מדידת פעילות השינואז בדגימות ביולוגיות

Summary

מוצג כאן היא שיטה פשוטה למדוד פעילות chitinase בנוזלים ביולוגיים כגון שאיפה ברונבשיים או סרום.

Abstract

השינוסים הם האנזימים. שקליב כיגין גם בהיעדר כלאין, ממאנים יש כמויות משמעותיות של השטיות הקיימות בגוף, כולל בבסיס. התפקיד המדויק של chitinase אינו ידוע, אולם זה היה האמין לשחק תפקיד חשוב בעיכול והגנה מארחים נגד המזון המכיל מזון פתוגנים, בהתאמה. העבודה האחרונה, כולל שלנו, הראה תפקיד חשוב של מחלת המין הצ והחלבונים בחסינות המארחת ומחלות אלרגיות. חשוב מכך, פעילויות chitinase לשמש בסמנים חשובים של חומרת המחלה במגוון רחב של מחלות כולל סוג 2 מחלות דלקתיות כגון אסטמה פיברוזיס ריאתי. באופן דומה, חולים עם הפרעות גנטיות כמו מחלת Gaucher יש משמעותית רמות chitinase גבוהות, אשר לא רק לתאם עם חומרת המחלה אלא גם לשמש בסמנים אמין עבור יעילות טיפולית. הפרוטוקול המתואר כאן מתאר את הדרך פשוטה, מהירה, וישירה כדי למדוד פעילות chitinase בדגימות בל או סרום של עכברים והוא יכול להיות מותאם באופן נרחב לנושאים בני אדם ואורגניזמים מודל אחרים בשל הטבע שימור מאוד של אנזימים.

Introduction

כיאין הוא הרב ביותר הנפוץ ביותר על פני כדור הארץ לאחר תאית, המשמש כמרכיב המבני העיקרי של מגוון של אורגניזמים כולל שלד חיצוני של חרקים, פטריות, שמרים, אצות; בעלי חוליות מסוימים כוללים גם את הצ¹. השינוסים הם משפחה של אנזימים המסוגלים לשבור את הצ ונשמרים מאוד במהלך האבולוציה במינים הנעים מחיידקים ליונקים^2,3. בנוסף על כוונון, יונקים יש גם chitinases כמו חלבונים אשר דומים chitinases ביכולתם לאגד כיטין אבל שונים כי הם חסרי יכולת אנזימטית לקליב את הצ'יטוס⁴.

למרות שצ וכיטיות כבר נחקרו מזמן-בחקירות שראשיתה בתחילת 1900-המוקד העיקרי היה בתפקידם בחרקים ובחסרי חוליות אחרים. למעשה, זה לא היה עד שנות ה-60 כאשר נמצאו בעלי חוליות בכלל. באמצעות שימוש בשיטה המבוססת על צ'יטיואז, הוצגו השינוסים שנמצאו במערכת העיכול של מספר בעלי חוליות, כולל לטאות ועופות שחורות – תצפית המשוערות להיות בשל צריכת האורגניזמים המכילים כגון חרקים⁵ .

ליונקים יש שני צורות אנזימליות הפעילות של chitinase: מיונקים חומציים (AMCase; הידוע גם בשם CHIT2 ו-CHIA) ו chitotriosidase (CHIT1)⁴. שני החלבונים הללו מסוגלים. לעשות הידרוליזינג כיגין עם זאת, CHIT1 הוא הפעיל אנזימטי יותר בבני אדם, שם כמעט כל פעילות chitinase נגזרת מ CHIT1. ⁴ בעכברים, הן Chit1 ו-amcase כמעט באופן שווה לתרום פעילות chitinase הכולל⁶. מצד שני, חלבונים כמו...

Chit1 מופרש בעיקר על ידי מקרופאגים והוא נחשב לעתים קרובות להיות תגובה חיסונית כאשר המכיל פתוגנים המכילים⁷. האנזים הוכח גם להיות מעורב בהבשלה של מונוציטים לשני M1 ו M2 מקרופאג תת, גם ללא נוכחות של המצע כיטין⁸. יתר על כן, זה עשוי להיות גם מעורב בהבשלה של תאים חיסוניים אחרים כולל T מסייע סוג 2 (Th2) תאים ו אאוזינופילים-כפי שהוצג להיות במקרה של זיהום ריאות cryptococcal⁹. מחקרים אלה מצביעים על תפקיד מורכב של כביסים במערכת החיסונית.

