الثقافة الاساسيه للخلايا العصبية معزولة عن المخيخ الفئران الجنينية

Shahin Shabanipour; Azadeh Dalvand; Xiaodan Jiao; Maryam Rahimi Balaei; Seung  H. Chung; Jiming Kong; Marc.  R. Del Bigio; Hassan Marzban

doi:10.3791/60168

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

اجراء التجارب في المختبر للتفكير في الظروف المجرية باقصي قدر ممكن ليست مهمة سهله. استخدام ثقافات الخلايا الاوليه هو خطوه هامه نحو فهم بيولوجيا الخلية في كائن حي بأكمله. البروتوكول المنصوص عليه الخطوط العريضة كيفيه النمو بنجاح وثقافة الخلايا العصبية المخيخ الفئران الجنينية.

Abstract

أصبح استخدام ثقافات الخلايا الاوليه واحده من الاداات الرئيسية لدراسة الجهاز العصبي في المختبر. الهدف النهائي من استخدام هذا النظام نموذج مبسط هو توفير البيئة الدقيقة التي تسيطر عليها والحفاظ علي معدل البقاء علي قيد الحياة عاليه والسمات الطبيعية للخلايا العصبية وغير العصبية فصل قدر الإمكان تحت الظروف في المختبر. في هذه المقالة ، ونحن نظهر طريقه لعزل الخلايا العصبية الاساسيه من المخيخ الماوس النامية ، ووضعها في بيئة في المختبر ، وإنشاء نموها ، ورصد صلاحيتها والتمايز لعده أسابيع. ينطبق هذا الأسلوب علي الخلايا العصبية الجنينية التي تنفصل عن المخيخ بين الأيام الجنينية 12 – 18.

Introduction

لعده عقود ، وقد استخدمت خطوط الخلايا علي نطاق واسع كاداه عاليه الانتاجيه في الدراسات الاكلينيكيه والبحوث البيولوجية. الفعالية من حيث التكلفة ، والنمو السريع ، والحد من استخدام الحيوانية الحية هي بعض الفوائد من استخدام هذه الخلايا. ومع ذلك ، تتراكم التغييرات الجينية والتغيرات الظاهرية بعد عده مقاطع في المختبر¹. يمكن ان يؤدي التعريف الخاطئ لخطوط الخلايا والتشابه الوراثي من الخلايا الاوليه إلى تجارب غير قابله للتكرار واستنتاجات زائفه²^و³^و⁴^و⁵. ولذلك ، علي الرغم من بعض أوجه التشابه للخلايا المتمايزة مثل الخلايا العصبية (علي سبيل المثال ، الناقلات العصبية ، قنوات أيون ، مستقبلات ، وغيرها من البروتينات العصبية الخاصة) ، لا يمكن تكرار خطوط الخلايا العصبية النمط الظاهري الكامل للخلايا العصبية. استخدام الخلايا العصبية ناضجه هو خيار آخر. ومع ذلك ، هذه الخلايا غير تقسيم الخلايا للتفتل التي يصعب نشرها في الثقافة. وعلاوة علي ذلك, أعاده الدخول في دوره الخلية قد يعجل المبرمج⁶.

وقد تم تطوير ثقافة الخلايا ثلاثية الابعاد (3D) ، وثقافات الشريحة المجسمة ، والثقافات العضوية لتوفير بيئة يمكن فيها للخلايا ان ترتب في شكل ثلاثي الابعاد يحاكي الاعداد المجري. التالي ، يمكن دراسة الاتصال من خليه إلى خليه ، والهجرة ، وغزو الخلايا السرطانية في الانسجه المحيطة بها ، وتولد الاوعيه⁷. ومع ذلك ، فان التكاليف الاضافيه لاستخدام المصفوفات الخلوية الاضافيه (ECM) البروتينات أو الهلام المائي الاصطناعية كفراش ، وصعوبة في التصوير ، والتوافق مع أدوات الفحص عاليه الانتاجيه هي عيوب كبيره من الخلايا 3D الخياطة. ومن المساوئ الرئيسية للثقافة النسيجية شريحة النسيج هو استخدام عدد كبير من الكائنات والآثار السلبية للاستئصال ، مما يؤدي إلى عدم الوصول إلى الأهداف وعوامل النمو لaxotomy ، التالي وفاه الخلايا العصبية⁸.

