从胚胎小鼠小脑分离的神经元的主要培养

摘要

进行体外实验以尽可能充分地反映体内状况并非易事。使用原发细胞培养物是了解整个生物体中细胞生物学的重要一步。提供的协议概述了如何成功生长和培养胚胎小鼠小脑神经元。

摘要

使用原发性细胞培养物已成为研究体外神经系统的主要工具之一。使用这种简化的模型系统的最终目标是提供受控的微环境，并在体外条件下尽可能保持分离神经元和非神经元细胞的高存活率和自然特征。在本文中，我们演示了一种将原神经元与发育中的小鼠小脑分离的方法，将它们置于体外环境中，确定其生长，并监测其生存能力和分化数周。该方法适用于胚胎间12-18之间与小脑分离的胚胎神经元。

引言

几十年来，细胞系在临床前研究和生物学研究中被广泛用作高通量工具。成本效益高、生长快和减少活体动物使用是使用这些细胞的一些好处。然而，基因改变和现象变化积累后，在体外几次^通道1。细胞系的误认和原发细胞的遗传差异会导致不可重复的实验和错误的结论2，3，4，5。因此，尽管与分化的细胞（如神经元（如神经递质、电道、受体和其他神经元特异性蛋白质）有一些相似之处，但神经元细胞系无法复制神经元的全部表型。使用成熟的神经元是另一种选择;然而，这些细胞是非分裂的后密细胞，很难在培养中繁殖。此外，重新进入细胞周期可能沉淀凋^亡6。

三维 （3D） 细胞培养、组织切片培养和有机体培养物培养已经开发出来，以提供一个环境，使细胞可以排列成模仿体内环境的 3D 形式。因此，可以研究细胞与细胞的沟通、迁移、肿瘤细胞侵入周围组织以及血管^生成。然而，使用额外的细胞基质（ECM）蛋白质或合成水凝胶作为床上用品的额外费用、成像难度以及与高通量筛选仪器的兼容性是3D细胞培养的相当缺点。器官组织切片培养的一个主要缺点是使用大量的动物和斧头的不良影响，这导致无法获取轴xons的目标和生长因子，从而导致神经元^死亡8。

因此，另一种避免细胞系问题、成熟细胞生长困难和组织复杂性的另一种方法是未成熟的原细胞在体外成熟。原细胞直接来自人类或动物组织，并使用酶和/或机械方法^分离9。无论组织来源如何，培养培养基中分离、播种和维护的主要原理都相似。然而，促进增殖和成熟所必需的营养因子是高度细胞特^异性6。

了解每个小脑细胞类型的"出生日期"是设计初级培养实验的先决条件。一般来说，Purkinje细胞（PC）和小脑细胞核（CN）的神经元在较小的细胞之前出生，包括内神经元（如篮子、硬质细胞）和颗粒细胞。在小鼠中，PC 在胚胎日 （E）10_E13 之间出现，而 CN 神经元在大约 E9_E12¹⁰之间出现。

其他小脑神经元的出生时间要晚得多。例如，在小鼠中，内神经元的Golgi亚群由VZ在（+E14+E18）生成，分子层中剩余的内神经元（篮子细胞和硬质细胞）从早期白质中的祖细胞分裂出来产后 （P）0=P7¹¹.颗粒细胞产生于外部生殖区（EGZ），这是一个从红斑唇衍生的次生菌区，出生后通过终端分裂。但是，在它们的前体从E13_E16的菱形唇出现之前，细胞已经沿着pia表面沿皮面沿波拉迁移，在小脑的背表面产生一层薄薄的细胞。非神经性巨胶质细胞，如星形细胞和寡核苷酸细胞，起源于心室神经皮皮，分别诞生于E13.5+P0和P0+P7，分别为11、12、13、14 ^{， 15}.微胶质来自E8+E10之间的蛋黄囊原始骨髓祖细胞，入侵中枢神经系统后可以通过E9¹⁶在小鼠大脑中检测到。

