Cultivo primario de neuronas aisladas del cerebelo del ratón embrionario

Resumen

Realizar experimentos in vitro para reflejar las condiciones in vivo lo más adecuadamente posible no es una tarea fácil. El uso de cultivos celulares primarios es un paso importante hacia la comprensión de la biología celular en todo un organismo. El protocolo proporcionado describe cómo crecer y cultivar con éxito las neuronas cerebelosas de ratón embrionarios.

Resumen

El uso de cultivos celulares primarios se ha convertido en una de las principales herramientas para estudiar el sistema nervioso in vitro. El objetivo final del uso de este sistema de modelos simplificado es proporcionar un microambiente controlado y mantener la alta tasa de supervivencia y las características naturales de las células neuronales y no neuronales disociadas tanto como sea posible en condiciones in vitro. En este artículo, demostramos un método de aislar las neuronas primarias del cerebelo del ratón en desarrollo, colocándolas en un entorno in vitro, estableciendo su crecimiento y monitoreando su viabilidad y diferenciación durante varias semanas. Este método es aplicable a las neuronas embrionarias disociadas del cerebelo entre los días embrionarios 12-18.

Introducción

Durante varias décadas, las líneas celulares se han utilizado ampliamente como una herramienta de alto rendimiento en estudios preclínicos e investigaciones biológicas. Coste-efectividad, crecimiento rápido, y la reducción del uso de animales vivos son algunos beneficios del uso de estas células. Sin embargo, las alteraciones genéticas y los cambios fenotípicos se acumulan después de varios pasajes in vitro¹. La identificación errónea de las líneas celulares y la disparidad genética de las células primarias pueden dar lugar a experimentos irreproducibles y conclusiones falsas^2,3,4,5. Por lo tanto, a pesar de algunas similitudes con las células diferenciadas como las neuronas (por ejemplo, neurotransmisores, canales iónicos, receptores y otras proteínas específicas de las neuronas), las líneas celulares neuronales no pueden replicar el fenotipo completo de las neuronas. El uso de neuronas maduras es otra opción; sin embargo, estas células son células postmitoticas no divisorias que son difíciles de propagar en el cultivo. Además, el reingreso en el ciclo celular puede precipitar la apoptosis^6.

El cultivo celular tridimensional (3D), los cultivos de rebanadas organotípicas y los cultivos organoides se han desarrollado para proporcionar un entorno en el que las células pueden organizarse en una forma 3D que imita el entorno in vivo. Por lo tanto, la comunicación de célula a célula, la migración, la invasión de células tumorales en los tejidos circundantes, y la angiogénesis se pueden estudiar⁷. Sin embargo, los costos adicionales de usar proteínas de matriz celular adicional (ECM) o hidrogeles sintéticos como ropa de cama, dificultad en la toma de imágenes y compatibilidad con instrumentos de cribado de alto rendimiento son inconvenientes considerables del cultivo de células 3D. Una desventaja importante del cultivo de rebanadas de tejido organotípico es el uso de un gran número de animales y los efectos adversos de la axotomía, que conduce a la inaccesibilidad de las dianas y factores de crecimiento de los axones, y en consecuencia la muerte neuronal⁸.

Por lo tanto, un enfoque alternativo, que evita los problemas con las líneas celulares, la dificultad del crecimiento de las células maduras y la complejidad de los tejidos, es la maduración in vitro de células primarias inmaduras. Las células primarias se derivan directamente del tejido humano o animal y se disocian utilizando métodos enzimáticos y/o mecánicos^9. Los principios principales de aislamiento, sembrado y mantenimiento en el medio de cultivo son similares independientemente de la fuente de tejido. Sin embargo, los factores tróficos necesarios para promover la proliferación y la maduración son altamente específicos de las células^6.

Conocer la "fecha de nacimiento" de cada tipo de célula cerebelosa es un requisito previo para diseñar un experimento de cultivo primario. En general, las células purkinje (PC) y las neuronas de los núcleos cerebelosos (CN), nacen antes que las células más pequeñas, incluidas las interneuronas (por ejemplo, cesta, células estelares) y las células del gránulo. En ratones, los PC emergen entre el día embrionario (E)10–E13, mientras que las neuronas CN aproximadamente E9–E12¹⁰.