ولذلك ، فان النهج البديل ، الذي يتجنب المشاكل مع خطوط الخلايا ، وصعوبة نمو الخلايا الناضجة ، وتعقيد الانسجه ، هو في نضج المختبر من الخلايا الاساسيه غير ناضجه. وتستمد الخلايا الاوليه مباشره من الانسجه البشرية أو الحيوانية وتنفصل باستخدام الانزيمات و/أو الطرق الميكانيكية⁹. المبادئ الرئيسية للعزل ، البذر ، والصيانة في الثقافة المتوسطة متشابهة بغض السواء عن مصدر الانسجه. ومع ذلك ، فان العوامل الغذائية اللازمة لتعزيز الانتشار والنضج هي خلايا محدده جدا⁶.

ان معرفه "تاريخ الميلاد" لكل نوع من أنواع الخلايا المخيخه شرط أساسي لتصميم تجربه الثقافة الاساسيه. بشكل عام ، والخلايا purkinje (أجهزه الكمبيوتر) والعصبية من نوى المخيخ (CN) ، يولدون قبل الخلايا الصغيرة ، بما في ذلك الخلايا العصبية (علي سبيل المثال ، سله ، والخلايا النجميه) والكريات الحبيبية. في الفئران ، تظهر أجهزه الكمبيوتر بين اليوم الجنيني (E) 10 – E13 ، في حين ان الخلايا العصبية CN في حوالي E9-E12¹⁰.

تولد الخلايا العصبية المخيخ الأخرى في وقت لاحق بكثير. علي سبيل المثال ، في الفئران ، يتم توليد السكان الفرعيين golgi من الخلايا العصبية من VZ في (~ E14 − E18) والتداخلات المتبقية (خليه سله والزنزانات النجميه) الموجودة في الطبقة الجزيئية الخروج من تقسيم خلايا السلف في المسالة البيضاء بين أوائل بعد الولادة (P) 0 – P7¹¹. يتم إنشاء الخلايا الحبيبية من المنطقة الجرثومية الخارجية (EGZ) ، وهي منطقه الإنبات الثانوية التي تستمد من الشفة المعينة اللحمية وتمر عبر تقسيم المحطة بعد الولادة. ولكن قبل ان تنشا سلائفها من الشفة المعينة من E13 – E16 ، فقد هاجرت الخلايا بالفعل علي طول سطح بيا لجعل طبقه رقيقه من الخلايا علي السطح الظهري لل anlage المخيخ. ولدت خلايا ماكروجليال غير العصبية مثل استروسيتيس و oligodendrocytes ، والتي تنشا من ظهاره عصبيه البطين ، في e 13.5 − P0 و P0 − P7 علي التوالي¹¹^،¹²^،¹³^،¹⁴ ^،¹⁵. وتستمد الخلايا الصغيرة من الخلية البدائية للخلايا النخاعية من الصفار بين الساعة^{8 – 10}وبعد الغزو إلى الجهاز العصبي المركزي يمكن الكشف عنها في دماغ الفار بواسطة E9 16.