本文介绍的方法基于Furuya等人和Tabata等人最初开发^{的方法，即17、18，}该方法针对从威斯塔大鼠Cerebella衍生的Purkinje细胞进行初级培养进行了优化。我们现在已经适应了这种方法，并仔细修改了它，以研究小鼠小脑神经元^{的生长19。}与新协议不同，冷解剖介质是在Furuya^协议17中添加播种介质之前，在解剖和分离步骤中使用的主要洗涤缓冲液。此缓冲液缺乏营养、生长因子和激素（所有在 Dulbecco 的改良 Eagle 介质中:营养混合物 F-12 [DMEM/F12]）是支持上述步骤中细胞生长和存活所必需的。此外，根据我们对鼠原小脑培养的丰富经验，我们在每个井中使用了500μL的培养基（而不是1 mL），并将三碘氨酸浓度提高到0.5纳克/mL，从而改善神经元细胞的生长。尤其是那些具有Purkinje细胞表型，并促进培养中树突状分支的生长。本文介绍的主要方法可广泛应用于胚胎发育过程中的其他小啮齿动物（如松鼠和仓鼠），并可用于研究不同胚胎阶段的小啮齿动物神经发生和分化，不同物种。

研究方案

所有动物程序均按照机构条例和加拿大动物护理理事会的《实验动物护理和使用指南》进行，并已获得地方当局的批准（"班纳特恩校园动物护理"）委员会"）。已作出一切努力，尽量减少使用的动物的数量和痛苦。观察操作和脚趾捏或角膜反射相关的呼吸速率没有变化，从而证实了麻醉的充分深度。

1. 准备

注:根据研究计划，为受孕后E12_E18安排有时位怀孕小鼠。时间选择取决于所需的细胞特性（见下文）。在实验前至少 2 天准备盖玻片和板。Poly-L-ornithine 用作涂层材料，以增强细胞与盖玻片的附着性。

1. 在细胞分离前2天涂抹盖子。
   1. 将圆形盖滑片放在 24 孔板中，在无菌条件下放入生物安全柜中。在每个盖滑之间留出间隙，以避免任何污染。
   2. 在每个盖滑道的中心添加 90 μL 的聚L-硝化物（PLO，500 μg/mL）。合盖，轻轻将板放入 37°C/5% CO₂培养箱中 2 天。
      注:在孵育过程中，体积越大，盖玻片可能会溢出。放置跌落后，盖玻片不需要完全覆盖 PLO。在隔夜孵育期间，PLO均匀地分布到盖滑的边缘。
2. 在细胞分离前一天，制备培养基I（DMEM/F-12含有putrescine 100 μM，塞莱内特钠30 nM，L-谷氨酰胺3.9 mM，gentamicin 3.5 μg/mL，三碘氨酸（T3） 0.5纳克/mL，和N3补充剂 [孕酮 4 μM， 胰岛素 20 μg/mL，转移素 20 mg/mL]） 和播种介质 （培养基 I [不含 N3 和 T3] 含有 10% 胎儿牛血清 [FBS]）， 并将其储存在 4°C.准备胰蛋白酶工作溶液 （0.25%）在 DMEM/F12 中，并将其保持在 4°C。
   注:中型组合物在表 1中提供。
3. 在细胞分离当天，将培养基I和种子培养基置于37°C的培养箱中。
   注:在开始小脑隔离之前，请确保所有工具和工作表面均无菌。
4. 清洗盖滑。
   1. 从培养箱中拿出24个孔板。
   2. 在无菌条件下，用双蒸馏水 （DDW） 在生物安全柜中清洗 24 孔板 3x 中的盖玻片。每次让盖滑浸泡在 DDW 中 5 分钟，然后开始吸入。
   3. 将盖滑放在生物安全柜中至少 2 小时以完全干燥。

