Medição da atividade da quitinase em amostras biológicas

Resumo

Aqui apresentamos um método simples para medir a atividade da quitinase em fluidos biológicos, como lavagem broncoalveolar ou soro.

Resumo

As quitinases são as enzimas que cliam em quitina. Mesmo na ausência de quitina, os mammalianos têm quantidades significativas de quitinases presentes no corpo, incluindo no início do estudo. O papel preciso da quitinase não é conhecido, no entanto, acreditava-se que desempenham um papel importante na digestão e defesa do hospedeiro contra a quitina contendo alimentos e patógenos, respectivamente. O trabalho recente, incluindo o nosso, tem demonstrado um papel importante de quitinase e proteínas de quitinase-like na imunidade do hospedeiro e doenças alérgicas. É importante ressaltar que as atividades de quitinase servem como biomarcadores importantes da severidade da doença em uma ampla gama de doenças, incluindo doenças inflamatórias do tipo 2, como asma e fibrose pulmonar. Da mesma forma, pacientes com distúrbios genéticos como a doença de Gaucher têm níveis significativamente elevados de quitinase, que não só se correlacionam com a severidade da doença, mas também servem como um biomarcador confiável para efetividade terapêutica. O protocolo esboçado aqui descreve uma maneira simples, rápida, e direta de medir a atividade do quitinase no Bal ou em amostras do soro dos ratos e pode extensamente ser adaptado aos assuntos humanos e aos outros organismos modelo devido à natureza altamente conservada das enzimas.

Introdução

A quitina é o segundo polissacárido mais abundante na terra após a celulose, servindo como um componente estrutural importante de uma variedade de organismos, incluindo o exoesqueleto de insetos, fungos, leveduras e algas; alguns vertebrados também têm quitina¹. Quitinases são uma família de enzimas que são capazes de quebrar a quitina e são altamente conservadas ao longo da evolução em espécies que variam de bactérias a mamíferos^2,3. Além de quitinases, os mamíferos também têm quitinase-como proteínas que são semelhantes às quitinases em sua capacidade de ligar a quitina, mas diferem em que falta capacidade enzimática para Cleave a quitina⁴.

Embora a quitina e as quitinases tenham sido estudadas há muito tempo — com investigações que datam do início de 1900 — o foco principal tem sido o seu papel em insetos e outros invertebrados. Na verdade, não foi até a década de 1960, quando os vertebrados foram encontrados para ter quitinases em tudo. Usando um ensaio à base de quitobiase, as quitinases mostraram-se no trato digestivo de um número de vertebrados, incluindo lagartos e melros — uma observação hipotética para ser devido ao consumo de organismos contendo quitina, como insetos⁵ .

Os mamíferos têm duas formas enzimaticamente ativas de quitinase: quitinase de mamíferos ácidos (AMCase; também conhecida como CHIT2 e CHIA) e quitotriosidase (CHIT1)⁴. Ambas as proteínas são capazes de hidrolisando quitina. No entanto, CHIT1 é mais enzimaticamente ativo em seres humanos, onde quase toda a atividade de quitinase é derivada de CHIT1. ⁴ em camundongos, tanto o Chit1 quanto o amcase contribuem quase igualmente para a atividade geral da quitinase⁶. Por outro lado, as proteínas quitinase-like falta de atividade quitinase.

Chit1 é secretado principalmente por macrófagos e é muitas vezes considerado uma resposta imune aos patógenos contendo quitina⁷. A enzima também demonstrou estar envolvida na maturação dos monócitos nos subtipos de macrófago M1 e m2, mesmo sem a presença do substrato quitina⁸. Além disso, também pode estar envolvida na maturação de outras células imunes, incluindo células T auxiliares tipo 2 (Th2) e eosinófilos — como se mostrou ser o caso na infecção pulmonar criptocócica⁹. Estes estudos apontam para um papel complexo de quitinases no sistema imunológico.

Nos últimos anos, Chit1 níveis foram encontrados para servir como um importante biomarcador de progressão para mais de 40 diferentes doenças humanas, incluindo doenças de armazenamento lisossomal, doenças infecciosas, doenças respiratórias, doenças endocrinológicas, cardiovascular doenças neurológicas e outras (revistas¹⁰). Em muitas dessas doenças, os níveis de Chit1 são um forte preditor de severidade da doença e efetividade terapêutica¹⁰.

Como quitinases ganharam uma reputação como um biomarcador para inúmeras condições médicas, incluindo a doença de Gaucher, ferramentas e ensaios foram desenvolvidos para facilitar o teste para a presença de quitinase. Os métodos mais antigos incluem o procedimento de schales, um protocolo adaptado de um teste de glicose no sangue, e o método de ácido 3, 5 dinitrosalicílico (DNS). No entanto, esses métodos são muitas vezes sensíveis ao tempo e tecnicamente difícil¹¹. O procedimento para ambos os testes exige a redução de oxidantes inorgânicos, ferricianeto no caso do schales ' procedimento por exemplo, produzindo uma mudança de cor que só pode ser medido espectrofotometricamente. Adicionalmente, ambos os testes envolvem um aquecimento ou uma etapa de ebulição que seja demorado e necessário para que a cor desenvolva^12,13.