وتستند الطريقة المعروضة في هذه المقالة علي واحد وضعت أصلا من قبل furuya et al. و tabata et al.¹⁷^,¹⁸, الذي تم الأمثل للذبح الاوليه من الخلايا purkinje المستمدة من wistar الفئران المخيخ. لدينا الآن تكييف هذه الطريقة وتعديلها بعناية لدراسة نمو الخلايا العصبية الفئران المخيخ¹⁹. علي عكس في بروتوكولنا الجديد ، الباردة تشريح المتوسط هو المخزن المؤقت الغسيل الرئيسية المستخدمة خلال التشريح والتفكك الخطوات قبل أضافه البذر المتوسطة في البروتوكول Furuya في¹⁷. هذا العازل يفتقر إلى التغذية ، وعوامل النمو ، والهرمونات (كل ذلك في دولبيكو تعديل النسر المتوسطة: خليط المغذيات F-12 [DMEM/F12]) التي هي ضرورية لدعم نمو الخلايا والبقاء علي قيد الحياة خلال الخطوات المذكورة أعلاه. الاضافه إلى ذلك ، استنادا إلى خبرتنا الواسعة مع الثقافات المخيخ الاوليه murine ، وقد استخدمنا 500 μL من الوسط الثقافي في كل بئر (بدلا من 1 مل) وزيادة تركيز ثلاثي ايودوثيرونين إلى 0.5 ng/mL ، مما يحسن نمو الخلايا العصبية ، في خاصه تلك التي لديها النمط الظاهري الخلية Purkinje ، ويعزز النمو من فروع شجيري في الثقافة. الطريقة الرئيسية التي ظهرت في هذه المقالة يمكن تطبيقها علي نطاق واسع علي القوارض الصغيرة الأخرى (علي سبيل المثال ، السناجب والهامستر) اثناء النمو الجنيني ويمكن استخدامها لدراسة نشاه الأعصاب المخيخ والتمايز في المراحل الجنينية المختلفة ، والتي تختلف بين الأنواع.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية وفقا للوائح المؤسسية ودليل رعاية واستخدام الكائنات التجريبية من المجلس الكندي لرعاية الماشية ووافقت عليها السلطات المحلية ("الرعاية الحيوانية في الحرم الجامعي Bannatyne لجنه "). وبذلت جميع الجهود للتقليل إلى ادني حد من عدد الماشية المستخدمة ومعاناتها. وأكد العمق الكافي من التخدير من خلال ملاحظه انه لم يكن هناك اي تغيير في معدل التنفس المرتبطة بالتلاعب وقرصه اصبع القدم أو منعكس القرنية.

1-الاعداد

ملاحظه: جدوله توفير الفئران الحوامل موقوتة ، استنادا إلى خطه البحث ، لما بعد الحمل E12-E18. يعتمد اختيار التوقيت علي خصائص الخلية المطلوبة (انظر أدناه). اعداد كشوف الغلاف واللوحات قبل يومين علي الأقل من التجربة. يستخدم بولي-L-اورنيثين كماده طلاء لتعزيز مرفق الخلية إلى زلات الغطاء.

معطف الغطاء ينزلق 2 أيام قبل عزل الخلية.
1. ضعي الغطاء الدائري في طبق 24 جيدا ، تحت ظروف معقمه في خزانه السلامة الاحيائيه. ترك فجوه بين كل زلة غطاء لتجنب اي تلوث.
2. أضافه 90 μL من بولي-L-اورنيثين (منظمه التحرير الفلسطينية ، 500 ميكروغرام/مل) إلى وسط كل زلة الغطاء. إغلاق الغطاء ووضع بلطف لوحه في 37 درجه مئوية/5 ٪ CO₂ حاضنه لمده 2 أيام.
  ملاحظه: قد تسرب حجم أكبر من كشوف الغلاف اثناء الحضانة. لا تحتاج قسيمة التغطية إلى تغطيه كامله مع منظمه التحرير الفلسطينية بعد وضع قطره. وخلال الحضانة الليلية ، توزع منظمه التحرير الفلسطينية بالتساوي علي حافه كشوف الغطاء.
قبل يوم واحد من عزل الخلية ، واعداد المتوسطة الثقافة ط (DMEM/F-12 تحتوي علي بوتريمين 100 μM ، سيليريت الصوديوم 30 نانومتر ، L-الجلوتامين 3.9 mM ، جنتاميسين 3.5 ميكروغرام/مل ، ثلاثي يودوثيرونين (T3) 0.5 ng/mL ، وملاحق N3 [البروجسترون 4 μM ، الانسولين 20 ميكروغرام/مل ، ترانسفيرين 20 ملغ/مل]) والبذر المتوسطة (الثقافة المتوسطة I [بدون N3 و T3] التي تحتوي علي 10 ٪ مصل البقر الجنيني [المعرض]) وتخزينها في 4 درجه مئوية. اعداد الحل التريبسين العمل (0.25 ٪) في DMEM/F12 والاحتفاظ بها في 4 درجه مئوية.
ملاحظه: يتم توفير التراكيب المتوسطة في الجدول 1.
في اليوم من خليه عزل, مكان ثقافة متوسطه [اي] وبذر متوسطه في الحاضنة في 37 [ك].
ملاحظه: قبل البدء في عزل المخيخ ، تاكد من ان جميع الاداات وأسطح العمل عقيمه.
أغطيه الغسيل.
1. خذ الطبق 24 من الحاضنة
2. اغسل الغطاء في الطبق الثالث والعشرين بالبئر مع الماء المقطر المزدوج (DDW) في خزانه السلامة الاحيائيه في ظل ظروف معقمه. في كل مره السماح للتغطية ينزلق نقع في DDW لمده 5 دقائق قبل البدء في الطموح.
3. اترك الغطاء ينزلق في خزانه السلامة الاحيائيه لمده 2 ساعة علي الأقل حتى يجف تماما.

