Misurazione dell'attività della chitinasi nei campioni biologici

Riepilogo

Presentato qui è un metodo semplice per misurare l'attività delle chitinasi nei fluidi biologici come la lavanda bronchoalveolare o il siero.

Abstract

Le chitinasi sono gli enzimi che fendono la chitina. Anche in assenza di chitina, i mammiferi hanno quantità significative di chitinasi presenti nel corpo anche al basale. Il ruolo preciso della chitinasi non è noto, tuttavia si credeva che svolgesse un ruolo importante nella digestione e nella difesa dell'ospite contro il cibo e gli agenti patogeni che contengono la chitina, rispettivamente. Recenti lavori, tra cui il nostro, hanno mostrato un ruolo importante della chitinasi e delle proteine simili alla chitinasi nell'immunità dell'ospite e nelle malattie allergiche. È importante sottolineare che le attività di chitinasi fungono da importanti biomarcatori della gravità della malattia in un'ampia gamma di malattie, tra cui malattie infiammatorie di tipo 2 come l'asma e la fibrosi polmonare. Allo stesso modo, i pazienti con disturbi genetici come la malattia di Gaucher hanno livelli di chitinasi significativamente elevati, che non solo correlano con la gravità della malattia, ma servono anche come un biomarcatore affidabile per l'efficacia terapeutica. Il protocollo qui descritto descrive un modo semplice, rapido e diretto per misurare l'attività delle chitinasi in campioni di BAL o siero di topi e può essere ampiamente adattato a soggetti umani e altri organismi modello a causa della natura altamente conservata degli enzimi.

Introduzione

La chitina è il secondo polisaccaride più abbondante sulla terra dopo la cellulosa, servendo come componente strutturale principale di una varietà di organismi tra cui l'esoscheletro di insetti, funghi, lieviti e alghe; alcuni vertebrati hanno anche la chitina¹. Le chitinasi sono una famiglia di enzimi che sono in grado di abbattere la chitina e sono altamente conservati durante tutta l'evoluzione in specie che vanno dai batteri ai mammiferi^2,3. Oltre alle chitinasi, i mammiferi hanno anche proteine simili alla chitinasi che sono simili alle chitinasi nella loro capacità di legare la chitina, ma differiscono in quanto mancano di capacità enzimatica di fendere la chitina^{4 .}

Anche se le chitine e le chitinasi sono state studiate da tempo, con indagini risalenti ai primi anni del 1900, l'attenzione principale è stata sul loro ruolo negli insetti e in altri invertebrati. Infatti, non è stato fino al 1960, quando i vertebrati sono stati trovati ad avere chitinasi a tutti. Utilizzando un saggio a base di chitobiasi, è stato dimostrato che le chitinasi si trovano nel tratto digestivo di un certo numero di vertebrati, tra cui lucertole e merli, un'osservazione ipotizzata sia dovuta al consumo di organismi contenenti chitina come gli insetti⁵ .

I mammiferi hanno due forme enzimaticamente attive di chitinasi: chitinasi dei mammiferi acidi (AMCase, noti anche come CHIT2 e CHIA) e chitotriosidasi (CHIT1)⁴. Entrambe queste proteine sono in grado di chitina idrolmente. Tuttavia, CHIT1 è più enzimaticamente attivo negli esseri umani, dove quasi tutta l'attività della chitinasi è derivata da CHIT1. ⁴ Nei topi, sia Chit1 che AMCase contribuiscono quasi equamente all'attività complessiva della chitinasi⁶. D'altra parte, le proteine simili alle chitinasi non hanno attività di chitinasi.

Chit1 è principalmente secreto dai macrofagi ed è spesso considerato una risposta immunitaria agli agenti patogeni contenenti chitina⁷. È stato anche dimostrato che l'enzima è coinvolto nella maturazione dei monociti in sottotipi di macrofagio M1 e M2, anche senza la presenza del substrato chitina⁸. Inoltre, può anche essere coinvolto nella maturazione di altre cellule immunitarie tra cui cellule T helper di tipo 2 (Th2) ed eosinofili, come è stato dimostrato di essere il caso in infezione polmonare criptococcale⁹. Questi studi indicano un ruolo complesso delle chitinasi nel sistema immunitario.