2. 小脑集合

1. 准备三个 10 厘米无菌塑料培养皿，里面装满了冰冷的 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS），3 个培养皿，里面装满了冰冷的 1x 汉克平衡盐溶液 （HBSS），以及大约 5 个装满冰冷解剖介质的培养皿（1x HBSS含有温特霉质 10 μg/mL）。把它们放在冰上
2. 用40%的异常胶麻醉E18 CD1怀孕小鼠。对鼠标执行宫颈脱位。用70%乙醇溶液对腹部进行消毒。
3. 用一把剪刀做皮肤切口从符号到西香过程。然后用钳子抓住皮肤，打开腹腔。
4. 用钳子切除子宫角，在冰冷的1x PBS中洗3次。
   注:以下步骤应在冰上进行，以尽量减少代谢率，防止组织和细胞损伤。

3. 切除小脑

1. 在最后一次洗涤步骤后，使用一对细钳在1x HBSS中分离胚胎从子宫中分离出来，并将其转移到冰冷的解剖介质。在解剖介质中，用剪刀将胚胎斩首。将组织置于干净的解剖介质中。
   注:使用立体显微镜进行微解剖是可选的。
2. 用细钳抓住头骨，用一把小剪刀从头骨的横向用一把小剪刀穿过头骨，从前臂面到轨道腔的外部声学肉和下边界。
   注:采取此步骤会暴露颅底水平的颅腔，使大脑更容易切除。
3. 使用一对细钳子，取出头骨底座，将头骨从大脑剥离。
4. 小心地去除小脑上的脑细度，从中间小脑的侧表面和小马。
5. 切下两个小脑，将小脑从大脑的其他部分分开（图1）。
6. 立即将收集的陶瓷放入无菌的 15 mL 锥形管中，管内装有 14 mL 的 DMEM/F12 在冰上。
7. 在1，000 x g，4°C下离心管1分钟，3倍。 每次用移液器轻轻去除上清液，并在新鲜、冰冷的 DMEM/F12 中重新悬浮颗粒。
   注:为避免丢失样品，请尽量少使用机柜吸气。

4. 小脑分离

1. 从步骤 3.7 向颗粒中加入 2 mL 的预预热 （37 °C） 胰蛋白酶，然后轻轻移液，以进行充分混合。
2. 将管子放入 37°C 水浴中 12 分钟。
3. 孵育后，将管子带到生物安全柜中，加入10 mL的DMEM/F12，使胰蛋白酶灭活。
4. 将混合物在1，200 x g下离心5分钟，丢弃上清液，在新鲜的DMEM/F12中重新悬浮颗粒。重复 3 次。
5. 使用 DMEM/F12 预湿无菌塑料转移移液器。
6. 洗涤和最终离心后，在同一管中的500μL热灭活FBS和2 mL的DMEM/F12中加入3.5 mL的DNase工作溶液（1 mL的DNase I库存溶液[0.05%DNase = 12 mM MgSO₄ + 1x HBSS]。
7. 用移液至少30倍的移液对组织进行三聚，直到混合物达到均匀的乳色。

5. 细胞集合

1. 在混合物中加入 10 mL 的冷冷 DMEM/F12。
2. 将样品在1，200 x g，4°C下离心5分钟。
3. 小心地去除上清液，不要干扰颗粒。
4. 从培养箱中取出播种介质。
5. 将500 μL的预温播种介质加入颗粒中，并使用移液重新悬浮细胞进行很好的混合。
6. 使用血细胞计对细胞进行计数。
7. 用播种培养基将细胞悬浮液稀释到5 x 10⁵细胞/mL的密度。
8. 在生物安全柜下，将 90 μL 的稀释混合物添加到盖滑中心的每口井中。
   注:请勿加载未悬浮在 DNase 中的颗粒。
9. 将板置于 37°C 的培养箱中，等待 3⁄4 小时。
10. 孵育后，将500μL的预加热培养基I加入每个孔中，并将板放回培养箱（37°C）。