Descrito aqui é um ensaio fluimétrico rápido e simples para determinar os níveis de quitinase em amostras de mamíferos^14,15. Duas das amostras utilizadas aqui incluem fluidos de lavagem de soro e broncoalveolar (LBA); a atividade da quitinase também foi mensurada em amostras de leite materno e urina, e a técnica pode ser realizada nessas amostras, bem como em qualquer outro fluido biológico^16,17.

Protocolo

Todos os procedimentos animais foram realizados um protocolo aprovado pela IACUC na Yale University School of Medicine.

1. coleção de amostras de mouse

1. Anesthetization
   1. Anestesie os camundongos com cetamina e xilazina (100 mg/kg de cetamina e 10 mg/kg de xilazina).
2. Coleta de amostras de sangue
   1. Confirme a profundidade da anestesia por não-responsividade a uma pitada do dedo do pé.
   2. Abra cirurgicamente a cavidade torácica para expor o coração.
   3. Insira uma agulha de 26,5 G no ventrículo esquerdo e colete o sangue em uma seringa.
      Nota: Tipicamente, aproximadamente 0.5 – 1 mL do sangue podem ser colhidos de um rato saudável de 20 – 25 g.
   4. Colete o sangue em tubos heparinizados, para coleta de plasma ou tubos não heparinizados para coleta de soro.
3. Coleta de fluido de lavagem broncoalveolar (LBA)
   1. Para recolher o BAL, faça um corte vertical no pescoço para expor a traquéia.
   2. Cannulate a traquéia com um cateter de 22 G e fixe-a firmemente usando uma corda a fim impedir o escapamento fora do nariz do rato.
   3. Injete lentamente duas alíquotas de soro fisiológico tampão fosfato estéril (PBS, 0,75 mL cada) nos pulmões através da traquéia e recupere de volta.
   4. Alíquotas da associação e sustento no gelo para uma análise mais adicional.
4. Processando as amostras biológicas.
   1. Amostra de sangue: ou fresco (plasma) ou depois de permitir a coagulação para 4 h (soro), centrifugador em 600 x g por 10 min. Tome o sobrenadante e congelar para armazenamento ou uso para experimento.
   2. BAL: Centrifugue a amostra a 350 x g durante 5 min. Tome o sobrenadante e congelar para armazenamento ou uso para experimento.

2. ensaio de quitinase

Nota: A ciência por trás do ensaio é relativamente simples. Um substrato não fluorescente é clivada por quitinase enzimaticamente ativa para produzir um produto fluorescente, que é então medido como um marcador indireto da atividade da quitinase. As quitinases dentro das amostras quebram o substrato 4-metilumbelliferyl-D-N, n'-diacetilquitobiose presente no tampão McIlvain 1x. Uma molécula fluorescente 4-methylumbelliferyl é liberada. Medindo-se a fluorescência total de cada poço, obtemos uma medida exata da quitinase ativa em cada amostra. Como a quebra da quitina por quitinase é uma reação hidrolítica, o tampão de parada, uma mistura de 0,3 M de glicina e NaOH (12,0 g/L em pH 10,6), termina a quebra da quitina, criando um ambiente que é muito básico para a enzima para funcionar.

