Mesure de l'activité chitinase dans les échantillons biologiques

Résumé

Présenté ici est une méthode simple pour mesurer l'activité chitinase dans les fluides biologiques tels que le lavage bronchoalvéolaire ou le sérum.

Résumé

Les chitinases sont les enzymes qui cisaillent la chitine. Même en l'absence de chitine, les mammifères ont des quantités significatives de chitinases présentes dans le corps, y compris à la ligne de base. Le rôle précis de la chitinase n'est pas connu, mais on croyait qu'il jouait un rôle important dans la digestion et la défense de l'hôte contre les aliments contenant de la chitine et les agents pathogènes, respectivement. Des travaux récents, y compris le nôtre, ont montré un rôle important de protéines chitinase et chitinase-like dans l'immunité de l'hôte et les maladies allergiques. Fait important, les activités de chitinase servent de biomarqueurs importants de la gravité de la maladie dans un large éventail de maladies, y compris les maladies inflammatoires de type 2 comme l'asthme et la fibrose pulmonaire. De même, les patients atteints de troubles génétiques comme la maladie de Gaucher ont des niveaux de chitinase significativement élevés, qui non seulement sont en corrélation avec la gravité de la maladie, mais servent également de biomarqueur fiable pour l'efficacité thérapeutique. Le protocole décrit ici une façon simple, rapide et directe de mesurer l'activité chitinase dans les échantillons de bal ou de sérum de souris et peut être largement adapté aux sujets humains et à d'autres organismes modèles en raison de la nature hautement conservée des enzymes.

Introduction

La chitinestine est le deuxième polysaccharide le plus abondant sur la terre après la cellulose, servant de composant structurel majeur d'une variété d'organismes, y compris l'exosquelette des insectes, des champignons, des levures et des algues; certains vertébrés ont également chitin¹. Chitinases sont une famille d'enzymes qui sont capables de décomposer la chitine et sont très conservés tout au long de l'évolution des espèces allant des bactéries aux mammifères^2,3. En plus des chitinases, les mammifères ont également des protéines chitinase-comme qui sont semblables aux chitinases dans leur capacité à lier la chitine mais diffèrent en ce qu'ils manquent de capacité enzymatique de cencouper la chitine⁴.

Bien que la chitine et les chitinases aient été étudiées depuis longtemps, avec des études remontant au début des années 1900, l'accent a été mis sur leur rôle dans les insectes et autres invertébrés. En fait, ce n'est que dans les années 1960 que l'on a découvert que les vertébrés avaient des chitinases. À l'aide d'un étosay à base de chitobiase, il a été démontré que des chitinases se trouvaient dans le tube digestif d'un certain nombre de vertébrés, y compris des lézards et des merles, une observation qui est présumée être due à la consommation d'organismes contenant de la chitine comme les insectes^5. .

Les mammifères ont deux formes enzymatiquement actives de chitinase : la chitinase acide de mammifères (AMCase ; égalementconnue sous le nom chIT2 et CHIA) et la chitotriosidase (CHIT1) 4. Ces deux protéines sont capables d'hydrolyser la chitin. Cependant, CHIT1 est plus enzymatiquement actif chez l'homme, où presque toute l'activité chitinase est dérivée de CHIT1. ⁴ Chez la souris, Chit1 et AMCase contribuent presque également à l'activité chitinase globale⁶. D'autre part, les protéines chitinase-comme manquent d'activité chitinase.

Chit1 est principalement sécrété par les macrophages et est souvent considérécomme une réponse immunitaire aux agents pathogènes contenant de la chitin7 . L'enzyme a également été montré pour être impliqué dans la maturation des monocytes dans les deux sous-types de macrophage M1 et M2, même sans la présence du substrat chitin⁸. En outre, il peut également être impliqué dans la maturation d'autres cellules immunitaires, y compris les cellules de type 2 (Th2) d'aide T et les éosinophiles, comme cela s'est avéré être le cas dans l'infection pulmonaire cryptococcique⁹. Ces études indiquent un rôle complexe des chitinases dans le système immunitaire.