בשנים האחרונות, Chit1 רמות נמצאו לשמש ביוארקר חשוב של התקדמות עבור מעל 40 מחלות אנושיות שונות, כולל מחלות אחסון lysoזומלית, מחלות זיהומיות, מחלות נשימה, מחלות endocrinological, וכלי דם מחלות, מחלות נוירולוגיות ואחרות (נבדקו¹⁰). ברבים ממחלות אלה, רמות של Chit1 הם מנבא חזק של חומרת המחלה ואת האפקטיביות הטיפולית¹⁰.

כמו chitinases השיגו מוניטין כמו בסמנים עבור מצבים רפואיים רבים כולל מחלת gaucher, כלים בחני פותחו כדי להקל על בדיקות של נוכחות chitinases. שיטות מבוגרות יותר כוללות הליך של Schales, פרוטוקול המותאם מבדיקת הגלוקוז בדם, ואת 3, 5 dinitרוזלין חומצה (DNS) שיטה. עם זאת, שיטות אלה הן לעתים קרובות רגישות הזמן ומבחינה טכנית קשה¹¹. ההליך עבור שני בדיקות אלה דורש הפחתת חמצון אורגניים, ferricyanide במקרה של ההליך של Schales למשל, הפקת שינוי צבע כי ניתן רק למדוד spectrophotometrically. בנוסף, שתי הבדיקות כרוכות בחימום או בצעד רותח שהוא זמן רב והכרחי לצבע לפתח^12,13.

המתואר כאן הוא שיטה מהירה ופשוטה פלוורימטרית כדי לקבוע רמות של צ'יטאנאז בדגימות של ממיונקים^14,15. שניים מהדגימות המשמשות כאן כוללות ששטיפה סרום וברונשיים (BAL); פעילות chitinase נמדדה גם בדגימות חלב ושתן, וניתן לבצע את הטכניקה בסוג זה של דגימות כמו גם בכל נוזל ביולוגי אחר^16,17.

Protocol

כל הליכי בעלי החיים בוצעו תחת פרוטוקול מאושר IACUC בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת ייל.

1. אוסף דוגמאות עכבר

1. הרדמה
   1. עכברים מורדם באמצעות קטמין ו xylazine (100 מ"ג/ק ג של קטמין ו 10 מ"ג/ק"ג של xylazine).
2. אוסף דגימות דם
   1. לאשר את עומק ההרדמה על ידי אי היענות לצביטה בבוהן.
   2. לפתוח בניתוח את חלל החזה. כדי לחשוף את הלב
   3. הכנס מחט 26.5 G לתוך החדר השמאלי ולאסוף דם לתוך מזרק.
      הערה: בדרך כלל, כ 0.5 – 1 מ ל של דם ניתן לקצור מן בריא 20-25 g העכבר.
   4. לאסוף את הדם בצינורות heparinized, עבור אוסף פלזמה, או צינורות שאינם heparinized עבור אוסף הנסיוב.
3. אוסף של נוזל ברונמכתשי (בל)
   1. כדי לאסוף את בל, לעשות חתך אנכי על הצוואר כדי לחשוף את קנה הנשימה.
   2. צינורית קנה הנשימה עם קטטר G 22 ולאבטח אותו בחוזקה באמצעות מחרוזת כדי למנוע דליפה מתוך האף של העכבר.
   3. באיטיות להזריק שתי מנות של מלוחים סטרילית מחסני פוספט (PBS, 0.75 mL כל אחד) לתוך הריאות דרך קנה הנשימה ולאחזר חזרה.
   4. מאגר המים ולשמור על קרח לניתוח נוסף.
4. . מעבד את הדגימות הביולוגי
   1. דגימת דם: טרי (פלזמה) או לאחר התרת קרישה עבור 4 שעות (סרום), צנטריפוגה ב 600 x g עבור 10 דקות. קח את הסופרנאאנט והקפא לצורך אחסון או שימוש לצורך ניסוי.
   2. BAL: צנטריפוגה את המדגם ב 350 x g עבור 5 דקות. קח את הסופרנאאנט והקפא לצורך אחסון או שימוש לצורך ניסוי.