Otras neuronas cerebelosas nacen mucho más tarde. Por ejemplo, en ratones, la subpoblación Golgi de interneuronas se genera a partir de VZ a (E14-E18) y las interneuronas restantes (célulade cesta y células estelares) ubicadas en la capa molecular emergen de células progenitoras divisorias en la materia blanca entre los primeros postnatal (P)0–P7¹¹. Las células de gránulos se generan a partir de la zona germinal externa (EGZ), una zona germinal secundaria que se deriva del labio rombio rostral y pasa por la división terminal después del nacimiento. Pero antes de que sus precursores surjan del labio rombio de E13-E16, las células ya han migrado rostrally a lo largo de la superficie pia para hacer una capa delgada de células en la superficie dorsal del anlage de cerebelo. Las células macrogliales no neuronales como los astrocitos y los oligodendrocitos, que se originan en el neuroepitelio ventricular, nacen en E13.5-P0 y P0-P7 respectivamente^{11,12,13,14 ,15}. Microglia se derivan de las células mieloides mieloides primitivas de yema-sac entre E8–E10 y después de la invasión en el sistema nervioso central se pueden detectar en el cerebro del ratón por E9¹⁶.

El método presentado en este artículo se basa en el desarrollado originalmente por Furuya et al. y Tabata et al.^17,18, que fue optimizado para el cultivo primario de células Purkinje derivadas de Wistar rat cerebella. Ahora hemos adaptado este método y lo hemos modificado cuidadosamente para estudiar el crecimiento de las neuronas cerebelosas de ratón^19. A diferencia de nuestro nuevo protocolo, el medio de disección en frío es el principal tampón de lavado utilizado durante los pasos de disección y disociación antes de añadir el medio de sembrado en el protocolo¹⁷de Furuya. Este tampón carece de la nutrición, los factores de crecimiento y las hormonas (todo en el medio Eagle modificado de Dulbecco:mezcla de nutrientes F-12 [DMEM/F12]) que son necesarios para apoyar el crecimiento celular y la supervivencia durante los pasos antes mencionados. Además, sobre la base de nuestra amplia experiencia con cultivos cebelosos primarios murinos, hemos utilizado 500 s de medio de cultivo en cada pozo (en lugar de 1 mL) y aumentado la concentración de tri-yodotironina a 0,5 ng/ml, lo que mejora el crecimiento de las células neuronales, en particular aquellos con un fenotipo celular Purkinje, y promueve el crecimiento de las ramas dendríticas en el cultivo. El método principal que aparece en este artículo se puede aplicar ampliamente a otros pequeños roedores (por ejemplo, ardillas y hámsters) durante el desarrollo embrionario y puede utilizarse para estudiar la neurogénesis cerebelosa y la diferenciación en las diversas etapas embrionarias, que difieren entre especies.

Protocolo

Todos los procedimientos de animales se realizaron de acuerdo con las regulaciones institucionales y la Guía para el Cuidado y Uso de Animales Experimentales del Consejo Canadiense para el Cuidado de Animales y ha sido aprobado por las autoridades locales ("el Bannatyne Campus Animal Care Comité"). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el número y el sufrimiento de los animales utilizados. La profundidad adecuada de la anestesia se confirmó observando que no hubo ningún cambio en la frecuencia respiratoria asociada con la manipulación y pellizcar los dedos del dedo del dedo del dedo del tiempo o el reflejo corneal.

1. Preparación

NOTA: Programar la provisión de ratones embarazadas cronometradas, basada en el plan de investigación, para E12–E18 post-concepción. La elección de la sincronización depende de las características de celda deseadas (ver más abajo). Prepare los resbalones y las placas de la cubierta al menos 2 días antes del experimento. La poli-L-ornitina se utiliza como material de recubrimiento para mejorar la fijación celular a los resbalones de la cubierta.