Ces dernières années, les niveaux de Chit1 ont été trouvés pour servir de biomarqueur important de la progression pour plus de 40 maladies humaines différentes, y compris les maladies de stockage lysosomal, les maladies infectieuses, les maladies respiratoires, les maladies endocriologiques, maladies neurologiques, et d'autres (révisé¹⁰). Dans beaucoup de ces maladies, les niveaux de Chit1 sont un prédicteur fort de la sévérité de la maladie et de l'efficacité thérapeutique¹⁰.

Comme les chitinases ont acquis une réputation de biomarqueur pour de nombreuses conditions médicales, y compris la maladie de Gaucher, des outils et des essais ont été développés pour faciliter les tests de présence de chitinase. Les méthodes plus anciennes incluent la procédure de Schales, un protocole adapté d'un essai de glucose sanguin, et la méthode de 3,5 acide dinitrosalicolilique (DNS). Cependant, ces méthodes sont souvent sensibles au temps et techniquement difficiles¹¹. La procédure pour ces deux tests nécessite la réduction des oxydants inorganiques, ferricyanide dans le cas de la procédure des Schales par exemple, produisant un changement de couleur qui ne peut être mesuré spectrophotométriquement. En outre, les deux tests impliquent une étape de chauffage ou d'ébullition qui est à la fois long et nécessaire pour la couleur de se développer^12,13.

Décrit ici est un test fluorémétrique rapide et simple pour déterminer les niveaux de chitinase dans les échantillons de mammifères^14,15. Deux des échantillons utilisés ici comprennent le sérum et les liquides de lavage bronchoalvéolaire (BAL); l'activité de chitinase a également été mesurée dans le lait maternel et les échantillons d'urine, et la technique peut être exécutée dans ce type d'échantillons aussi bien que dans n'importe quel autre fluide biologique^16,17.

Protocole

Toutes les procédures animales ont été exécutées selon un protocole approuvé par l'IACUC à l'école de médecine de l'Université Yale.

1. Collection d'échantillons de souris

1. Anesthésie
   1. Anesthésiez les souris à l'aide de kétamine et de xylazine (100 mg/kg de kétamine et 10 mg/kg de xylazine).
2. Collecte d'échantillons de sang
   1. Confirmer la profondeur de l'anesthésie par la non-réactivité à une pincée d'orteil.
   2. Ouvrez chirurgicalement la cavité thoracique pour exposer le cœur.
   3. Insérez une aiguille de 26,5 G dans le ventricule gauche et collectez le sang dans une seringue.
      REMARQUE: Typiquement, environ 0,5 à 1 ml de sang peut être récolté à partir d'une souris saine de 20 à 25 g.
   4. Recueillir le sang dans des tubes héparinisés, pour la collecte de plasma, ou des tubes non héparinisés pour la collecte de sérum.
3. Collection de liquide de lavage bronchoalveolar (BAL)
   1. Pour recueillir le BAL, faire une coupe verticale sur le cou pour exposer la trachée.
   2. Cannuer la trachée à l'aide d'un cathéter de 22 G et la fixer fermement à l'aide d'une ficelle afin d'éviter les fuites du nez de la souris.
   3. Injectez lentement deux aliquots de saline stérile tamponnée par phosphate (PBS, 0,75 ml chacun) dans les poumons par la trachée et récupérez-la.
   4. Mettre en commun les aliquots et rester sur la glace pour une analyse plus approfondie.
4. Traitement des échantillons biologiques.
   1. Échantillon de sang : frais (plasma) ou après avoir permis la coagulation pendant 4 h (sérum), centrifugeuse à 600 x g pendant 10 min. Prenez le supernatant et congelez-le pour le stockage ou utilisez-le pour l'expérience.
   2. BAL: Centrifuger l'échantillon à 350 x g pendant 5 min. Prenez le supernatant et congelez-le pour le stockage ou utilisez-le pour l'expérience.