1. Prepare os substratos, padrões e soluções.
   1. Prepare o buffer McIlvain. O tampão de McIlvain é compreendido do citrato de 0,1 M e do fosfato de 0,2 M em um pH de 5,2. Diluir em uma proporção de 1:1 para 1x McIlvain buffer.
   2. Dissolver tanto 4-metilumbelliferyl-D-N, n'-diacetilchitobiose e 4-metilumbelliferyl ß-D-N, N ', N "-triacetilchitotriose em 1x McIlvain tampão para uma concentração de 500 μM cada.
      Nota: A solução conservada em estoque pode ser armazenada no ° c-20 para umas utilizações mais adicionais; melhor armazenadas em alíquotas.
   3. Dissolva o padrão, 4-methylumbelliferone, a uma concentração de 0,1 mM em tampão de parada (mistura de 0,3 M glicina e NaOH (12,0 g/L em pH 10,6)) para criar a solução de estoque de curva padrão.
2. Criar e chapa a solução de trabalho.
   1. Combine 1x McIlvain buffer e o substrato de quitina 4-metilumbelliferyl-D-N, n'-diacetylchitobiose para criar a solução de trabalho. Para cada 10 amostras, misture 100 μL de substrato com 2,17 mL de tampão McIlvain 1x. Consulte a tabela 1 para obter cálculos adicionais com base no tamanho da amostra.
      Nota: Use 4-metilumbelliferyl ß-D-N, N ', N "-triacetilchitotriose para amostras humanas. Quando ambos os substratos podem ser clivados por enzimas humanas ou do rato, foram atribuídos para amostras humanas ou do rato baseadas na eficiência do clivagem⁶.
   2. Pipeta 95 μL de solução de trabalho em cada poço de uma placa de 96 poços.
3. Adicione amostras de bioespécime à solução de trabalho.
   1. Em seguida, adicione 5 μL da amostra de teste (sangue/BAL/lisado de tecido/outro líquido biológico) a cada poço.
   2. Misture a amostra na solução de trabalho para obter os resultados mais precisos e confiáveis.
      Nota: As amostras devem ser executadas em duplicatas/triplicates com atenção especial paga aos efeitos potenciais da borda. Todas as amostras devem ser pré-aquecido para minimizar o efeito de borda. Como o ensaio envolve uma reação entre quitinases na amostra e substrato na solução de trabalho, é melhor trabalhar de forma relativamente rápida para minimizar a diferença no tempo entre quando a primeira amostra é revestida e a última amostra é revestida. A pipeta multicanal é recomendada.
4. Incubar a 37 ° c.
   1. Cubra a chapa e agite brevemente (5 s).
   2. Incubar a placa a 37 ° c durante 15 min. Isso permite que a reação enzimática ocorra.
5. Prepare a curva padrão.
   1. Enquanto as amostras estão incubando, prepare uma diluição em série de 4-metilumbelliferona, um padrão frequentemente utilizado na determinação fluimétrica da atividade enzimática.
   2. Diluir o estoque da solução padrão em tampão de parada para uma concentração de 5 μM.
   3. Realize uma série de diluições conforme indicado na tabela 2. Adicione os componentes na quantidade indicada e misture bem.
      Nota: A curva padrão ajuda a garantir que as amostras medidas caiam na faixa linear da curva padrão.
6. Pare a reacção com o tampão de paragem.
   1. Adicionar 200 μL de tampão de paragem a cada poço para interromper a reacção.
7. Placa os padrões.
   1. Adicione 300 μL de cada padrão por poço em duplicatas na mesma placa.
8. Leia a placa usando um leitor fluorométrica.
   1. Leia a placa em uma excitação de 360 nm, e uma emissão de 455 nm.

3. análise de dados

1. Subtrair os espaços em branco
   1. Média dos valores das diluições padrão duplicadas que não têm 4-metilumbelliferona. Subtrair esse valor de todos os outros valores gravados.
2. Faça a média das réplicas técnicas e Trace os padrões.
   1. Média as duas leituras para cada concentração e gráfico a leitura média pela concentração.
      Nota: O gráfico resultante deve parecer linear e ter um valor de R² próximo a 1. Se não, pode ser necessário refazer as normas e reler a placa para garantir a qualidade da análise dos dados.
3. Padronize os valores de leitura.
   1. Crie uma linha de melhor ajuste para os dados de padrões plotados. Divida as leituras das amostras pela inclinação da linha de melhor ajuste.
4. Compare valores de grupo de controle e grupo de variáveis.
   1. Use um teste t ou ANOVA, para mais de dois grupos, para determinar se a diferença entre os grupos é estatisticamente significante. Os valores tomarão as unidades nmol/mL · h.

Resultados

Os resultados mostrados aqui são de um estudo que mede a atividade da quitinase em amostras do soro e do Bal do tipo selvagem (C57Bl/6) e de ratos transgênicas Chit1 (no fundo C57Bl/6) que sobre-expressão o gene Chit1 em um promotor do doxiciclina. Nossos dados mostram que as amostras do soro e do Bal têm a atividade detectável do quitinase na linha de base 698,2 ± 189,9 nmol/ml · h e 485,7 ± 114 nmol/ml · h, respectivamente. A superexpressão do gene Chit1 utilizando doxiciclina em água potável por 4 semanas ...

Discussão

A atividade da quitinase surgiu como um importante biomarcador para prever a severidade da doença, a progressão da doença, a efetividade terapêutica e a presença de patógenos específicos¹⁸. Embora muitas das teorias há muito postuladas sobre o papel das quitinases não tenham sido experimentalmente comprovadas¹⁹, novos estudos têm proporcionado importantes insights sobre o papel das quitinases e quitinase como proteínas em várias doenças²...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-methylumbelliferone	Sigma	M1381	Standard: commonly used in flourimetric assays for determination of enzyme activity
4MU-GlcNAc2	Sigma	M9763	fluorescent chitinase substrate for use in mouse samples
4MU-GlcNAc3	Sigma	M5639	fluorescent chitinase substrate for use in human samples
Citric Acid-monohydrate			for use in McIlvain Buffer
Glycine			for use in Stop Buffer at a concentration of 0.3 M
Na2HPO4xH2O			for use in McIlvain Buffer
NaOH			for use in Stop Buffer at a concentration of 12 g/L
Vision Plate: Non-sterile, untreated black 96 well plate	4titude	4ti-0224