Negli ultimi anni, i livelli di Chit1 sono stati trovati come un importante biomarcatore della progressione per oltre 40 diverse malattie umane, tra cui malattie da accumulo lisosomiale, malattie infettive, malattie respiratorie, malattie endocrinologiche, malattie cardiovascolari malattie neurologiche e altre (riviste¹⁰). In molte di queste malattie, i livelli di Chit1 sono un forte predittore di gravità della malattia e l'efficacia terapeutica¹⁰.

Come chitinasi hanno guadagnato una reputazione come biomarcatore per numerose condizioni mediche tra cui malattia di Gaucher, strumenti e saggi sono stati sviluppati per facilitare i test per la presenza di chitinasi. I metodi più vecchi includono la procedura di Schales, un protocollo adattato da un test della glicemia e il metodo 3,5 dell'acido dinitrosalicilico (DNS). Tuttavia, questi metodi sono spesso sensibili al tempo e tecnicamente difficili¹¹. La procedura per entrambi questi test richiede la riduzione di ossidanti inorganici, ferricianide nel caso della procedura di Schales, ad esempio, producendo un cambiamento di colore che può essere misurato solo spettrofotometricamente. Inoltre, entrambi i test comportano una fase di riscaldamento o ebollizione che richiede tempo e necessaria per lo sviluppo del colore^12,13.

Descritto qui è un rapido e semplice saggio fluorimetrico per determinare i livelli di chitinasi nei campioni di mammiferi^14,15. Due dei campioni qui utilizzati includono fluidi di lavaggio del siero e del bronchoalveolar (BAL); L'attività della chitinasi è stata misurata anche in campioni di latte materno e urina, e la tecnica può essere eseguita in quel tipo di campioni così come in qualsiasi altro fluido biologico^16,17.

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Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite nell'ambito di un protocollo approvato dall'IACUC presso la Yale University School of Medicine.

1. Collezione di campioni di mouse

1. Anestesizzazione
   1. Anestesizza reati con ketamina e xylazina (100 mg/kg di ketamina e 10 mg/kg di xilanina).
2. Raccolta di campioni di sangue
   1. Confermare la profondità dell'anestesia per non risposta a un pizzico di dita dei dei dei idi.
   2. Aprire chirurgicamente la cavità toracica per esporre il cuore.
   3. Inserire un ago da 26,5 G nel ventricolo sinistro e raccogliere il sangue in una siringa.
      NOT: Tipicamente, circa 0,5-1 mL di sangue può essere raccolto da un topo sano 20-25 g.
   4. Raccogliere il sangue in tubi eparanidati, per la raccolta del plasma, o tubi non eparanidati per la raccolta del siero.
3. Raccolta di liquido di lavalanga bronchoalveolar (BAL)
   1. Per raccogliere il BAL, fare un taglio verticale sul collo per esporre la trachea.
   2. Cannula con un catetere da 22 G e fissala saldamente con una corda per evitare perdite dal naso del mouse.
   3. Iniettare lentamente due aliquote di salina sterile con buffer di fosfato (PBS, 0,75 mL ciascuna) nei polmoni attraverso la trachea e recuperare indietro.
   4. Piscina aliquote e tenere sul ghiaccio per ulteriori analisi.
4. Lavorazione dei campioni biologici.
   1. Campione di sangue: fresco (plasma) o dopo aver permesso la coagulazione per 4 h (siero), centrifugare a 600 x g per 10 min. Prendere il super-ataldiante e sia congelare per lo stoccaggio o utilizzare per l'esperimento.
   2. BAL: Centrifugare il campione a 350 x g per 5 min. Prendere il super-ataldiante e sia congelare per lo stoccaggio o utilizzare per l'esperimento.

