Первичная культура нейронов, изолированных от эмбриональной мыши Cerebellum

Резюме

Проведение экспериментов в пробирке, чтобы отразить в условиях vivo как можно более адекватно, не является легкой задачей. Использование первичных клеточных культур является важным шагом на пути к пониманию клеточной биологии в целом организме. В предоставленном протоколе описывается, как успешно расти и культуры эмбриональных нейронов мозжечка мыши.

Аннотация

Использование первичных клеточных культур стало одним из основных инструментов для изучения нервной системы in vitro. Конечная цель использования этой упрощенной модели системы заключается в обеспечении контролируемой микросреды и поддерживать высокий уровень выживаемости и природные особенности разрозненных нейрональных и ненейрональных клеток как можно больше в условиях in vitro. В этой статье мы демонстрируем метод изоляции первичных нейронов от развивающегося мозжечка мыши, помещая их в среду in vitro, устанавливая их рост, и контролируя их жизнеспособность и дифференциацию в течение нескольких недель. Этот метод применим к эмбриональным нейронам, диссоциированным от мозжечка между эмбриональными днями 12–18.

Введение

В течение нескольких десятилетий клеточные линии широко использовались в качестве инструмента высокой пропускной связи в доклинических исследованиях и биологических исследованиях. Рентабельность, быстрый рост и сокращение использования живых животных являются некоторыми преимуществами использования этих клеток. Однако генетические изменения и фенотипические изменения накапливаются после нескольких проходов in vitro^1. Неверная идентификация клеточных линий и генетическая несходность первичных клеток может привести к невоспроизводимым экспериментам и ложным выводам^2,3,4,5. Поэтому, несмотря на некоторое сходство с дифференцированными клетками, такими как нейроны (например, нейротрансмиттеры, ионные каналы, рецепторы и другие нейронно-специфические белки), нейронные клеточные линии не могут воспроизвести полный фенотип нейронов. Использование зрелых нейронов является еще одним вариантом; однако, эти клетки не разделяют постмитотические клетки, которые трудно размножаться в культуре. Кроме того, возвращение в клеточный цикл может привести к апоптозу⁶.

Трехмерная (3D) клеточная культура, органотипические срезные культуры и органоидные культуры были разработаны, чтобы обеспечить среду, в которой клетки могут организовать сявру в 3D-форму, имитирующую настройку in vivo. Таким образом, клеточной связи, миграции, вторжения опухолевых клеток в окружающие ткани, и ангиогенез можно изучить⁷. Однако дополнительные затраты на использование дополнительных клеточных матричных (ECM) белков или синтетических гидрогелей в качестве постельных принадлежностей, трудности в визуализации и совместимость с высокопроизводительными скрининговыми инструментами являются значительными недостатками культивирования 3D-клеток. Основным недостатком культуры органотипических срезов тканей является использование большого количества животных и неблагоприятные последствия акотомии, что приводит к недоступности целей и факторов роста для аксонов, и, следовательно, нейрональной смерти⁸.

Таким образом, альтернативный подход, который позволяет избежать проблем с клеточными линиями, трудности выращивания зрелых клеток, и сложность тканей, является в пробирке созревания незрелых первичных клеток. Первичные клетки получены непосредственно из тканей человека или животного и разобщены с помощью ферментативных и/или механических методов^9. Основные принципы изоляции, посева и поддержания в культурной среде схожи независимо от источника ткани. Тем не менее, трофические факторы, необходимые для содействия распространению и созреванию являются весьма клеточными⁶.

Знание «даты рождения» каждого типа мозжечковой клетки является необходимым условием для разработки первичного эксперимента культуры. В целом, клетки Пуркинье (ПК) и нейроны мочеиссолочных ядер (CN) рождаются перед более мелкими клетками, включая интернейроны (например, корзины, стеллатные клетки) и гранулированные клетки. У мышей, ПК возникают между эмбриональным днем (E)10-E13, в то время как CN нейронов примерно E9-E12¹⁰.

Другие мозжечковые нейроны рождаются гораздо позже. Например, у мышей субпопуляция межнейронов Голги генерируется из ВЗ на уровне (E14-E18), а остальные интернейроны (клетки корзины и стеллатные клетки), расположенные в молекулярном слое, возникают из деления клеток-прародителей в белом веществе между ранними послеродовой (P)0-P7¹¹. Клетки гранул генерируются из внешней зародышевой зоны (ЭГЗ), вторичной зародышевой зоны, которая происходит от ростральной ромбических губ и проходит через терминальное деление после рождения. Но прежде чем их предшественники возникают из ромбических губ от E13-E16, клетки уже мигрировали ростально вдоль поверхности пиа, чтобы сделать тонкий слой клеток на поверхности вращателя алаг. Ненейрональные макроглиальные клетки, такие как астроциты и олигодендроциты, которые происходят из желудочкового нейроэпителия, рождаются в E13.5-P0 и P0-P7 соответственно^{11,12,13,14 ,15}. Микроглия являются производными от желтка-мешок примитивных миелоидных клеток-прародителей между E8-E10 и после вторжения в центральную нервную систему могут быть обнаружены в мозге мыши E9¹⁶.