2. جمع المخيخ

اعداد 3 10 سم معقمه البلاستيك بيتري الاطباق مليئه الجليد الباردة 1x الفوسفات-مخزنه المالحة (تلفزيوني) ، 3 اطباق بيتري مليئه الجليد الباردة 1x محلول الملح المتوازن هانك (HBSS) ، وتقريبا 5 اطباق بيتري مليئه الجليد الباردة تشريح المتوسطة (1x HBSS تحتوي علي جنتاميسين 10 ميكروغرام/مل). أبقهم علي الجليد
تخدير الماوس الحامل E18 CD1 مع 40 ٪ ايزوفلواني. أداء خلع عنق الرحم علي الماوس. تعقيم البطن مع 70 ٪ محلول الايثانول.
استخدام زوج من مقص لجعل شق الجلد من الاقتران العانة إلى عمليه الخنجري. ثم عقد الجلد مع ملقط وفتح تجويف البطن.
المكوس أبواق الرحم مع ملقط ويغسل لهم 3x في الجليد الباردة 1x تلفزيوني علي الجليد.
ملاحظه: يجب اجراء الخطوات التالية علي الجليد لتقليل معدل الأيض ومنع تلف الانسجه والخلايا.

3. تشريح المخيخ

بعد آخر خطوه الغسيل ، وذلك باستخدام زوج من الملقط غرامه فصل الاجنه من الرحم في 1x HBSS ونقلها إلى وسط تشريح الجليد الباردة. في وسط التشريح ، يقطع الاجنه بالمقص. ضع الانسجه في وسط التشريح النظيف.
ملاحظه: استخدام فراغيه لتشريح المجهرية اختياريه.
عقد الجمجمة مع ملقط غرامه وقطع من خلال الكلسية مع زوج من مقص صغير من الجانب الجانبي من الجمجمة في خط من ماغنوم فورامين إلى صماخ الصوتية الخارجية والحدود السفلي من التجويف المداري.
ملاحظه: أخذ هذه الخطوة الكشف عن تجويف الجمجمة علي مستوي قاعده الجمجمة ويجعل من الأسهل لأزاله الدماغ.
باستخدام زوج من ملقط غرامه ، وأزاله قاعده الجمجمة وقشر الجمجمة بعيدا عن الدماغ.
قم بازاله السحايا بعناية علي المخيخ ، بدءا من السطح الجانبي لعم المخيخ الأوسط والبونس.
قطع كل من الأعمام المخيخ وفصل المخيخ من بقية الدماغ (الشكل 1).
وضع علي الفور المخيخ التي تم جمعها في أنبوب مخروطي 15 مل معقمه مليئه 14 مل من DMEM/F12 علي الجليد.
الطرد المركزي أنبوب في 1,000 x g، 4 درجه مئوية لمده 1 دقيقه ، 3x. في كل مره بلطف أزاله ماده طافي مع ماصه وأعاده تعليق بيليه في الطازجة ، الجليد الباردة dmem/F12.
ملاحظه: لتجنب فقدان العينات ، واستخدام مجلس الوزراء شفط اقل قدر ممكن.