2. Chitinasi Assay

NOT: La scienza dietro l'analisi è relativamente semplice. Un substrato non fluorescente viene scisso dalla chitinasi enzimaticamente attiva per produrre un prodotto fluorescente, che viene poi misurato come marcatore indiretto dell'attività della chitinasi. Le chitinasi all'interno dei campioni scompongono il substrato 4-metillumbelliferyl-D-N, N'-diacetylchitobiose presente nel tampone 1x McIlvain. Viene rilasciata una molecola fluorescente a 4 metillumbelliferyl. Misurando la fluorescenza totale di ogni pozzo, otteniamo una misurazione accurata della chitinasi attiva in ogni campione. Poiché la ripartizione della chitinasi da chitinasi è una reazione idrolitica, il buffer di stop, una miscela di 0,3 M glicina e NaOH (12,0 g/L a pH 10,6), termina la ripartizione della chitina creando un ambiente troppo semplice per il funzionamento dell'enzima.

1. Preparare i substrati, gli standard e le soluzioni.
   1. Preparare il buffer McIlvain. McIlvain Buffer è composto da 0,1 M citrato e 0,2 M fosfato a un pH di 5,2. Diluire a un rapporto di 1:1 per 1x buffer McIlvain.
   2. Sciogliere sia 4-metilbelliferyl-D-N, N'-diacetylchitobiose e 4-metilbelliferyl-D-N, N', N"-triacetylchitotriose in 1x McIlvain Buffer a una concentrazione di 500 m ciascuno.
      NOT: La soluzione di riserva può essere immagazzinata a -20 gradi centigradi per ulteriori usi; meglio conservato in aliquote.
   3. Sciogliere lo standard, 4-metilbelliferone, ad una concentrazione di 0,1 mM in stop buffer (miscela di 0,3 M glicina e NaOH (12,0 g/L a pH 10.6)) per creare la soluzione standard di stock di curve.
2. Creare e piastrare la soluzione di lavoro.
   1. Unire 1x McIlvain Buffer e substrato di chitina 4-metilbelliferyl-D-N, N'-diacetylchitobiose per creare la soluzione di lavoro. Per ogni 10 campioni, mescolare 100 l di substrato con 2,17 mL di 1x buffer McIlvain. Vedere la tabella 1 per ulteriori calcoli in base alle dimensioni del campione.
      NOT: Utilizzare 4-metilbelliferyl -D-N, N', N"-triacetylchitotriose per campioni umani. Mentre entrambi i substrati possono essere sciolti da enzimi umani o murini, sono stati assegnati per campioni umani o murini in base all'efficienza della scissione⁶.
   2. Pipette 95 -L di soluzione di lavoro in ogni pozzo di una piastra 96-po.
3. Aggiungere campioni di biocampioni alla soluzione di lavoro.
   1. Aggiungete quindi 5 volte il campione di prova (liscia esmatica/BAL/tessuto/altro fluido biologico) ad ogni pozzo.
   2. Mescolare il campione nella soluzione di lavoro per ottenere risultati più accurati e affidabili.
      NOT: I campioni devono essere eseguiti in duplicati/triplicati con particolare attenzione ai potenziali effetti del bordo. Tutti i campioni devono essere preriscaldati per ridurre al minimo l'effetto bordo. Poiché il test comporta una reazione tra le chitinasi nel campione e il substrato nella soluzione di lavoro, è meglio lavorare relativamente rapidamente per ridurre al minimo la differenza di tempo tra quando il primo campione viene placcato e l'ultimo campione viene placcato. Si consiglia la pipetta multicanale.
4. Incubare a 37 gradi centigradi.
   1. Coprire la piastra e agitare brevemente (5 s).
   2. Incubare la piastra a 37 gradi centigradi per 15 min. Questo permette la reazione ezimatica a prendere posto.
5. Preparare la curva standard.
   1. Mentre i campioni sono in cuba, preparare una diluizione seriale di 4-metilumbelliferone, uno standard spesso utilizzato nella determinazione fluorimetrica dell'attività enzimatica.
   2. Diluire lo stock della soluzione standard in stop buffer ad una concentrazione di 5 M.
   3. Eseguire una serie di diluizioni come indicato nella tabella 2. Aggiungere i componenti nella quantità indicata e mescolare bene.
      NOT: La curva standard aiuta a garantire che i campioni misurati rientrino nell'intervallo lineare della curva standard.
6. Interrompere la reazione con stop buffer.
   1. Aggiungere 200 l di stop buffer a ogni pozzo per fermare la reazione.
7. Piastrare gli standard.
   1. Aggiungere 300 l of ogni standard per pozzo in duplicati sulla stessa piastra.
8. Leggere la piastra utilizzando un lettore fluorometrico.
   1. Leggere la piastra con un'eccitazione di 360 nm e un'emissione di 455 nm.

