Измерение активности читиназа в биологических образцах

Резюме

Здесь представлен простой метод измерения активности хитиназы в биологических жидкостях, таких как бронхоальвеолярная лаваж или сыворотка.

Аннотация

Читиназа являются ферментами, которые расщепляют хитин. Даже при отсутствии хитина млекопитающие имеют значительное количество хитиназах, присутствующих в организме, в том числе на исходном уровне. Точная роль хитиназа не известна, однако считалось, что она играет важную роль в пищеварении и защите организма от содержания хитина и патогенов, соответственно. Последние работы, в том числе наша, показали важную роль хитиназа и хитиназа, как белки в иммунитет хозяина и аллергических заболеваний. Важно отметить, что хитиназа деятельности служат важными биомаркерами тяжести заболевания в широком диапазоне заболеваний, включая тип 2 воспалительных заболеваний, таких как астма и легочный фиброз. Аналогичным образом, пациенты с генетическими расстройствами, как болезнь Гоше имеют значительно повышенный уровень хитиназа, которые не только коррелируют с тяжестью заболевания, но и служат надежным биомаркером для терапевтической эффективности. В описанном здесь протоколе описывается простой, быстрый и простой способ измерения активности хитиназы в образцах БАТ или сыворотки мышей и может быть широко адаптирован к человеческим субъектам и другим типообразуя организмам из-за высокосохранительной природы ферментов.

Введение

Читин является вторым наиболее распространенным полисахаридом на земле после целлюлозы, выступающей в качестве основного структурного компонента различных организмов, включая экзоскелет насекомых, грибов, дрожжей и водорослей; некоторые позвоночные также имеют хитин¹. Читиназы представляют собой семейство ферментов, которые способны разрушать хитин и высоко сохраняются на протяжении всей эволюции в видах, начиная от бактерий до млекопитающих^2,3. В дополнение к хитиназы, млекопитающие также имеют хитиназы, как белки, которые похожи на хитиназы в их способности связывать хитин, но отличаются тем, что они не имеют ферментатической способности расщеплять хитин⁴.

Хотя хитин и хитиназы уже давно изучены, исследования датируются началом 1900-х годов, основное внимание уделяется их роли в насекомых и других беспозвоночных. В самом деле, он не был до 1960-х годов, когда позвоночные были найдены, что хитиназа на всех. Использование цитобиазного анализ, хитиназы были показаны, чтобы быть найдены в пищеварительном тракте ряда позвоночных, включая ящериц и черных дроздов-наблюдение предположил, что из-за потребления хитина содержащих организмов, таких как насекомые⁵ .

Млекопитающие имеют две ферментативно активные формы хитиназы: кислую хитиназу млекопитающих (AMCase; также известный как CHIT2 и CHIA) и chitotriosidase (CHIT1)⁴. Оба этих белка способны гидролизовать хитин. Тем не менее, CHIT1 более ферментативно активен у людей, где почти вся активность хитиназы происходит от CHIT1. ⁴ У мышей, как Chit1 и AMCase почти в равной степени способствовать общей активности хитиназы⁶. С другой стороны, хитиназоподобные белки не имеют хитиназной активности.

Chit1 в основном выделяется макрофагами и часто считается иммунным ответом на хитинсодержащие патогены⁷. Фермент также было показано, что участвует в созревании моноцитов в обоих M1 и M2 макрофаг подтипов, даже без присутствия субстрата хитина⁸. Кроме того, он также может быть вовлечен в созревание других иммунных клеток, включая T помощник типа 2 (Th2) клетки и эозинофилы, как было показано в случае криптококковой инфекции легких⁹. Эти исследования указывают на сложную роль хитиназав в иммунной системе.

В последние годы, Chit1 уровни были найдены в качестве важного биомаркера прогрессирования для более чем 40 различных заболеваний человека, включая лисосомальные заболевания хранения, инфекционные заболевания, респираторные заболевания, эндокринологические заболевания, сердечно-сосудистые заболеваний, неврологических заболеваний и др. (обзор¹⁰). Во многих из этих заболеваний, уровни Chit1 являются сильным предиктором тяжести заболевания и терапевтической эффективности¹⁰.

Как хитиназа приобрели репутацию биомаркера для многочисленных заболеваний, включая болезнь Гоше, инструменты и анализы были разработаны для облегчения тестирования на наличие хитиназа. Более старые методы включают процедуру Schales, протокол приспособленный от испытания глюкозы крови, и метод 3.5 динитрозалиловной кислоты (DNS). Тем не менее, эти методы часто чувствительны к времени и технически трудно¹¹. Процедура для обоих из этих испытаний требует уменьшения неорганических окислителей, ferricyanide в случае процедуры Schales например, производя изменение цвета которое можно только измерить спектрофотометрическо. Кроме того, оба теста включают нагревание или кипячение шаг, который является одновременно трудоемким и необходимым для цвета развиваться^12,13.