2. שיטת השינואז

הערה: המדע העומד מאחורי המנה הוא פשוט יחסית. מצע לא פלורסנט הוא ביקע על ידי chitinase הפעיל אנזימטי כדי לייצר מוצר פלורסנט, אשר נמדד אז כסמן עקיף של פעילות chitinase. השינוסים בתוך הדגימות לשבור את המצע 4-מתיונין-D-N, N'-diacetylchitobiose הנוכחי במאגר 1x McIlvain. מולקולת פלורסנט 4-מתיונין לומוליפראיל משתחררת. על ידי מדידת הקרינה הכוללת של כל באר, אנו משיגים מדידה מדויקת של השיאינטאז הפעיל בכל דוגמה. בגלל התמוטטות של כיצין ידי chitinase היא תגובה הידרוטית, מאגר לעצור, תערובת של 0.3 M גליצין ו NaOH (12.0 g/L ב-pH 10.6), מסיים את התמוטטות של כיסין על ידי יצירת סביבה כי הוא בסיסי מדי עבור האנזים לתפקד.

1. הכן את הסובסטרטים, התקנים והפתרונות.
   1. . הכן מאגר מק מאגר McIlvain מורכב 0.1 M ציטראט ו 0.2 M פוספט ב-pH של 5.2. דלל את היחס של 1:1 עבור מאגר 1x McIlvain.
   2. מתמוסס הן 4-מתושלח-D-N, N'-diacetylchitobiose ו-4-מתיונין לומפרקסיל-D-N, N ', N '-triacetylchitotriose ב 1x מק מאגר לריכוז של 500 μM כל אחד.
      הערה: ניתן לאחסן פתרון מניות ב-20 ° צ' לשימושים נוספים; השמורים ביותר באליבטים.
   3. התמוססות תקן, 4-מתיונין, לריכוז של 0.1 מ"מ במאגר לעצור (התערובת של 0.3 M גליצין ו NaOH (12.0 g/L ב-pH 10.6)) כדי ליצור את הפתרון הרגיל מניות עקומת.
2. ליצור ולוחית את פתרון העבודה.
   1. לשלב 1 x מאגר McIlvain ו-המצע כיאין 4-מתיונין-D-N, N'-diacetylchitobiose כדי ליצור את פתרון העבודה. עבור כל 10 דגימות, לערבב 100 μL של מצע עם 2.17 mL של מאגר 1x McIlvain. ראה טבלה 1 לחישובים נוספים בהתבסס על גודל המדגם.
      הערה: השתמש 4-מתיונין לפרקסיל-D-N, N ', N-triacetylchitotriose עבור דגימות אנושיות. בעוד מצעים ניתן לעבור על ידי או אנזימים האדם או העכבר, הם הוקצו עבור כל אחד או דגימות העכבר המבוסס על יעילות של מחשוף⁶.
   2. פיפטה 95 μL של פתרון עבודה לכל טוב של צלחת 96-באר.
3. הוסף דגימות ביודגימה לפתרון העבודה.
   1. לאחר מכן, להוסיף 5 μL של דגימת הבדיקה (דם/BAL/רקמת ליפוסט/נוזל ביולוגי אחר) לכל טוב.
   2. ערבב את המדגם לתוך פתרון העבודה עבור התוצאות המדויקות והאמינות ביותר.
      הערה: יש להפעיל דגימות בכפילויות/טריליטים עם תשומת לב מיוחדת ששולמה לאפקטי קצה פוטנציאליים. כל הדגימות צריך להיות מחומם מראש כדי למזער את אפקט הקצה. כפי שהדוגמא כרוכה בתגובה בין כינויים במדגם ובמצע בפתרון העבודה, עדיף לעבוד במהירות יחסית כדי למזער את ההפרש בזמן בין כאשר המדגם הראשון מצופה והמדגם האחרון מצופה. מומלץ לעשות שפיפטה רב-ערוצי.
4. מודטה ב 37 ° c.
   1. לכסות את הצלחת ולנער בקצרה (5 s).
   2. מודקת את הצלחת ב 37 ° c עבור 15 דקות. זה מאפשר את התגובה האנזימטית להתרחש.
5. הכן את העקומה הסטנדרטית.
   1. בעוד הדגימות הן מודדיקות, להכין דילול סדרתי של 4-מתיונין, רגיל המשמש לעתים קרובות בקביעת פלוורימטרית של פעילות אנזימים.
   2. לדלל את המניה של הפתרון הרגיל במאגר לעצור לריכוז של 5 μM.
   3. ביצוע סידרה של דילול כפי שמצוין בטבלה 2. הוסף את הרכיבים בסכום שצוין וערבב היטב.
      הערה: העקומה הסטנדרטית מסייעת להבטיח שדגימות מדודות יפלו בטווח הליניארי של העקומה הסטנדרטית.
6. הפסק את התגובה באמצעות מאגר העצירה.
   1. הוסף 200 μL של מאגר העצירה לכל באר כדי לעצור את התגובה.
7. . הצלחת בסטנדרטים
   1. הוסף 300 μL של כל תקן באופן כפילויות על אותה צלחת.
8. לקרוא את הצלחת באמצעות קורא פלואורומטרי.
   1. קרא את הצלחת בעירור של 360 ננומטר, ו פליטה של 455 ננומטר.