3. Analisi dei dati

1. Sottrarre gli spazi vuoti
   1. Calcolare la media dei valori delle diluizioni standard duplicate che non hanno 4-metilbellione. Sottrarre questo valore da tutti gli altri valori registrati.
2. Prendere la media di repliche tecniche e tracciare gli standard.
   1. Calcolare la media delle due letture per ogni concentrazione e rappresentare graficamente la lettura media per concentrazione.
      NOT: Il grafico risultante dovrebbe avere un valore R² vicino a 1. In caso contrario, potrebbe essere necessario rifare gli standard e rileggere la piastra per garantire la qualità dell'analisi dei dati.
3. Standardizzare i valori di lettura.
   1. Creare una linea di adattamento per i dati degli standard tracciati. Dividere le letture dei campioni per la pendenza della linea di adattamento.
4. Confrontare i valori del gruppo di controllo e del gruppo di variabili.
   1. Utilizzare un test t o ANOVA, per più di due gruppi, per determinare se la differenza tra i gruppi è statisticamente significativa. I valori accettano le unità nmol/mL'h.

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Risultati

I risultati mostrati di seguito provengono da uno studio che misura l'attività della chitinasi nei campioni di siero e BAL di tipo selvatico (C57BL/6) e topi transgenici Chit1 (su sfondo C57BL/6) che sovraesprimono il gene Chit1 su un promotore di doxyciclina. I nostri dati mostrano che sia i campioni di siero che di BAL hanno attività di chitinasi rilevabili in base alla linea di base 698,2 x 189,9 nmol/mL-h e 485,7 x 114 nmol/ml-h, rispettivamente. La sovraespressione del gene Chit1 che utilizza la doxycycline nell'a...

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Discussione

L'attività della chitinasi è emersa come un importante biomarcatore per prevedere la gravità della malattia, la progressione della malattia, l'efficacia terapeutica e la presenza di specifici patogeni¹⁸. Anche se molte delle teorie a lungo postulate sul ruolo delle chitinasi non sono state provate sperimentalmente¹⁹, nuovi studi hanno fornito importanti informazioni sul ruolo delle chitinasi e della chitinasi come proteine in varie malattie^2,...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-methylumbelliferone	Sigma	M1381	Standard: commonly used in flourimetric assays for determination of enzyme activity
4MU-GlcNAc2	Sigma	M9763	fluorescent chitinase substrate for use in mouse samples
4MU-GlcNAc3	Sigma	M5639	fluorescent chitinase substrate for use in human samples
Citric Acid-monohydrate			for use in McIlvain Buffer
Glycine			for use in Stop Buffer at a concentration of 0.3 M
Na2HPO4xH2O			for use in McIlvain Buffer
NaOH			for use in Stop Buffer at a concentration of 12 g/L
Vision Plate: Non-sterile, untreated black 96 well plate	4titude	4ti-0224