Описано здесь быстрый и простой фторметрический анализ для определения уровня хитиназы в образцах млекопитающих^14,15. Два из используемых здесь образцов включают сыворотку и бронхоальвеолярные лавовые жидкости (BAL); хитиназа активность также измеряется в грудном молоке и моче образцов, и техника может быть выполнена в этих типах образцов, а также в любой другой биологической жидкости^16,17.

протокол

Все процедуры для животных были выполнены в соответствии с протоколом, утвержденным IACUC в Медицинской школе йельского университета.

1. Коллекция образцов мышей

1. Анестезия
   1. Анестезия мышей с использованием кетамина и ксилазина (100 мг/кг кетамина и 10 мг/кг ксилазина).
2. Сбор образцов крови
   1. Подтвердите глубину анестезии неотзывчивостью к щепотке ног.
   2. Хирургически открыть грудную полость, чтобы разоблачить сердце.
   3. Вставьте 26,5 G иглу в левый желудочек и соберите кровь в шприц.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, около 0,5-1 мл крови можно собрать из здорового 20-25 г мыши.
   4. Сбор крови в гепаринизированных трубах, для сбора плазмы, или негепаринизированных труб для сбора сыворотки.
3. Коллекция бронхоальвеолярной жидкости для лаважа (BAL)
   1. Чтобы собрать BAL, сделать вертикальный разрез на шее, чтобы разоблачить трахеи.
   2. Cannulate трахеи с 22 G катетер и закрепите его твердо с помощью строки для того, чтобы предотвратить утечку из носа мыши.
   3. Медленно введите два аликота стерильного фосфатного солей (PBS, 0,75 мл каждый) в легкие через трахею и извлекайте обратно.
   4. Бассейн aliquots и держать на льду для дальнейшего анализа.
4. Обработка биологических образцов.
   1. Образец крови: либо свежий (плазма) или после разрешения свертывания в течение 4 ч (сыворотка), центрифуга при 600 х г в течение 10 мин. Возьмите супернатант и либо заморозить для хранения или использовать для эксперимента.
   2. BAL: Центрифуга образец на 350 х г в течение 5 мин. Возьмите супернатант и либо заморозить для хранения или использовать для эксперимента.

2. Читиназа Ассей

ПРИМЕЧАНИЕ: Наука, лежащая в основе асссея, относительно проста. Нефлуоресцентный субстрат расщепляется ферментативно активной хитиназы для производства флуоресцентного продукта, который затем измеряется как косвенный маркер активности хитиназы. Хитиназа в образцах сломать субстрата 4-метилумбелайлилл-D-N, N'-diacetylchitobiose присутствует в буфере 1x McIlvain. Высвобождается флуоресцентная молекула 4-метилумбелийрил. Измеряя общую флуоресценцию каждой скважины, мы получаем точное измерение активной хитиназы в каждом образце. Поскольку распад хитина за хитиназой является гидролитической реакцией, стоп-буфер, смесь 0,3 М глицина и NaOH (12,0 г/л при рН 10,6), завершает распад хитина, создавая среду, которая слишком базова для работы фермента.