4. تفكك المخيخ

أضافه 2 مل من الحرارة المسبقة (37 درجه مئوية) التريبسين إلى بيليه من الخطوة 3.7 وبلطف ماصه pipet-x لخلط كافيه.
ضع الأنبوب في حمام مياه 37 درجه مئوية لمده 12 دقيقه.
بعد الحضانة ، وجلب الأنبوب إلى مجلس السلامة البيولوجية وأضافه 10 مل من DMEM/F12 لتعطيل التريبسين.
طرد مركزي الخليط في 1,200 x g لمده 5 دقيقه. تجاهل ماده طافي وأعاده تعليق بيليه في dmem الطازجة/F12. كرر 3x.
Prewet نقل البلاستيك المعقمة ماصه pipet-x مع DMEM/F12.
بعد الغسيل والطرد النهائية ، أضافه 3.5 mL من حل العمل DNase (1 مل من DNase I الحل الأسهم [0.05 ٪ DNase + 12 ملم MgSO_{4 +} 1X hbss] في 500 μl من الحرارة-غير مفعله و 2 مل من dmem/F12) إلى بيليه في نفس الأنبوب.
تريلوريتي النسيج مع ماصه pipet-x علي الأقل 30x حتى الخليط يبلغ لون حليبي متجانسة.

5-جمع الخلايا

أضافه 10 مل من الجليد الباردة DMEM/F12 إلى الخليط.
الطرد المركزي العينة في 1,200 x g، 4 درجه مئوية لمده 5 دقائق.
بعناية أزاله ماده طافي دون إزعاج بيليه.
أزاله الوسط البذر من الحاضنة.
أضافه 500 μL من المتوسطة البذر المسبق إلى بيليه ومزجها بشكل جيد للغاية باستخدام ماصه pipet-x لأعاده تعليق الخلايا.
عد الخلايا باستخدام مقياس الكريات الدموية.
تمييع تعليق الخلية مع متوسط البذر إلى كثافة 5 × 10⁵ خلايا/مل.
تحت خزانه السلامة الاحيائيه ، أضافه 90 μL من الخليط المخفف إلى كل بئر في وسط زلة الغطاء.
ملاحظه: لا تقم بتحميل الجسيمات التي لم توقف في DNase.
ضع الصفيحة في الحاضنة عند 37 درجه مئوية لمده 3 − 4 ساعة.
بعد الحضانة ، أضافه 500 μL من المتوسطة الثقافة المسبقة I إلى كل بئر ووضع لوحه مره أخرى في الحاضنة (37 درجه مئوية).

6-علاج الخلايا المستردة

بعد 7 أيام, استبدلت الوسط قديمه مع [كلتثر مديوم] متوسطه [ايي] (ثقافة متوسطه انا يستكمل مع [ستوسيين] [ارمينوسايد] [[را-ك], 4 [م]] و 100 [غم/مل] بقري مصل زلال [بوسني]; انظر الجدول 1).
ملاحظه: هذه الخطوة ضرورية لتجنب نمو الخلايا غير العصبية.
مراقبه الثقافة المتوسطة مره واحده في اليوم. إذا كانت تغييرات الأس الهيدروجيني (المشار اليها من قبل تغيير ملحوظ في اللون ، وعاده المصفر) ، وأزاله نصف (تقريبا 250 μL) من الوسط القديم من جميع الآبار وأضافه 300 μL من المتوسطة الثقافة المسبقة I لكل منهم لتجنب فقدان المواد الغذائية.
ملاحظه: الفينول الأحمر في الوسط الثقافي هو مؤشر جيد لدرجه الحموضة في المتوسط ونشاط الخلايا. في محاولة للتقليل من وقت التعرض للخلايا للخروج من ظروف الحاضنة. وهذا يمنع اي إجهاد قد يؤثر علي صلاحيتها.

7-جمع الخلايا وتثبيتها

ملاحظه: اعتمادا علي التصميم التجريبي ، يمكن جمع الخلايا في اي يوم ، في اي وقت.

