solunum yolu hastalıkları, endokrinolojik hastalıklar, kardiyovasküler dahil olmak üzere 40'tan fazla farklı insan hastalığı için ilerleme önemli bir biyomarker olarak hizmet bulunmuştur hastalıklar, nörolojik hastalıklar vediğerleri (gözden 10). Bu hastalıkların çoğunda, Chit1 düzeyleri hastalığın şiddeti ve terapötik etkinliği^güçlübir belirleyici 10 vardır.

Chitinases Gaucher Hastalığı da dahil olmak üzere çok sayıda tıbbi durumlar için bir biyomarker olarak ün kazanmıştır gibi, araçlar ve tahliller chitinaz varlığı için test kolaylaştırmak için geliştirilmiştir. Eski yöntemler arasında Schales'in prosedürü, kan şekeri testinden uyarlanmış bir protokol ve 3,5 dinitrosalislik asit (DNS) yöntemi sayılabilir. Ancak, bu yöntemler genellikle zaman duyarlı ve teknik olarak zor¹¹. Bu testlerin her ikisi için de prosedür inorganik oksidanların azaltılmasını gerektirir, örneğin Schales prosedürü durumunda ferricyanide, sadece spektrofotometrik olarak ölçülebilen bir renk değişikliği üreten. Ayrıca, her iki test de zaman alıcı ve renk^{12geliştirmek}için gerekli bir ısıtma veya kaynama adım içerir 13 .

Burada açıklanan memeli örneklerinde kitinaz düzeylerini belirlemek için hızlı ve basit bir florimetrik test^14,15. Burada kullanılan örneklerden ikisi serum ve bronkoalveoler lavaj sıvıları (BAL); kitinaz aktivitesi de anne sütü ve idrar örneklerinde ölçüldü ve teknik bu tür örneklerde yanı sıra diğer biyolojik sıvı^16,17yapılabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm hayvan işlemleri Yale Üniversitesi Tıp Fakültesi'nde IACUC onaylı bir protokol altında gerçekleştirildi.

1. Fare Örnek Toplama

1. Anestezi
   1. Ketamin ve ksilazin kullanarak fareler anestezik (ketamin 100 mg / kg ve ksilazin 10 mg / kg).
2. Kan örneği toplama
   1. Anestezinin derinliğini bir parmak ucuna yanıt vermeyen bir şekilde onaylayın.
   2. Cerrahi kalp ortaya çıkarmak için göğüs boşluğu açın.
   3. Sol ventriküle 26,5 G iğne yerleştirin ve şırınganın içine kan toplayın.
      NOT: Tipik olarak, yaklaşık 0.5-1 mL kan sağlıklı bir 20-25 g fareden hasat edilebilir.
   4. Plazma toplama için heparinize tüplerde veya serum toplama için heparinize olmayan tüplerde kan toplamak.
3. Bronkoalveolar lavaj sıvısı (BAL)
   1. BAL toplamak için, nefes borusunu ortaya çıkarmak için boyunda dikey bir kesik yapın.
   2. 22 G kateter ile trakeayı kanüle getirin ve farenin burnundan sızmasını önlemek için bir ip kullanarak sıkıca sabitleyin.
   3. Yavaşça trakea yoluyla akciğerlere steril fosfat tamponlu salin iki aliquots enjekte (PBS, 0.75 mL her) ve geri almak.
   4. Havuz aliquots ve daha fazla analiz için buz üzerinde tutun.
4. Biyolojik numuneleri işliyorum.
   1. Kan örneği: Ya taze (plazma) ya da 4 h (serum) için pıhtılaşmaya izin sonra, 10 dakika için 600 x g santrifüj. Supernatant alın ve depolama veya deneme için kullanmak için dondurun.
   2. BAL: Numuneyi 350 x g'de 5 dk santrifüj edin. Supernatant alın ve depolama veya deneme için kullanmak için dondurun.