1. Recubrir la cubierta se desliza 2 días antes del aislamiento celular.
   1. Coloque los resbalones de la cubierta redonda en una placa de 24 pocillos, en condiciones estériles en un gabinete de bioseguridad. Deje un hueco entre cada resbalón de la cubierta para evitar cualquier contaminación.
   2. Añadir 90 l de poli-l-ornitina (PLO, 500 g/ml) al centro de cada resbalón de la cubierta. Cierre la tapa y coloque suavemente la placa en una incubadora de CO₂ de 37oC/5% durante 2 días.
      NOTA: Un mayor volumen puede derramarse los resbalones de la cubierta durante la incubación. El resbalón de la cubierta no necesita ser completamente cubierto con PLO después de colocar una gota. Durante la incubación durante la noche, la OLP se distribuye por igual al borde de los resbalones de la cubierta.
2. Un día antes del aislamiento celular, preparar el medio de cultivo I (DMEM/F-12 que contiene putrescina 100 m, selenita sódica 30 nM, L-glutamina 3,9 mM, gentamicina 3,5 g/mL, tridotironina (T3) 0,5 ng/ml, y suplementos de N3 [progésima 4M, insulina 20g/mL, transferrina 20 mg/ml]) y medio de sembrado (medio de cultivo I [sin N3 y T3] que contenga un 10% de suero bovino fetal [FBS]) y guárdelos en 4oC. Preparar la solución de trabajo de tripsina (0,25%) en DMEM/F12 y mantenerlo a 4oC.
   NOTA: Las composiciones medianas se proporcionan en el Cuadro 1.
3. El día del aislamiento celular, coloque el cultivo medio I y el medio de sembración en la incubadora a 37oC.
   NOTA: Antes de iniciar el aislamiento del cerebelo, asegúrese de que todas las herramientas y superficies de trabajo estén estériles.
4. Lave los resbalones de la cubierta.
   1. Saque la placa de 24 pozos de la incubadora.
   2. Lave los resbalones de la cubierta en la placa de 24 pocillos 3x con agua destilada doble (DDW) en un gabinete de bioseguridad en condiciones estériles. Cada vez que la cubierta se resbale empape en DDW durante 5 minutos antes de iniciar la aspiración.
   3. Deje los resbalones de la cubierta en un armario de bioseguridad durante al menos 2 h para secarpor por completo.

2. Colección cerebelo

1. Preparar tres platos Petri de plástico estéril de 10 cm llenos de solución salina con 1fosfato helado (PBS), 3 platos petri llenos de solución salina equilibrada de Hank 1x en frío y aproximadamente 5 platos de Petri llenos de medio de disección helada (1x HBSS) que contiene gentamicina 10 g/ml). Mantenlos en hielo.
2. Anestetizar el ratón embarazada E18 CD1 con 40% de isoflurano. Realice la luxación cervical en el ratón. Esterilice el abdomen con un 70% de solución de etanol.
3. Usa un par de tijeras para hacer una incisión cutánea desde la sínfisis púbica hasta el proceso de xifoidea. Luego sostenga la piel con fórceps y abra la cavidad abdominal.
4. Excise los cuernos uterinos con fórceps y lávalos 3 veces en el frío helado 1x PBS sobre hielo.
   NOTA: Los siguientes pasos deben llevarse a cabo en hielo para minimizar la tasa metabólica y prevenir el daño de tejidos y células.