2. Assay chitinase

REMARQUE: La science derrière l'exemple est relativement simple. Un substrat non fluorescent est clivé par la chitinase enzymatiquement active pour produire un produit fluorescent, qui est alors mesuré comme marqueur indirect de l'activité chitinase. Les chitinases dans les échantillons décomposent le substrat 4-methylumbelliferyl-D-N, N'-diacetylchitobiose présent dans le tampon 1x McIlvain. Une molécule fluorescente 4-methylumbelliferyl est libérée. En mesurant la fluorescence totale de chaque puits, nous obtenons une mesure précise de la chitinase active dans chaque échantillon. Parce que la dégradation de la chitine par chitinase est une réaction hydrolytique, le tampon d'arrêt, un mélange de 0,3 M de glycine et de NaOH (12,0 g/L au pH 10,6), met fin à la dégradation de la chitine en créant un environnement trop basique pour que l'enzyme fonctionne.

1. Préparer les substrats, les normes et les solutions.
   1. Préparer le tampon McIlvain. Le tampon McIlvain est composé de 0,1 M de citrate et de 0,2 M de phosphate à un pH de 5,2. Diluer à un rapport de 1:1 pour 1x tampon McIlvain.
   2. Dissoudre à la fois 4-methylumbelliferyl-D-N, N'-diacetylchitobiose et 4-methylumbelliferyl -D-N, N', N"-triacetylchitotriose en 1x McIlvain Buffer à une concentration de 500 M chacun.
      REMARQUE: La solution de stock peut être stockée à -20 oC pour d'autres utilisations ; mieux stocké sain d'aliquots.
   3. Dissoudre la norme, 4-méthylumbelliferone, à une concentration de 0,1 mM dans le tampon d'arrêt (mélange de 0,3 M de glycine et de NaOH (12,0 g/L au pH 10,6)) pour créer la solution standard de stock courbe.
2. Créez et plaquez la solution de travail.
   1. Combinez 1x McIlvain Buffer et le substrat de chitin 4-methylumbelliferyl-D-N, N'-diacetylchitobiose pour créer la solution de travail. Pour chaque 10 échantillons, mélanger 100 l de substrat avec 2,17 ml de tampon McIlvain de 1 x 1x. Voir tableau 1 pour des calculs supplémentaires basés sur la taille de l'échantillon.
      REMARQUE: Utilisez 4-methylumbelliferyl MD-D-N, N', N"-triacetylchitotriose pour les échantillons humains. Bien que les deux substrats peuvent être clivés par des enzymes humaines ou de souris, ils ont été attribués pour des échantillons humains ou de souris en fonction de l'efficacité du clivage⁶.
   2. Pipette 95 l de solution de travail dans chaque puits d'une plaque de 96 puits.
3. Ajouter des échantillons de biospécimens à la solution de travail.
   1. Ensuite, ajoutez 5 ll de l'échantillon d'essai (sang/BAL/lysate tissulaire/autre liquide biologique) à chaque puits.
   2. Mélangez l'échantillon dans la solution de travail pour obtenir les résultats les plus précis et les plus fiables.
      REMARQUE: Les échantillons doivent être exécutés en doublons/triplicates avec une attention particulière accordée aux effets de bord potentiels. Tous les échantillons doivent être réchauffés à l'avance afin de minimiser l'effet de bord. Comme l'analyse implique une réaction entre les chitinases dans l'échantillon et le substrat dans la solution de travail, il est préférable de travailler relativement rapidement pour minimiser la différence de temps entre le moment où le premier échantillon est plaqué et le dernier échantillon est plaqué. Pipette multicanal est recommandée.
4. Incuber à 37 oC.
   1. Couvrir la plaque et secouer brièvement (5 s).
   2. Incuber la plaque à 37 oC pendant 15 min. Cela permet à la réaction enzymatique d'avoir lieu.
5. Préparer la courbe standard.
   1. Pendant que les échantillons couvent, préparez une dilution en série de 4-méthylumbelliferone, une norme souvent utilisée dans la détermination fluormétrique de l'activité enzymatique.
   2. Diluer le stock de la solution standard dans le tampon d'arrêt à une concentration de 5 M.
   3. Effectuer une série de dilutions comme indiqué dans le tableau 2. Ajouter les composants dans la quantité indiquée et bien mélanger.
      REMARQUE: La courbe standard permet de s'assurer que les échantillons mesurés tombent dans la plage linéaire de la courbe standard.
6. Arrêtez la réaction avec le tampon d'arrêt.
   1. Ajouter 200 l de tampon d'arrêt à chaque puits pour arrêter la réaction.
7. Plaquer les normes.
   1. Ajouter 300 L de chaque norme par puits en doublons sur la même plaque.
8. Lisez la plaque à l'aide d'un lecteur fluorométrique.
   1. Lire la plaque à une excitation de 360 nm, et une émission de 455 nm.