2. Chitinase Assay

NOT: Titrenin arkasındaki bilim nispeten basittir. Floresan olmayan bir substrat enzimatik olarak aktif kitinaz tarafından bir floresan ürün üretmek için ayrılır, daha sonra kitinaz aktivitesinin dolaylı bir belirteci olarak ölçülür. Örneklerin içindeki chitinases substrat 4-methylumbelliferyl-D-N, N'-diasetylchitobiose 1x McIlvain tampon mevcut yıkmak. Bir floresan molekül 4-methylumbelliferyl serbest bırakılır. Her kuyunun toplam floresansını ölçerek, her numunedeki aktif kromozomun doğru bir ölçümlerini elde ediyoruz. Chitinin kitinaz tarafından bozulması hidrolitik bir reaksiyon olduğundan, durdurma tamponu, 0.3 M glisin ve NaOH karışımı (pH 10.6'da 12.0 g/L), enzimin çalışması için çok basit bir ortam oluşturarak kitin dökümünü sona erdirİr.

1. Alt tabakaları, standartları ve çözümleri hazırlayın.
   1. McIlvain tamponhazırlayın. McIlvain Tampon u 5.2 pH 0.1 M sitrat ve 0.2 M fosfat oluşur. 1x McIlvain tampon için 1:1 oranında seyreltin.
   2. Her biri 500 μM'lik bir konsantrasyona kadar 1x McIlvain Tampon'da hem 4-metilumbelliferyl-D-N, N'-diasetilchitobiose hem de 4-metilumbellifßeryl-D-N, N', N"-triacetylchitotriose'u çözün.
      NOT: Stok çözeltisi daha fazla kullanım için -20 °C'de saklanabilir; en iyi aliquots saklanır.
   3. Standart eğri stok çözeltisini oluşturmak için standart, 4-metilumbelliferon,stop tamponunda 0,1 mM konsantrasyona (0,3 M glisin ve NaOH karışımı (pH 10,6'da 12,0 g/L)) çözün.
2. Çalışma çözümlerini oluşturun ve plakalayın.
   1. 1x McIlvain Tampon ve chitin substrat 4-methylumbelliferyl-D-N, N'-diasetylchitobiose çalışma çözümü oluşturmak için birleştirin. Her 10 örnek için 100 μL substrat ile 2,17 mL 1x McIlvain tamponu karıştırın. Örnek boyutuna dayalı ek hesaplamalar için Tablo 1'e bakın.
      NOT: İnsan örnekleri için 4-metilumbelliferyl ß-D-N, N', N"-triacetylchitotriose kullanın. Her iki substrat insan veya fare enzimleri tarafından ayrılabilse de, dekolte 6'nın etkinliğinegöre insan veya fare örnekleri için atanmıştır.
   2. Pipet 95 μL çalışma çözeltisi 96 kuyuluk her kuyuya.
3. Biyonumune örneklerini çalışma çözümüne ekleyin.
   1. Daha sonra, her kuyuya test örneğinin (kan/BAL/doku lysate/diğer biyolojik sıvı) 5 μL'sini ekleyin.
   2. En doğru ve güvenilir sonuçlar için numuneyi çalışma çözümüne karıştırın.
      NOT: Örnekler, potansiyel kenar efektlerine özel önem verilmelidir. Kenar etkisini en aza indirmek için tüm numuneler önceden ısıtılmalıdır. Titre, numunedeki kitinalar ile çalışma çözeltisindeki substrat arasında bir reaksiyon içerdiğinden, ilk numunenin kaplanması ile son numunenin kaplanması arasındaki zaman farkını en aza indirmek için nispeten hızlı bir şekilde çalışmak en iyisidir. Çok kanallı pipet önerilir.
4. 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
   1. Plakayı kapatın ve kısa bir süre sallayın (5 s).
   2. Plakayı 37 °C'de 15 dk kuluçkaya yatırın. Bu enzimatik reaksiyon gerçekleşmesini sağlar.
5. Standart eğriyi hazırlayın.
   1. Örnekler kuluçka yakarken, enzim aktivitesinin florimetrik tayininde sıklıkla kullanılan bir standart olan 4-metilumbelliferon seri seyreltme hazırlayın.
   2. Dur tamponundaki standart çözeltinin stoğunu 5 μM'lik bir konsantrasyona seyreltin.
   3. Tablo2'de belirtildiği gibi bir dizi seyreltme gerçekleştirin. Bileşenleri belirtilen miktarda ekleyin ve iyice karıştırın.
      NOT: Standart eğri, ölçülen örneklerin standart eğrinin doğrusal aralığında düşmesini sağlamaya yardımcı olur.
6. Durdurma arabelleği ile reaksiyonu durdurun.
   1. Reaksiyonu durdurmak için her kuyuya 200 μL stop arabelleği ekleyin.
7. Standartları plakalayın.
   1. Aynı plaka üzerindeki yinelemelere kuyu başına her standarttan 300 μL ekleyin.
8. Florometrik okuyucu kullanarak plakayı okuyun.
   1. 360 nm uyarma ve 455 nm bir emisyon plaka okuyun.