6. 恢复细胞的治疗

1. 7天后，用新鲜的培养基II替换旧介质（培养基用青霉素[Ara-C，4[M]和100μg/mL牛血清白蛋白[BSA]补充培养基;见表1）。
   注:此步骤对于避免非神经元细胞的生长至关重要。
2. 每天监控一次培养媒介。如果pH值发生变化（由颜色明显变化，通常更黄），从所有井中取出一半（近250μL）的旧介质，并在每口井中加入300μL的预温培养基I，以避免营养损失。
   注:培养基中的苯红是该介质的pH和细胞活性的良好指标。尽量缩短细胞在孵化器条件下的接触时间。这可以防止任何可能影响其生存能力的压力。

7. 细胞收集和固定

注:根据实验设计，细胞可以在任何时间点的任何一天收集。

1. 用相应的数值组织准备单独的24孔板，并在每口井中加入100μL的4%的甲醛（PFA）。
2. 要在所需日期（取决于实验协议）收获细胞，请轻轻地从原始培养板的孔中取出盖滑，并将其放入 PFA 填充板的相应孔中。
3. 将 PFA 添加到井中，以完全浸入盖玻片中。
   注:为避免单元脱离盖玻片，请勿直接在盖玻上添加 PFA。
4. 将 PFA 板保持在 4°C 30~120 分钟。
5. 孵育后，将板恢复到室温。
6. 用 1x PBS 轻轻清洗盖滑 3 倍 5 分钟。
7. 继续免疫染色过程。
   注:在这项研究中，使用装有照相机的荧光显微镜来捕捉图像，并使用图像编辑软件应用程序组装成蒙太奇。

结果

根据小脑神经元亚型的不同出生日期，E12-E18小鼠胚胎的培养物产生了不同的细胞类型。大型投影神经元，如CN神经元（E9+E12）和PC（E10+E13），在小脑发育过程中早期出现。在小鼠中，颗粒和Golgi细胞在[E13]E18之间出现，并经历了端子分裂，一长达4周。

在体外（DIV）7天用新鲜培养基II取代旧的培养基I，最终将防止胶质细胞增殖。分子层的内神经元，如篮子和硬质细胞，在出生?...

讨论

使用初级培养物是一种众所周知的方法，适用于所有类型的神经元17，18，19。在提出的协议中，我们解释如何分离小脑神经元，并保持其生存能力与最佳生存在体外最多3周。在E15+E18中分离的小脑细胞的主要培养，证实了三类大神经元的集合:PC、Golgi细胞和CN。在^{培养19、21}的21天内，?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adobe Photoshop CS5 Version 12	Adobe Inc
Anti-Sodium Channel (SCN)PN4 (Nav1.6)	Sigma	S0438	3 μg/mL
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	A3608
CALB1	Swant Swiss Antibodies (Polyclonal)	CB38	1/5000 dilution
CALB1	Swant Swiss Antibodies (Monoclonal)	300	1/1000 dilution
Cytosine β-D-arabinofuranoside or Cytosine Arabinoside (Ara-C)	Millipore Sigma	C1768
DNase I from bovine pancreas	Roche	11284932001
Dressing Forceps	Delasco	DF-45
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM-F12)	Lonza	12-719F
Fisherbrand Cover Glasses: Circles	fisher scientific	12-545-81
Gentamicin	Gibco	15710-064
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14185-052
Insulin from bovine pancreas	Millipore sigma	I5500, I6634, I1882, and I4011
Large Scissor	Stoelting	52134-38
L-glutamine	Gibco	25030-081
Metallized Hemacytometer	Hausser Bright-Line	3100
Microdissection Forceps	Merlan	624734
Pattern 5 Tweezer	Dixon	291-9454
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher BioReagents	BP399-26
Poly-L-Ornithine	Millipore Sigma	P4638
Progesteron (P4)	Millipore sigma	P8783
PVALB	Swant Swiss Antibodies	235	1/1500 dilution
Samll Scissor	WPI Swiss Scissors, 9cm	504519
Sodium Selenite	Millipore Sigma	S9133
Transferrin	Millipore Sigma	T8158
Tri-iodothyronine (T3)	Millipore Sigma	T2877
Trypsin	Gibco	15090-046
Zeiss Fluorescence microscope	Zeiss	Z2 Imager