اعداد منفصلة 24 لوحه جيدا مع المنظمة الرقمية المقابلة وأضافه 100 μL من 4 ٪ بارافورمالدهيد (PFA) لكل بئر.
لحصاد الخلايا في الأيام المطلوبة (اعتمادا علي البروتوكول التجريبي) ، قم بازاله الغطاء برفق من ابار اللوحة الثقافية الاصليه ووضعها في الآبار المناظرة لصفيحه التعبئة التي تم ملؤها.
أضافه PFA إلى الآبار لتزج تماما زلة الغطاء.
ملاحظه: لتجنب انفصال الخلية من زلة الغطاء ، لا تقم باضافه PFA مباشره علي زلة الغطاء.
الحفاظ علي لوحه PFA في 4 درجه مئوية لمده 30 − 120 دقيقه.
بعد الحضانة ، واستعاده لوحه لدرجه حرارة الغرفة.
يغسل برفق الغطاء ينزلق 3x لمده 5 دقائق مع 1x تلفزيوني.
انتقل إلى عمليه المناعة.
ملاحظه: في هذه الدراسة ، تم استخدام مجهر مضان مجهز بكاميرا للتقاط الصور وتجميعها في المونتاج باستخدام تطبيق برنامج تحرير الصور.

النتائج

استنادا إلى تواريخ ميلاد مختلفه من الأنواع الفرعية العصبية في المخيخ ، والثقافات من الاجنه الماوس E12 − E18 أسفرت عن أنواع مختلفه من الخلايا. برزت الخلايا العصبية الإسقاط الكبيرة ، مثل الخلايا العصبية CN (E9) وأجهزه الكمبيوتر (E13) ، في وقت مبكر خلال التنمية المخيخ. في الفئران والحبيبية وخلايا Golg...

Discussion

استخدام الثقافات الاوليه هو وسيله معروفه تنطبق علي جميع أنواع الخلايا العصبية¹⁷^،¹⁸^،¹⁹. في البروتوكول المعروض ، ونحن شرح كيفيه عزل الخلايا العصبية المخيخ والحفاظ علي صلاحيتها مع البقاء علي قيد الحياة الأمثل في المختبر لمده أقصاها 3 أسابيع. ?...

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgements

وكانت هذه الدراسات مدعومة بمنح من مجلس العلوم الطبيعية والبحوث الهندسية (HM: NSERC ديسكفري غرانت # RGPIN-2018-06040) ، ومعهد بحوث مستشفي الأطفال في مانيتوبا (HM: غرانت # 320035) ، وال ALS كندا-الدماغ كندا أرثر J. هدسون منحه فريق الانتقالية (JK ، HM).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adobe Photoshop CS5 Version 12	Adobe Inc
Anti-Sodium Channel (SCN)PN4 (Nav1.6)	Sigma	S0438	3 μg/mL
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	A3608
CALB1	Swant Swiss Antibodies (Polyclonal)	CB38	1/5000 dilution
CALB1	Swant Swiss Antibodies (Monoclonal)	300	1/1000 dilution
Cytosine β-D-arabinofuranoside or Cytosine Arabinoside (Ara-C)	Millipore Sigma	C1768
DNase I from bovine pancreas	Roche	11284932001
Dressing Forceps	Delasco	DF-45
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM-F12)	Lonza	12-719F
Fisherbrand Cover Glasses: Circles	fisher scientific	12-545-81
Gentamicin	Gibco	15710-064
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14185-052
Insulin from bovine pancreas	Millipore sigma	I5500, I6634, I1882, and I4011
Large Scissor	Stoelting	52134-38
L-glutamine	Gibco	25030-081
Metallized Hemacytometer	Hausser Bright-Line	3100
Microdissection Forceps	Merlan	624734
Pattern 5 Tweezer	Dixon	291-9454
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher BioReagents	BP399-26
Poly-L-Ornithine	Millipore Sigma	P4638
Progesteron (P4)	Millipore sigma	P8783
PVALB	Swant Swiss Antibodies	235	1/1500 dilution
Samll Scissor	WPI Swiss Scissors, 9cm	504519
Sodium Selenite	Millipore Sigma	S9133
Transferrin	Millipore Sigma	T8158
Tri-iodothyronine (T3)	Millipore Sigma	T2877
Trypsin	Gibco	15090-046
Zeiss Fluorescence microscope	Zeiss	Z2 Imager