3. ניתוח נתונים

1. הפחת את החסר
   1. ממוצע הערכים של מדלל התקן הכפול שאין להם 4 מתיונין. הפחת ערך זה מכל שאר הערכים שנרשמו.
2. לקחת ממוצע של משכפל טכני ולהתוות את הסטנדרטים.
   1. ממוצע שני הקריאות לכל ריכוז וגרף הקריאה הממוצעת בריכוז.
      הערה: העלילה המתקבלת אמורה להיראות קווית ויש לה ערך R² קרוב ל-1. אם לא, ייתכן שיהיה צורך לבצע שוב את הסטנדרטים ולקרוא שוב את הצלחת כדי להבטיח איכות של ניתוח נתונים.
3. לתקנן את ערכי הקריאה.
   1. צור קו התאמה מיטבית עבור נתוני התקנים המותווים. חלק את הפרטים של הדגימות לפי השיפוע של קו ההתאמה הטובה ביותר.
4. השוואת ערכים מקבוצת הבקרה ומקבוצת המשתנים.
   1. השתמש במבחן t או ב-ANOVA, עבור יותר משתי קבוצות, כדי לקבוע אם ההפרש בין קבוצות הוא משמעותי מבחינה סטטיסטית. הערכים יקחו את היחידות nmol/mL · h.

תוצאות

התוצאות המוצגות כאן הם ממחקר מדידת הפעילות chitinase בסרום ודגימות BAL של סוג פראי (C57BL/6) ו Chit1 העכברים הטרנסגניים (על C57BL/6 רקע) כי overexpress הגן Chit1 על מקדם דוקסיציקלין. הנתונים שלנו מראים כי שני הנסיוב וגם הדגימות בל יש לגילוי פעילות chitinase בתוכנית הבסיסית 698.2 ± 189.9 nmol/mL · h ו 485.7 ± 114 nmol/ml · h, בהתאמה. ביטוי ...

Discussion

הפעילות chitinase התפתחה בתור בסמנים חשוב לניבוי חומרת המחלה, התקדמות המחלה, היעילות הטיפולית ואת הנוכחות של פתוגנים ספציפיים¹⁸. למרות שרבות מן התיאוריות הארוכות-היסוד בנוגע לתפקיד השינוסים לא הוכחו בניסויים בגיל¹⁹, מחקרים חדשים סיפקו תובנות חשובות לתפקיד השינוסים ו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-methylumbelliferone	Sigma	M1381	Standard: commonly used in flourimetric assays for determination of enzyme activity
4MU-GlcNAc2	Sigma	M9763	fluorescent chitinase substrate for use in mouse samples
4MU-GlcNAc3	Sigma	M5639	fluorescent chitinase substrate for use in human samples
Citric Acid-monohydrate			for use in McIlvain Buffer
Glycine			for use in Stop Buffer at a concentration of 0.3 M
Na2HPO4xH2O			for use in McIlvain Buffer
NaOH			for use in Stop Buffer at a concentration of 12 g/L
Vision Plate: Non-sterile, untreated black 96 well plate	4titude	4ti-0224