Метод, представленный в этой статье, основан на методе, первоначально разработанном Furuya et al. и Tabata et al.^17,18,который был оптимизирован для первичного культивирования клеток Пуркинье, полученных из крысиной церебеллы Wistar. Теперь мы адаптировали этот метод и тщательно модифицировали его для изучения роста мозжечковых нейронов мыши¹⁹. В отличие от нашего нового протокола, холодная среда вскрытия является основным буфером стирки, используемым во время рассечения и диссоциации, прежде чем добавить среду посева в протокол Furuya¹⁷. Этот буфер не хватает питания, факторов роста и гормонов (все в Dulbecco в модифицированных Eagle среды: питательная смесь F-12 "DMEM / F12"), которые необходимы для поддержки роста клеток и выживания во время вышеупомянутых шагов. Кроме того, основываясь на нашем обширном опыте работы с мурин первичных мозжечковых культур, мы использовали 500 л культуры среды в каждом колодце (вместо 1 мл) и увеличили концентрацию трийотиронина до 0,5 нг/мл, что улучшает рост нейрональных клеток, в частности те с фенотипом клетки Purkinje, и повышают outgrowth dendritic ветвей в культуре. Основной метод, описанный в этой статье, может быть широко применен к другим мелким грызунам (например, белкам и хомятам) во время эмбрионального развития и может быть использован для изучения мозжечкового нейрогенеза и дифференциации на различных эмбриональных стадиях, которые различаются между видами.

протокол

Все процедуры для животных были выполнены в соответствии с институциональными правилами и Руководством по уходу и использованию экспериментальных животных от Канадского совета по уходу за животными и были одобрены местными властями ("Bannatyne Campus Animal Care комитет"). Были предприняты все усилия, чтобы свести к минимуму количество и страдания животных, используемых. Адекватная глубина анестезии была подтверждена, заметив, что не было никаких изменений в частоте дыхания, связанных с манипуляцией и щепоткой ног или роговицы рефлекс.

1. Подготовка

ПРИМЕЧАНИЕ: Расписание предоставления приурочен беременных мышей, на основе плана исследований, для пост-зачатия E12-E18. Выбор времени зависит от желаемых характеристик ячейки (см. ниже). Подготовьте крышку скользит и пластин по крайней мере за 2 дня до эксперимента. Поли-L-орнитин используется в качестве материала покрытия для повышения клеточной привязанности к крышке скользит.

1. Пальто крышка скользит за 2 дня до изоляции клеток.
   1. Поместите круглую крышку скользит в 24 хорошо пластины, в стерильных условиях в биобезопасности шкаф. Оставьте зазор между каждой крышкой скольжения, чтобы избежать любого загрязнения.
   2. Добавьте 90 зл поли-L-орнитина (PLO, 500 мкг/мл) к центру каждого покрытия скольжения. Закройте крышку и аккуратно поместите тарелку в_{инкубатор} CO 2 в 37 градусов по Цельсию на 2 дня.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Больший объем может выплеснуться крышкой скользит во время инкубации. Крышка скольжения не должны быть полностью покрыты ООП после размещения капли. Во время ночной инкубации ООП распределяет поровну к краю крышки скользит.
2. За день до изоляции клеток, подготовить культурную среду I (DMEM/F-12, содержащую гитресцин 100 мкм, селенит натрия 30 нм, L-глютамин 3,9 мМ, гентамицин 3,5 мкг/мл, три-йодотиронин (T3) 0,5 нг/мл, и N3 добавки трансферрин 20 мг/мл) и среда посева (культура среднего I (без N3 и T3), содержащая 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) и храните их в 4 градусах Цельсия. Подготовьте рабочее решение трипсина (0.25%) в DMEM/F12 и держать его на 4 градуса цельсия.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Средние композиции приведены в таблице 1.
3. В день изоляции клеток поместите среднюю среду I культуры и среду посева в инкубатор при 37 градусах Цельсия.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом изоляции мозжечка, убедитесь, что все инструменты и рабочие поверхности стерильны.
4. Вымойте крышку скользит.
   1. Выннесли из инкубатора 24 пластины.
   2. Вымойте крышку скользит в 24 хорошо пластины 3x с двойной дистиллированной воды (DDW) в биобезопасности шкаф в стерильных условиях. Каждый раз, когда крышка скользит замочить в DDW в течение 5 минут до начала аспирации.
   3. Оставьте крышку скользит в шкафу биобезопасности, по крайней мере 2 ч, чтобы полностью высохнуть.