3. Analyse des données

1. Soustrayez les blancs
   1. Moyenne des valeurs des dilutions standard en double qui n'ont pas de 4-méthylumbelliferone. Soustrayez cette valeur de toutes les autres valeurs enregistrées.
2. Prenez la moyenne des répliques techniques et tracez les normes.
   1. Moyenne des deux lectures pour chaque concentration et graphique de la lecture moyenne par concentration.
      REMARQUE: L'intrigue résultante doit sembler linéaire et avoir une valeur R² proche de 1. Si ce n'est pas le cas, il peut être nécessaire de refaire les normes et de relire la plaque pour assurer la qualité de l'analyse des données.
3. Normaliser les valeurs de lecture.
   1. Créez une ligne de choix pour les données de normes tracées. Divisez les suites des échantillons par la pente de la ligne la mieux adaptée.
4. Comparez les valeurs du groupe témoin et du groupe variable.
   1. Utilisez un test t ou ANOVA, pour plus de deux groupes, pour déterminer si la différence entre les groupes est statistiquement significative. Les valeurs prendront les unités nmol/mL-h.

Résultats

Les résultats présentés ici proviennent d'une étude mesurant l'activité chitinase dans des échantillons de sérum et de BAL de type sauvage (C57BL/6) et de souris transgéniques Chit1 (sur le fond C57BL/6) qui surexpriment le gène Chit1 sur un promoteur de doxycycline. Nos données montrent que les échantillons de sérum et de BAL ont une activité de chitinase détectable à la ligne de base 698,2 - 189,9 nmol/mL-h et 485,7 - 114 nmol/mlâh, respectivement. La surexpression du gène Chit1 à l'aide de la doxycyc...

Discussion

L'activité chitinase est apparue comme un biomarqueur important pour prédire la gravité de la maladie, la progression de la maladie, l'efficacité thérapeutique et la présence d'agents pathogènes spécifiques¹⁸. Bien que beaucoup de théories longtemps postulées sur le rôle des chitinases n'ont pas été expérimentalement^prouvé19, de nouvelles études ont fourni des idées importantes sur le rôle des chitinases et chitinase comme les protéines dans diverses mala...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-methylumbelliferone	Sigma	M1381	Standard: commonly used in flourimetric assays for determination of enzyme activity
4MU-GlcNAc2	Sigma	M9763	fluorescent chitinase substrate for use in mouse samples
4MU-GlcNAc3	Sigma	M5639	fluorescent chitinase substrate for use in human samples
Citric Acid-monohydrate			for use in McIlvain Buffer
Glycine			for use in Stop Buffer at a concentration of 0.3 M
Na2HPO4xH2O			for use in McIlvain Buffer
NaOH			for use in Stop Buffer at a concentration of 12 g/L
Vision Plate: Non-sterile, untreated black 96 well plate	4titude	4ti-0224