3. Disecting the cerebellum

1. Después del último paso de lavado, el uso de un par de fórceps finos separa los embriones del útero en 1x HBSS y transfiéralos al medio de disección helada. En el medio de disección, decapitar los embriones con tijeras. Coloque el tejido en un medio de disección limpio.
   NOTA: El uso de un estereomicroscopio para microdisección es opcional.
2. Sostenga el cráneo con fórceps finos y corte a través del calvario con un par de tijeras pequeñas desde el aspecto lateral del cráneo en una línea desde el foramen magnum hasta el borde acústico externo y inferior de la cavidad orbital.
   NOTA: Tomar este paso expone la cavidad craneal a nivel de la base del cráneo y facilita la extirpación del cerebro.
3. Usando un par de fórceps finos, extrae la base del cráneo y despega el cráneo del cerebro.
4. Retire cuidadosamente las meninges en el cerebelo, comenzando desde la superficie lateral del pedúnculo y pons cerebelosos medios.
5. Cortar ambos pedúnculos cerebelosos y separar el cerebelo del resto del cerebro (Figura 1).
6. Colocar inmediatamente la cerebelosa recogida en un tubo cónico estéril de 15 ml lleno de 14 ml de DMEM/F12 sobre hielo.
7. Centrifugar el tubo a 1.000 x g,4oC durante 1 min, 3x. Cada vez retire suavemente el sobrenadante con una pipeta y vuelva a suspender el pellet en DMEM/F12 fresco y helado.
   NOTA: Para evitar la pérdida de las muestras, utilice la succión del gabinete lo menos posible.

4. Disociación del cerebelo

1. Añadir 2 ml de trippsina precalentada (37 oC) al pellet del paso 3.7 y pipetear suavemente para una mezcla adecuada.
2. Colocar el tubo en un baño de agua de 37oC durante 12 minutos.
3. Después de la incubación, llevar el tubo a un gabinete de bioseguridad y añadir 10 ml de DMEM/F12 para inactivar la trippsina.
4. Centrifugar la mezcla a 1.200 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en DMEM/F12 fresco. Repita 3x.
5. Premoje un pipeta de transferencia de plástico estéril con DMEM/F12.
6. Después del lavado y la centrifugación final, añadir 3,5 ml de solución de trabajo DNase (1 ml de solución de stock DNase I [0,05% DNase + 12 mM MgSO₄ + 1x HBSS] en 500 ml de FBS inactivado por calor y 2 ml de DMEM/F12) al pellet en el mismo tubo.
7. Triturar el tejido con un pipeta de al menos 30 veces hasta que la mezcla alcance un color lechoso homogéneo.

5. Colección de células

1. Añadir 10 ml de DMEM/F12 helado a la mezcla.
2. Centrifugar la muestra a 1.200 x g,4 oC durante 5 min.
3. Retire con cuidado el sobrenadante sin molestar el pellet.
4. Retire el medio de semilla de la incubadora.
5. Añadir 500 l de medio de semilla precalentado al pellet y mezclarlo muy bien usando un pipeta para resuspender las células.
6. Cuente las células usando un hemocaquímetro.
7. Diluir la suspensión celular con el medio de sembración a una densidad de 5 x 10⁵ células/ml.
8. Debajo de un armario de bioseguridad, agregue 90 ml de la mezcla diluida a cada pocto en el centro del resbalón de la cubierta.
   NOTA: No cargue las partículas que no se suspendieron en el DNase.
9. Colocar la placa en la incubadora a 37oC durante 3x4 h.
10. Después de la incubación, añadir 500 l de medio de cultivo precalentado I a cada poca y volver a colocar la placa en la incubadora (37 oC).

6. Tratamiento de las células recuperadas

1. Después de 7 días, sustituya el medio antiguo por un medio de cultivo fresco II (medio de cultivo que complementé con aleósido de citosina [Ara-C, 4 m] y albúmina sérica bovina de 100 g/ml [BSA]; véase el cuadro 1).
   NOTA: Este paso es fundamental para evitar el crecimiento de células no neuronales.
2. Supervise el medio de cultivo una vez al día. Si el pH cambia (indicado por un marcado cambio de color, generalmente más amarillento), retire la mitad (casi 250 ol) del medio antiguo de todos los pozos y agregue 300 s de medio de cultivo precalentado I a cada uno de ellos para evitar la pérdida de nutrientes.
   NOTA: El rojo fenol en el medio de cultivo es un buen indicador del pH del medio y la actividad de las células. Trate de minimizar el tiempo de exposición de las células a las condiciones de incubadora. Esto evita cualquier estrés que pueda afectar a su viabilidad.

7. Recogida y fijación de celdas

NOTA: Dependiendo del diseño experimental, las células se pueden recoger en cualquier día, en cualquier momento.

1. Preparar una placa separada de 24 pocillos con la organización numérica correspondiente y añadir 100 s de 4% de paraformaldehído (PFA) a cada pocal.
2. Para cosechar las células en los días deseados (dependiendo del protocolo experimental), retire suavemente los resbalones de la cubierta de los pocillos de la placa de cultivo original y colóquelas en los pocillos correspondientes de la placa llena de PFA.
3. Añadir PFA a los pozos para sumergir completamente los resbalones de la cubierta.
   NOTA: Para evitar el desprendimiento de la celda del resbalón de la cubierta, no agregue el PFA directamente en el resbalón de la cubierta.
4. Mantenga la placa PFA a 4oC durante 30 o 120 min.
5. Después de la incubación, restaure la placa a temperatura ambiente.
6. Lave suavemente los resbalones de la cubierta 3 veces durante 5 min con 1PBS.
7. Proceda al proceso de inmunomancha.
   NOTA: En este estudio, se utilizó un microscopio de fluorescencia equipado con una cámara para capturar las imágenes y ensamblado en montajes utilizando una aplicación de software de edición de imágenes.

Resultados

Basados en las diferentes fechas de nacimiento de los subtipos neuronales en el cerebelo, los cultivos de embriones de ratón E12-E18 produjeron diferentes tipos de células. Las neuronas de proyección grandes, como las neuronas CN (E9-E12) y los PC (E10-E13), surgieron temprano durante el desarrollo cerebeloso. En ratones, las células de gránulos y Golgi surgieron entre el E13-E18 y se sometieron a divisiones terminales hasta la semana postnatal 4.

La sustitución del medio viejo I por el ...

Discusión

El uso de cultivos primarios es un método bien conocido aplicable a todos los tipos de neuronas^17,18,19. En el protocolo presentado, explicamos cómo aislar las neuronas cerebelosas y mantener su viabilidad con una supervivencia óptima in vitro durante un máximo de 3 semanas. El cultivo primario de células cerebelosas, que fueron aisladas en E15-E18, confirma la recolección de tres clases de neuronas grandes: PCs, células ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adobe Photoshop CS5 Version 12	Adobe Inc
Anti-Sodium Channel (SCN)PN4 (Nav1.6)	Sigma	S0438	3 μg/mL
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	A3608
CALB1	Swant Swiss Antibodies (Polyclonal)	CB38	1/5000 dilution
CALB1	Swant Swiss Antibodies (Monoclonal)	300	1/1000 dilution
Cytosine β-D-arabinofuranoside or Cytosine Arabinoside (Ara-C)	Millipore Sigma	C1768
DNase I from bovine pancreas	Roche	11284932001
Dressing Forceps	Delasco	DF-45
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM-F12)	Lonza	12-719F
Fisherbrand Cover Glasses: Circles	fisher scientific	12-545-81
Gentamicin	Gibco	15710-064
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14185-052
Insulin from bovine pancreas	Millipore sigma	I5500, I6634, I1882, and I4011
Large Scissor	Stoelting	52134-38
L-glutamine	Gibco	25030-081
Metallized Hemacytometer	Hausser Bright-Line	3100
Microdissection Forceps	Merlan	624734
Pattern 5 Tweezer	Dixon	291-9454
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher BioReagents	BP399-26
Poly-L-Ornithine	Millipore Sigma	P4638
Progesteron (P4)	Millipore sigma	P8783
PVALB	Swant Swiss Antibodies	235	1/1500 dilution
Samll Scissor	WPI Swiss Scissors, 9cm	504519
Sodium Selenite	Millipore Sigma	S9133
Transferrin	Millipore Sigma	T8158
Tri-iodothyronine (T3)	Millipore Sigma	T2877
Trypsin	Gibco	15090-046
Zeiss Fluorescence microscope	Zeiss	Z2 Imager