2. Коллекция Церебеллум

1. Приготовьте три 10-сантиметровые пластиковые блюда Петри, наполненные ледяной 1x фосфат-буферным сольником (PBS), 3 блюда миочными блюдами Петри, наполненными сбалансированным сольником 1x Hank (HBSS), и примерно 5 чашками Петри, наполненными ледяной рассеиванием среднего (1x HBSS) содержит гентамицин 10 мкг/мл). Держите их на льду.
2. Анестезия E18 CD1 беременной мыши с 40% изофруран. Выполните вывих шейки матки на мышке. Стерилизовать брюшной полости с помощью 70% раствора этанола.
3. Используйте ножницы, чтобы сделать разрез кожи от лобковой симфиза к процессу xiphoid. Затем удерживайте кожу гватом и открывайте брюшную полость.
4. Акциз рога матки с щипками и мыть их 3x в ледяной 1x PBS на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги должны быть проведены на льду, чтобы свести к минимуму скорость обмена веществ и предотвратить повреждение тканей и клеток.

3. Рассечение мозжечка

1. После последнего шага стирки, используя пару тонких щипцы отделить эмбрионы от матки в 1x HBSS и передать их в ледяной рассечения среды. В среде вскрытия обезглавить эмбрионы ножницами. Поместите ткань в чистую среду вскрытия.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использование стереомикроскопа для микрорассеянета не является обязательным.
2. Держите череп мелкими щипками и прорежьте кальварию ножницами от бокового аспекта черепа в линии от фораменов магнума до внешнего акустического мяса и нижней границы орбитальной полости.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Принимая этот шаг подвергает полости черепа на уровне основания черепа и делает его легче удалить мозг.
3. Используя пару тонких щипц, удалите основание черепа и отслаите череп от мозга.
4. Аккуратно удалите одра на мозжечке, начиная с боковой поверхности среднего мозжечка и понс.
5. Вырезать оба мозжечковых peduncles и отделить мозжечок от остальной части мозга (Рисунок 1).
6. Немедленно поместите собранную церебеллу в стерильную коническую трубку 15 мл, наполненную 14 мл DMEM/F12, на льду.
7. Центрифуга трубки на 1000 х г,4 КК в течение 1 мин, 3x. Каждый раз аккуратно снимите супернатант пипеткой и отрежьте гранулы в свежем, ледяном DMEM/F12.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать потери образцов, используйте всасывание шкафа как можно меньше.

4. Диссоциация Церебеллума

1. Добавьте 2 мл претепловой (37 градусов по Цельсию) трипсина к грануле со ступени 3,7 и аккуратно пайпетдляйте для адекватного смешивания.
2. Поместите трубку в водяную ванну 37 градусов по Цельсию в течение 12 минут.
3. После инкубации, довести трубку в шкаф биобезопасности и добавить 10 мл DMEM / F12 инактивировать трипсин.
4. Центрифуга смесь на 1200 х г в течение 5 мин. Отбросьте супернатант и resuspend гранулы в свежем DMEM/F12. Повторите 3x.
5. Prewet стерильный пластиковый трубопровод трубка с DMEM/F12.
6. После стирки и окончательной центрифугации, добавить 3,5 мл рабочего раствора DNase (1 мл dNase I штокового раствора (0,05% DNase 12 мМ MgSO₄ - 1x HBSS) в 500 л тепло-инактивированного FBS и 2 мл DMEM/F12) к пеллете в той же трубке.
7. Triturate ткани с пипеткой по крайней мере 30x, пока смесь не достигнет однородного молочного цвета.

5. Коллекция клеток

1. Добавьте в смесь 10 мл холодного DMEM/F12.
2. Центрифуги образца на 1200 х г,4 КК в течение 5 мин.
3. Тщательно удалите супернатант, не нарушая гранулы.
4. Удалите посевную среду из инкубатора.
5. Добавьте 500 л предощенной среды посева к грануле и очень хорошо перемешайте его с помощью трубки для повторной приостановки работы клеток.
6. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
7. Разбавить клеточной суспензией со средой посева до плотности 5 х 10⁵ клеток/мл.
8. Под шкафом биобезопасности добавьте 90 кЛ разбавленной смеси к каждой скважине в центре скольжения крышки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не загружайте частицы, которые не приостанавливались в DNase.
9. Поместите тарелку в инкубатор при 37 градусах по Цельсию в течение 3х4 ч.
10. После инкубации добавьте 500 qL предтеплой культуры среды I к каждому колодцу и поместите пластину обратно в инкубатор (37 градусов по Цельсию).