References

Giffard, R. G., Ouyang, Y. B., Squire, L. R. Cell culture: primary neural cells. Encyclopedia of Neuroscience. , 633-637 (2009).
Huang, Y., Liu, Y., Zheng, C., Shen, C. Investigation of Cross-Contamination and Misidentification of 278 Widely Used Tumor Cell Lines. PLoS One. 12 (1), 0170384 (2017).
Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Fixing problems with cell lines. Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).
Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
Capes-Davis, A., et al. Check your cultures! A list of cross-contaminated or misidentified cell lines. International Journal of Cancer. 127 (1), 1-8 (2010).
Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances. Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).
Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: a breakthrough in vivo. International Journal of Molecular Science. 16 (3), 5517-5527 (2015).
Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
Voloboueva, L., Sun, X., Ouyang, Y. B., Giffard, R. G. Cell culture: primary neural cells. Reference Module in Neuroscience and Biobehavioral Psychology. , (2017).
Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 450 (2014).
Sudarov, A., et al. Ascl1 genetics reveals insights into cerebellum local circuit assembly. Journal of Neuroscience. 31 (30), 11055-11069 (2011).
Rahimi-Balaei, M., et al. Zebrin II Is Ectopically Expressed in Microglia in the Cerebellum of Neurogenin 2 Null Mice. Cerebellum. 18 (1), 56-66 (2019).
Rahimi-Balaei, M., Bergen, H., Kong, J., Marzban, H. Neuronal Migration During Development of the Cerebellum. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 484 (2018).
Buffo, A., Rossi, F. Origin, lineage and function of cerebellar glia. Progress in Neurobiology. 109, 42-63 (2013).
Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. Embryonic Precursor Cells from the Rhombic Lip Are Specified to a Cerebellar Granule Neuron Identity. Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).
Reemst, K., Noctor, S. C., Lucassen, P. J., Hol, E. M. The Indispensable Roles of Microglia and Astrocytes during Brain Development. Frontiers in Human Neuroscience. 10, 566 (2016).
Furuya, S., Makino, A., Hirabayashi, Y. An improved method for culturing cerebellar Purkinje cells with differentiated dendrites under a mixed monolayer setting. Brain research. Brain Research Protocols. 3 (2), 192-198 (1998).
Tabata, T., et al. A reliable method for culture of dissociated mouse cerebellar cells enriched for Purkinje neurons. Journal of Neuroscience Methods. 104 (1), 45-53 (2000).
Marzban, H., Hawkes, R. Fibroblast growth factor promotes the development of deep cerebellar nuclear neurons in dissociated mouse cerebellar cultures. Brain Research. 1141, 25-36 (2007).
Schaller, K. L., Caldwell, J. H. Expression and distribution of voltage-gated sodium channels in the cerebellum. Cerebellum. 2 (1), 2-9 (2003).
Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. Embryonic precursor cells from the rhombic lip are specified to a cerebellar granule neuron identity. Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).
van der Valk, J., Gstraunthaler, G. Fetal Bovine Serum (FBS) - A pain in the dish. Alternatives to Laboratory Animals. 45 (6), 329-332 (2017).
Froud, S. J. The development, benefits and disadvantages of serum-free media. Developments in Biological Standardization. 99, 157-166 (1999).
Kwist, K., Bridges, W. C., Burg, K. J. The effect of cell passage number on osteogenic and adipogenic characteristics of D1 cells. Cytotechnology. 68 (4), 1661-1667 (2016).
Uysal, O., SevimLi, T., SevimLi, M., Gunes, S., Eker Sariboyaci, A., Barh, D., Azevedo, V. Cell and tissue culture: the base of biotechnology. Omics Technologies and Bio-Engineering. , 391-429 (2018).
Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), e3634 (2012).
Nelson, K. B., Bauman, M. L. Thimerosal and autism. Pediatrics. 111 (3), 674-679 (2003).
Marzban, H., Hawkes, R. Fibroblast growth factor promotes the development of deep cerebellar nuclear neurons in dissociated mouse cerebellar cultures. Brain Research. 1141, 25-36 (2007).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

152 Purkinje

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: