Embriyonik Fare Beyincisinden İzole Edilen Nöronların Birincil Kültürü

Özet

In vitro deneylerin vivo koşullarını mümkün olduğunca yeterli şekilde yansıtmak için yapılması kolay bir iş değildir. Birincil hücre kültürlerinin kullanımı bütün bir organizmada hücre biyolojisini anlamaya yönelik önemli bir adımdır. Sağlanan protokol nasıl başarılı bir şekilde büyümek ve kültür embriyonik fare serebellar nöronlar özetliyor.

Özet

Birincil hücre kültürlerinin kullanımı in vitro sinir sistemini incelemek için önemli araçlardan biri haline gelmiştir. Bu basitleştirilmiş model sistemini kullanmanın nihai amacı kontrollü bir mikroçevre sağlamak ve yüksek sağkalım oranını ve ayrıştırılmış nöronal ve nöronal olmayan hücrelerin doğal özelliklerini in vitro koşullarda mümkün olduğunca korumaktır. Bu makalede, gelişmekte olan fare beyincik birincil nöronlar izole bir yöntem göstermek, bir in vitro ortamda yerleştirerek, onların büyüme kurulması, ve birkaç hafta için canlılık ve farklılaşma izleme. Bu yöntem 12-18 yılları arasında serebellumdan ayrıştırılan embriyonik nöronlar için geçerlidir.

Giriş

Birkaç on yıl için, hücre hatları yaygın preklinik çalışmalar ve biyolojik araştırmalarda yüksek iş aracı olarak kullanılmaktadır. Maliyet etkinliği, hızlı büyüme ve canlı hayvan kullanımının azaltılması bu hücreleri kullanarak bazı faydaları vardır. Ancak, genetik değişiklikler ve fenotipik değişiklikler in vitro¹birkaç pasajlar sonra birikir. Hücre hatlarının yanlış tanımlanması ve birincil hücrelerden genetik farklılık geri dönüşü olmayan deneylere ve yanlış^sonuçlarayol açabilir 2^,3,4,5. Bu nedenle, nöronlar gibi farklılaşmış hücrelere bazı benzerlikler rağmen (örneğin, nörotransmitter, iyon kanalları, reseptörler, ve diğer nöron özgü proteinler), nöronal hücre hatları nöronların tam fenotip çoğaltmak olamaz. Olgun nöronlar kullanarak başka bir seçenektir; ancak, bu hücreler kültürde yaymak zor olan bölünemeyen postmitotik hücrelerdir. Ayrıca hücre döngüsüne yeniden giriş apoptoz^6'yaneden olabilir.

Üç boyutlu (3D) hücre kültürü, organotipik dilim kültürleri ve organoid kültürler, hücrelerin in vivo ayarı taklit eden bir 3D forma düzenleyebileceği bir ortam sağlamak için geliştirilmiştir. Böylece hücre-hücre iletişimi, göç, tümör hücrelerinin çevre dokulara invazyonu ve anjiyogenez⁷incelenebilir. Ancak, ekstra hücresel matriks (ECM) proteinleri veya sentetik hidrojelleri yatak olarak kullanmanın ek maliyetleri, görüntülemede zorluk ve yüksek iş yapma lı tarama aletleriyle uyumluluk 3D hücre culturing önemli dezavantajları vardır. Organotipik doku dilimi kültürünün önemli bir dezavantajı hayvanların çok sayıda kullanımı ve aksitomi yan etkileri, hangi hedeflerve aksonlar için büyüme faktörlerinin erişilemezliği yol açar, ve sonuç olarak nöronal ölüm⁸.

Bu nedenle, hücre hatları ile ilgili sorunları önler alternatif bir yaklaşım, olgun hücrelerin büyüyen zorluk, ve dokuların karmaşıklığı, olgunlaşmamış primer hücrelerin in vitro olgunlaşma olduğunu. Birincil hücreler doğrudan insan veya hayvan dokusundan türetilir ve enzimatik ve/veya mekanik yöntemlerle ayrıştırılır^9. Kültür ortamında izolasyon, tohumlama ve bakım temel ilkeleri doku kaynağı ne olursa olsun benzerdir. Ancak, proliferasyon ve olgunlaşmayı teşvik etmek için gerekli trofik faktörler yüksek hücre spesifik^6.

Her serebellar hücre tipinin 'doğum tarihini' bilmek bir birincil kültür deneyi tasarlamak için bir ön koşuldur. Genel olarak, Purkinje hücreleri (PCs) ve serebellar çekirdeklerin nöronlar (CN), internöronlar da dahil olmak üzere küçük hücreler, önce doğarlar (örneğin, sepet, stellat hücreleri) ve granül hücreler. Farelerde, bilgisayarlar embriyonik gün (E)10-E13 arasında ortaya çıkarken, CN nöronlar yaklaşık E9-E12^10.

Diğer serebellar nöronlar çok daha sonra doğarlar. Örneğin, farelerde, internöronların Golgi alt popülasyonu VZ'den (~E14−E18) üretilir ve moleküler tabakada bulunan kalan internöronlar (sepet hücresi ve yıldız hücreleri) beyaz maddedeki progenitor hücrelerinin erken ile beyaz maddeye bölünmesinden ortaya çıkar. doğum sonrası (P)0–P7¹¹. Granül hücreler dış germinal zon (EGZ), rostral rhombic dudak türetilen ve doğumdan sonra terminal bölümü geçer ikincil bir germinal zon üretilir. Ancak öncülleri E13-E16'dan gelen eşkenar dörtgen dudaktan doğmadan önce, hücreler serebel ange'nin dorsal yüzeyinde ince bir hücre tabakası yapmak için pia yüzeyi boyunca rostrally göç etmişler. Ventriküler nöroepitelkökenli astrositler ve oligodendrositler gibi nöronal olmayan makroglial hücreler sırasıyla E13.5−P0 ve P0−P7'de doğarlar^{11,12,13,14 ,15}. Mikroglia e8-E10 arasında yolk-kese ilkel miyeloid atahücreleri türetilmiştir ve merkezi sinir sistemine invazu sonrası E9¹⁶ile fare beyninde tespit edilebilir .

Bu makalede sunulan yöntem aslında Furuya ve ark. ve Tabata ve ark.^17,18tarafından geliştirilen bir dayanmaktadır , Wistar sıçan cerebella türetilen Purkinje hücrelerinin birincil culturing için optimize edildi. Şimdi bu yöntemi adapte ve dikkatle fare serebellar nöronların büyümesini incelemek için modifiye¹⁹. Yeni protokolümüzden farklı olarak, soğuk diseksiyon ortamı Furuya protokolü^17'yetohumlama ortamı eklemeden önce diseksiyon ve dissosilasyon basamaklarında kullanılan ana yıkama tamponudur. Bu tampon beslenme yoksun, büyüme faktörleri, ve hormonlar (Dulbecco değiştirilmiş Eagle orta tüm: besin karışımı F-12 [DMEM/F12]) bu yukarıda belirtilen adımlar sırasında hücre büyümesini ve sağkalım desteklemek için gerekli olan. Buna ek olarak, murine primer serebellar kültürleri ile ilgili geniş deneyimimize dayanarak, her kuyuda (1 mL yerine) 500 μL kültür ortamı kullandık ve nöronal hücrelerin büyümesini iyileştiren tri-iyototironin konsantrasyonunu 0,5 ng/mL'ye çıkardık. özellikle purkinje hücre fenotip olanlar, ve kültürde dendritik dalların büyümesini teşvik. Bu makalede yer alan temel yöntem, embriyonik gelişim sırasında diğer küçük kemirgenlere (örneğin, sincaplar ve hamsterlar) yaygın olarak uygulanabilir ve çeşitli embriyonik evrelerde serebellar nörogenezve farklılaşmayı incelemek için kullanılabilir, türler arasında farklılık gösterir.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri kurumsal düzenlemelere ve Kanada Hayvan Bakımı Konseyi'nden Deneysel Hayvanların Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak gerçekleştirildi ve yerel makamlar tarafından onaylandı ("Bannatyne Kampüsü Hayvan Bakımı Komite"). Kullanılan hayvanların sayısını ve acılarını en aza indirmek için tüm çabalar sarf edildi. Yeterli anestezi derinliği manipülasyon ve ayak ucutu veya kornea refleksi ile ilişkili solunum hızında bir değişiklik olmadığı gözlemlenerek doğrulandı.

1. Hazırlık

NOT: Gebe kalma sonrası E12-E18 için zamanlanmış hamile farelerin, araştırma planına dayalı olarak sağlanmasını planlayın. Zamanlamaseçimi istenilen hücre özelliklerine bağlıdır (aşağıya bakın). Deneyden en az 2 gün önce kapak fişlerini ve plakaları hazırlayın. Poli-L-ornitin, kapak fişlerine hücre bağlılığını artırmak için kaplama malzemesi olarak kullanılır.

1. Kapak hücre izolasyonundan 2 gün önce kayar.
   1. Yuvarlak kapak fişlerini 24 kuyuluk plakaya, steril koşullar altında bir biyogüvenlik kabinine yerleştirin. Herhangi bir kontaminasyonu önlemek için her kapak fişi arasında bir boşluk bırakın.
   2. Her kapak fişinin ortasına 90 μL poli-L-ornit (FKÖ, 500 g/mL) ekleyin. Kapağı kapatın ve plakayı 2 gün boyunca %37 °C/5% CO₂ kuluçka makinesine nazikçe yerleştirin.
      NOT: Kuluçka sırasında kapak fişleri daha büyük bir hacim dökülebilir. Kapak fişi bir damla yerleştirdikten sonra tamamen FKÖ ile kaplı olması gerekmez. Gece kuluçka sırasında, FKÖ kapak fişleri kenarına eşit dağıtır.
2. Hücre izolasyonundan bir gün önce, kültür ortamı I (DMEM/F-12 içeren putrescine 100 μM, sodyum selenit 30 nM, L-glutamin 3.9 mM, gentamisin 3.5 μg/mL, tri-iyototirin (T3) 0.5 ng/mL ve N3 takviyeleri [progesteron 4 μM, insülin 20/m, mL, mL transferrin 20 mg/mL]) ve tohumlama ortamı (kültür ortamı I [N3 ve T3 olmadan] %10 fetal sığır serumu [FBS]) içeren ve 4 °C'de saklayın. Tripsin çalışma çözeltisini hazırlama (%0.25) DMEM/F12'de 4 °C'de tutun.
   NOT: Orta kompozisyonlar Tablo 1'deverilmiştir.
3. Hücre izolasyonu gününde kültür ortamı I ve tohumlama ortamını 37 °C'de kuvöze yerleştirin.
   NOT: Beyincik izolasyonuna başlamadan önce, tüm aletlerin ve çalışma yüzeylerinin steril olduğundan emin olun.
4. Kapak fişlerini yıkayın.
   1. 24 kuyu plakasını kuvözden çıkar.
   2. Kapak fişlerini 24 kuyu plakası 3x'te, steril koşullarda biyogüvenlik kabininde çift distile su (DDW) ile yıkayın. Her zaman kapak fişleri aspirasyon başlamadan önce 5 dakika DDW emmek sağlar.
   3. Kapak fişlerini en az 2 saat tamamen kuruması için bir biyogüvenlik kabininde bırakın.

2. Beyincik toplama

1. Buz gibi 1x fosfat tamponlu salin (PBS), buz gibi 1x Hank'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) ile doldurulmuş 3 Petri kabı ve buz gibi diseksiyon ortamıyla dolu yaklaşık 5 Petri kabı (1x HBSS) ile doldurulmuş üç adet 10 cm steril plastik Petri kabı hazırlayın gentamisin 10 μg/mL) içeren. Onları buzda tut.
2. % 40 izoflurane ile E18 CD1 hamile fare anestezi. Fare üzerinde servikal çıkığı gerçekleştirin. % 70 etanol çözeltisi ile karın sterilize.
3. Kifo sürecine kasık symphysis bir deri kesi yapmak için makas bir çift kullanın. Sonra forceps ile cilt tutun ve karın boşluğu açın.
4. Terin boynuzlarını büşrelerle boşaltın ve buz üzerinde buz gibi 1x PBS'de 3 x yıkayın.
   NOT: Metabolik hızı en aza indirmek ve doku ve hücre hasarını önlemek için aşağıdaki adımlar buz üzerinde yapılmalıdır.

3. Beyincik diseksiyon

1. Son yıkama adımından sonra, bir çift ince keçe kullanarak embriyoları 1x HBSS'de rahimden ayırın ve buz gibi diseksiyon ortamına aktarın. Diseksiyon ortamda, makas ile embriyoların kafasını kes. Dokuyu temiz bir diseksiyon ortamına yerleştirin.
   NOT: Mikrodiseksiyon için stereomikroskop kullanmak isteğe bağlıdır.
2. Ince forseps ile kafatası tutun ve foramen magnum dış akustik meatus ve orbital boşluğun alt sınır bir çizgi kafatasının lateral yönü küçük makas bir çift ile calvarium ile kesti.
   NOT: Bu adımı atmak kafatası tabanı seviyesindeki kafatası boşluğunu ortaya çıkarır ve beynin çıkarılmasını kolaylaştırır.
3. İnce bir çift forceps kullanarak, kafatası tabanını çıkarın ve beyinden kafatası soyma.
4. Dikkatle beyincik üzerinde menenjler kaldırmak, orta serebellar peduncle ve pons lateral yüzeyinden başlayarak.
5. Hem serebellar peduncles kesin ve beynin geri kalanından beyincik ayırın (Şekil 1).
6. Toplanan seremoniyi hemen 14 mL DMEM/F12 ile dolu steril 15 mL konik bir tüpe buz üzerine yerleştirin.
7. Tüpü 1 dk, 3x için 4 °C'de 1000 x g,4 °C'de santrifüj edin. Her seferinde supernatant'ı bir pipetle hafifçe çıkarın ve taze, buz gibi DMEM/F12'de peleti yeniden askıya alın.
   NOT: Numuneleri kaybetmemek için dolap emişini mümkün olduğunca az kullanın.

4. Beyincik dissociasyonu

1. 3.7 adımdan pelete önceden ısıtılmış (37 °C) tripsin 2 mL ekleyin ve yeterli karıştırma için hafifçe pipet.
2. Tüpü 37 °C'lik bir su banyosuna 12 dakika yerleştirin.
3. Kuluçkadan sonra tüpü biyogüvenlik kabinine getirin ve trypsininin inaktive edilmesi için 10 mL DMEM/F12 ekleyin.
4. Karışımı 1.200 x g'de 5 dk. Süpernatant'ı atın ve taze DMEM/F12'de peleti yeniden askıya alın. 3x'i tekrarlayın.
5. DMEM/F12 ile steril plastik transfer pipetönceden tonuyla.
6. Yıkama ve son santrifüjden sonra, aynı tüpteki pelete 3,5 mL DNase çalışma çözeltisi (1 mL DNase I stok çözeltisi [%0,05 DNase + 12 mM MgSO₄ + 1x HBSS] 500 μL ısı yalıtımlı FBS ve 2 mL DMEM/F12 ekleyin.
7. Karışım homojen sütlü bir renge erişene kadar dokuyu en az 30 x pipetle triturate edin.

5. Hücre toplama

1. Karışıma 10 mL buz gibi DMEM/F12 ekleyin.
2. Numuneyi 1.200 x g, 4 °C'de 5 dk.'da santrifüj edin.
3. Peleti bozmadan supernatant'ı dikkatlice çıkarın.
4. Tohumlama ortamını kuluçka makinesinden çıkarın.
5. Pelete 500 μL önceden ısıtılmış tohumlama ortamı ekleyin ve hücreleri yeniden askıya almak için bir pipet kullanarak çok iyi karıştırın.
6. Hemositometre kullanarak hücreleri say.
7. 5 x 10⁵ hücre/mL bir yoğunlukta tohumlama orta ile hücre süspansiyon seyreltin.
8. Bir biyogüvenlik kabini altında, kapak fişinin merkezindeki her kuyuya seyreltilmiş karışımın 90°L'sini ekleyin.
   NOT: DNase'de askıda olmayan parçacıkları yüklemeyin.
9. Plakayı 37 °C'de 3−4 saat boyunca kuvöze yerleştirin.
10. Kuluçkadan sonra, her kuyuya 500 μL önceden ısınmış kültür ortamı I ekleyin ve plakayı kuvöze (37 °C) geri yerleştirin.

6. Kurtarılan hücrelerin tedavisi

1. 7 gün sonra, eski ortayı taze kültür ortamı II ile değiştirin (sitozin arabinoside [Ara-C, 4 μM] ve 100 μg/mL sığır serum albumini [BSA]; bakınız Tablo 1).
   NOT: Bu adım nöronal olmayan hücrelerin büyümesini önlemek için önemlidir.
2. Kültür ortamını günde bir kez izleyin. EĞER pH değişiklikleri (belirgin bir renk değişikliği ile gösterilir, genellikle daha sarı), tüm kuyulardan eski ortamın yarısını (neredeyse 250 μL) çıkarın ve besin kaybını önlemek için her birine önceden ısınmış kültür orta I 300 μL ekleyin.
   NOT: Kültür ortamındaki fenol kırmızısı, hücrelerin ortamının pH'ının ve aktivitesinin iyi bir göstergesidir. İnkübatör koşulları dışında hücrelerin maruz kalma süresini en aza indirmeye çalışın. Bu onların canlılığını etkileyebilecek herhangi bir stres önler.

7. Hücre toplama ve fiksasyon

NOT: Deneysel tasarıma bağlı olarak, hücreler herhangi bir gün, herhangi bir zaman noktasında toplanabilir.

1. İlgili sayısal organizasyonile ayrı bir 24 kuyu plakası hazırlayın ve her kuyuya %4 paraformaldehit (PFA) 100°L ekleyin.
2. Hücreleri istenilen günlerde hasat etmek için (deneysel protokole bağlı olarak), kapak fişlerini orijinal kültür plakasının kuyularından hafifçe çıkarın ve PFA dolu plakanın ilgili kuyularına yerleştirin.
3. Kapak fişlerini tamamen batırmak için kuyulara PFA ekleyin.
   NOT: Hücrenin kapak fişinden ayrılmasını önlemek için, PfA'yı doğrudan kapak fişine eklemeyin.
4. PFA plakasını 30−120 dk boyunca 4 °C'de tutun.
5. Kuluçkadan sonra, oda sıcaklığına plaka geri.
6. Kapağı 1x PBS ile 5 dk boyunca 3x yavaşça yıkayın.
7. İmmünoboyama işlemine devam edin.
   NOT: Bu çalışmada, görüntüleri yakalamak için kamera ile donatılmış bir floresan mikroskobu kullanılmış ve bir görüntü düzenleme yazılımı uygulaması kullanılarak montajlar halinde monte edilmiştir.

Sonuçlar

Beyincikteki nöronal alt tiplerin farklı doğum tarihlerine göre, E12−E18 fare embriyolarının kültürleri farklı hücre tipleri ortaya çıkarmıştır. CN nöronlar (E9−E12) ve PCs (E10−E13) gibi büyük projeksiyon nöronlar serebeller gelişim sırasında erken ortaya çıkmıştır. Farelerde granül ve Golgi hücreleri ~E13-E18 arasında ortaya çıktı ve doğum sonrası 4.

Eski orta I'yi taze kültür ortamı II ile değiştirmek, in vitro (DIV) 7 günlerinde glial hücre ?...

Tartışmalar

Birincil kültürlerin kullanımı nöronların her türlü için geçerli iyi bilinen bir yöntemdir^17,18,19. Sunulan protokolde, serebellar nöronların nasıl izole edilebildiğini ve en fazla 3 hafta boyunca optimum in vitro sağkalımla canlılıklarını nasıl koruyacağımızı açıklıyoruz. E15−E18'de izole edilen serebellar hücrelerinin birincil kültürü, büyük nöronların üç sınıfının toplanmasını do...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adobe Photoshop CS5 Version 12	Adobe Inc
Anti-Sodium Channel (SCN)PN4 (Nav1.6)	Sigma	S0438	3 μg/mL
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	A3608
CALB1	Swant Swiss Antibodies (Polyclonal)	CB38	1/5000 dilution
CALB1	Swant Swiss Antibodies (Monoclonal)	300	1/1000 dilution
Cytosine β-D-arabinofuranoside or Cytosine Arabinoside (Ara-C)	Millipore Sigma	C1768
DNase I from bovine pancreas	Roche	11284932001
Dressing Forceps	Delasco	DF-45
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM-F12)	Lonza	12-719F
Fisherbrand Cover Glasses: Circles	fisher scientific	12-545-81
Gentamicin	Gibco	15710-064
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14185-052
Insulin from bovine pancreas	Millipore sigma	I5500, I6634, I1882, and I4011
Large Scissor	Stoelting	52134-38
L-glutamine	Gibco	25030-081
Metallized Hemacytometer	Hausser Bright-Line	3100
Microdissection Forceps	Merlan	624734
Pattern 5 Tweezer	Dixon	291-9454
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher BioReagents	BP399-26
Poly-L-Ornithine	Millipore Sigma	P4638
Progesteron (P4)	Millipore sigma	P8783
PVALB	Swant Swiss Antibodies	235	1/1500 dilution
Samll Scissor	WPI Swiss Scissors, 9cm	504519
Sodium Selenite	Millipore Sigma	S9133
Transferrin	Millipore Sigma	T8158
Tri-iodothyronine (T3)	Millipore Sigma	T2877
Trypsin	Gibco	15090-046
Zeiss Fluorescence microscope	Zeiss	Z2 Imager