6. Лечение восстановленных клеток

1. После 7 дней, заменить старую среду со свежей культуры среды II (культура среды я дополнил цитозин арабинозид "Ара-С, 4 ММ" и 100 мкг /мл бычьей сыворотки альбумина "BSA"; см. Таблица 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет решающее значение, чтобы избежать роста ненейрональных клеток.
2. Мониторинг культуры среды один раз в день. Если рН изменяется (о чем свидетельствует заметное изменение цвета, как правило, желтее), удалите половину (почти 250 л) старой среды со всех скважин и добавьте 300 кЛ предтеплой культуры среды I к каждому из них, чтобы избежать потери питательных веществ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Фенол красный в среде культуры является хорошим показателем рН среды и активности клеток. Постарайтесь свести к минимуму время воздействия клеток на выход из условий инкубатора. Это предотвращает любой стресс, который может повлиять на их жизнеспособность.

7. Сбор и фиксация клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от экспериментального дизайна, клетки могут быть собраны в любой день, в любой момент времени.

1. Подготовьте отдельную 24 пластины с соответствующей численной организацией и добавьте 100 qL 4% параформальдегида (PFA) к каждой скважине.
2. Чтобы собрать клетки в нужные дни (в зависимости от экспериментального протокола), аккуратно снимите крышку ссожеков из колодцев оригинальной культурной плиты и поместите их в соответствующие колодцы заполненной ПФА пластины.
3. Добавьте PFA в колодцы, чтобы полностью погрузить крышку скользит.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать отрыва от камеры от крышки скольжения, не добавляйте PFA непосредственно на крышку скольжения.
4. Держите пластину PFA при 4 градусах по Цельсию в течение 30-120 мин.
5. После инкубации восстановите пластину до комнатной температуры.
6. Аккуратно промыть крышку скользит 3x в течение 5 мин с 1x PBS.
7. Приступайте к процессу иммуностабилизации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании, флуоресцентный микроскоп, оснащенный камерой, был использован для захвата изображений и собран в монтажс с помощью программного приложения для редактирования изображений.

Результаты

Основываясь на различных датах рождения нейрональных подтипов в мозжечке, культуры из эмбрионов мыши E12-E18 давали различные типы клеток. Большие проекционные нейроны, такие как нейроны CN (E9-E12) и ПК (E10-E13), появились на ранней стадии развития мозжедки. У мышей, гранулы и клетки Голги возник?...

Обсуждение

Использование первичных культур является хорошо известным методом, применимым для всех типов нейронов^17,18,19. В представленном протоколе мы объясняем, как изолировать мозжечковые нейроны и поддерживать их жизнеспособность с оптимальн?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adobe Photoshop CS5 Version 12	Adobe Inc
Anti-Sodium Channel (SCN)PN4 (Nav1.6)	Sigma	S0438	3 μg/mL
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	A3608
CALB1	Swant Swiss Antibodies (Polyclonal)	CB38	1/5000 dilution
CALB1	Swant Swiss Antibodies (Monoclonal)	300	1/1000 dilution
Cytosine β-D-arabinofuranoside or Cytosine Arabinoside (Ara-C)	Millipore Sigma	C1768
DNase I from bovine pancreas	Roche	11284932001
Dressing Forceps	Delasco	DF-45
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM-F12)	Lonza	12-719F
Fisherbrand Cover Glasses: Circles	fisher scientific	12-545-81
Gentamicin	Gibco	15710-064
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14185-052
Insulin from bovine pancreas	Millipore sigma	I5500, I6634, I1882, and I4011
Large Scissor	Stoelting	52134-38
L-glutamine	Gibco	25030-081
Metallized Hemacytometer	Hausser Bright-Line	3100
Microdissection Forceps	Merlan	624734
Pattern 5 Tweezer	Dixon	291-9454
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher BioReagents	BP399-26
Poly-L-Ornithine	Millipore Sigma	P4638
Progesteron (P4)	Millipore sigma	P8783
PVALB	Swant Swiss Antibodies	235	1/1500 dilution
Samll Scissor	WPI Swiss Scissors, 9cm	504519
Sodium Selenite	Millipore Sigma	S9133
Transferrin	Millipore Sigma	T8158
Tri-iodothyronine (T3)	Millipore Sigma	T2877
Trypsin	Gibco	15090-046
Zeiss Fluorescence microscope	Zeiss	Z2 Imager