3. Veri Analizi

1. Boşlukları çıkarma
   1. 4-metilumbelliferon olmayan yinelenen standart seyreltmelerin ortalama değerleri. Bu değeri diğer kaydedilen değerlerin tümünden çıkarın.
2. Teknik çoğaltmaların ortalamasını alın ve standartları çizin.
   1. Her konsantrasyon için ortalama iki okuma ve konsantrasyona göre ortalama okuma grafiği.
      NOT: Ortaya çıkan çizim doğrusal görünmeli ve 1'e yakın bir R² değerine sahip olmalıdır. Yoksa, veri analizi kalitesini sağlamak için standartları yeniden yapmak ve plakayı yeniden okumak gerekebilir.
3. Okuma değerlerini standartlaştırın.
   1. Çizilen standartlar verileri için en uygun çizgi oluşturun. Örneklerin okumalarını en uygun çizginin eğimine bölün.
4. Kontrol grubundan ve değişken grubundaki değerleri karşılaştırın.
   1. Gruplar arasındaki farkın istatistiksel olarak anlamlı olup olmadığını belirlemek için ikiden fazla grup için bir t-testi veya ANOVA kullanın. Değerler nmol/mL·h birimlerini alacaktır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Burada gösterilen sonuçlar, yabani tip (C57BL/6) ve Chit1 transgenik farelerin (C57BL/6 arka planda) serum ve BAL örneklerinde (C57BL/6 arka planda) kitinaz aktivitesini ölçen ve Chit1 genini doksisiklin promotöründe aşırı eksprese eden bir çalışmadan elde edilebilmektedir. Verilerimiz hem serum hem de BAL örneklerinin bazal 698.2 ± 189.9 nmol/mL·h ve 485.7 ± 114 nmol/ml·h'de saptanabilir kitinaz aktivitesine sahip olduğunu göstermektedir. 4 hafta boyunca içme suyunda doksisiklin kullanılarak Chit1 ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Kitinaz aktivitesi hastalığın şiddetini, hastalığın ilerlemesini, terapötik etkinliğini ve spesifik patojenlerin varlığını tahmin etmek için önemli bir biyobelirteç olarak ortaya çıkmıştır¹⁸. Chitinases rolü hakkında uzun postulated teorilerin çoğu deneysel olarak kanıtlanmamıştır rağmen¹⁹, Yeni çalışmalar çeşitli hastalıklarda proteinler gibi chitinases ve kitinaz rolü içine önemli bilgiler sağlamıştır²

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-methylumbelliferone	Sigma	M1381	Standard: commonly used in flourimetric assays for determination of enzyme activity
4MU-GlcNAc2	Sigma	M9763	fluorescent chitinase substrate for use in mouse samples
4MU-GlcNAc3	Sigma	M5639	fluorescent chitinase substrate for use in human samples
Citric Acid-monohydrate			for use in McIlvain Buffer
Glycine			for use in Stop Buffer at a concentration of 0.3 M
Na2HPO4xH2O			for use in McIlvain Buffer
NaOH			for use in Stop Buffer at a concentration of 12 g/L
Vision Plate: Non-sterile, untreated black 96 well plate	4titude	4ti-0224