1. Подготовьте субстраты, стандарты и решения.
   1. Подготовьте буфер McIlvain. McIlvain Buffer состоит из 0,1 М цитрат и 0,2 М фосфата при рН 5,2. Разбавить в соотношении 1:1 для буфера 1x McIlvain.
   2. Растворите как 4-метилумвелайлайлайл-D-N, N'-diacetylchitobiose и 4-метилумбелайлил з-Д-Н, N', N"-triacetylchitotriose в 1x McIlvain буфера до концентрации 500 мкм каждый.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стоковое решение может храниться при -20 градусов по Цельсию для дальнейшего использования; лучше всего хранить в aliquots.
   3. Растворите стандартный, 4-метилюмбеллиферон, до концентрации 0,1 мМ в стоп-буфере (смесь 0,3 М глицина и NaOH (12,0 г/л при рН 10,6)) для создания стандартного раствора кривой запаса.
2. Создайте и наплитуйте рабочее решение.
   1. Комбинат 1x McIlvain буфера и хитина субстрата 4-метилумбелиферил-D-N, N'-diacetylchitobiose для создания рабочего решения. На каждые 10 образцов смешайте 100 кЛ субстрата с 2,17 мл 1x буфера McIlvain. См таблица 1 для дополнительных расчетов на основе размера выборки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 4-метилумбелиферил ю-D-N, N', N"-триацетилхитотиоз для человеческих образцов. Хотя оба субстрата могут быть расщеплены либо человеческими или мышиными ферментами, они были назначены для образцов человека или мыши на основе эффективности расщепления^6.
   2. Пипетка 95 л рабочего раствора в каждую скважину пластины из 96 колодцев.
3. Добавьте образцы биоспециции к рабочему раствору.
   1. Затем добавьте 5 кЛ испытательного образца (кровь/BAL/tissue lysate/other биологическая жидкость) к каждому колодцу.
   2. Смешайте образец в рабочее решение для получения наиболее точных и надежных результатов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы должны быть запущены в дубликаты / трипликаты с особым вниманием к потенциальным эффектам края. Все образцы должны быть предварительно разогреты, чтобы свести к минимуму эффект края. Поскольку анализ включает в себя реакцию между хитиназами в образце и субстратом в рабочем растворе, лучше всего работать относительно быстро, чтобы свести к минимуму разницу во времени, когда первый образец покрылся и последний образец покрыли. Рекомендуется многоканальный пипетка.
4. Инкубировать при 37 градусах Цельсия.
   1. Накройте тарелку и встряхните кратко (5 с).
   2. Инкубировать тарелку при 37 градусах по Цельсию в течение 15 мин. Это позволяет проводить ферментативную реакцию.
5. Подготовьте стандартную кривую.
   1. В то время как образцы инкубации, подготовить серийное разбавление 4-метилумбеллиферон, стандарт часто используется в фторметрическом определении активности фермента.
   2. Разбавить запас стандартного раствора в стоп-буфере до концентрации 5 мкм.
   3. Выполните серию разбавлений, как указано в таблице 2. Добавить компоненты в указанном количестве и хорошо перемешать.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартная кривая помогает гарантировать, что измеренные образцы попадают в линейный диапазон стандартной кривой.
6. Остановите реакцию стоп-буфером.
   1. Добавьте 200 юл стоп-буфера к каждой скважине, чтобы остановить реакцию.
7. Плита стандартов.
   1. Добавьте 300 кл.с каждого стандарта в колодец в дубликатах на одной тарелке.
8. Прочитайте пластину с помощью флюорометрического считывателя.
   1. Прочитайте пластину при возбуждении 360 нм, а выброс 455 нм.

3. Анализ данных

1. Вычесть пробелы
   1. Среднее значение дубликатов стандартных разбавлений, которые не имеют 4-метилюмбеллиферона. Вычесть это значение из всех других зарегистрированных значений.
2. Возьмите в среднем технические реплики и график стандартов.
   1. Среднее два показания для каждой концентрации и график среднего чтения по концентрации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полученный участок должен выглядеть линейным и иметь значение R 2, близкое к 1. В противном случае может возникнуть необходимость переделать стандарты и перечитать табличку, чтобы обеспечить качество анализа данных.
3. Стандартизировать значения считываемого.
   1. Создайте наиболее подходящее для данных о начертанных стандартах. Разделите считывательные образцы по склону наиболее подходящей линии.
4. Сравните значения из контрольной и переменной группы.
   1. Используйте t-test или ANOVA для более чем двух групп, чтобы определить, является ли разница между группами статистически значимой. Значения будут принимать единицы nmol/mL'h.

Результаты

Результаты, показанные здесь, взяты из исследования, измеряя активность хитиназы в сыворотке крови и BAL образцах дикого типа (C57BL/6) и chit1 трансгенных мышей (на фоне C57BL/6), которые переэкспрессируют ген Chit1 на промоторизме доксициклина. Наши данные показывают, что оба образца сыворотки и БА?...

Обсуждение

Активность читиназа стала важным биомаркером для прогнозирования тяжести заболевания, прогрессирования заболевания, терапевтической эффективности и наличия специфических патогенов^18. Хотя многие из давно постулируемых теорий о роли хитиназ не были экспериментально док...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-methylumbelliferone	Sigma	M1381	Standard: commonly used in flourimetric assays for determination of enzyme activity
4MU-GlcNAc2	Sigma	M9763	fluorescent chitinase substrate for use in mouse samples
4MU-GlcNAc3	Sigma	M5639	fluorescent chitinase substrate for use in human samples
Citric Acid-monohydrate			for use in McIlvain Buffer
Glycine			for use in Stop Buffer at a concentration of 0.3 M
Na2HPO4xH2O			for use in McIlvain Buffer
NaOH			for use in Stop Buffer at a concentration of 12 g/L
Vision Plate: Non-sterile, untreated black 96 well plate	4titude	4ti-0224