Primäre Kultur der Neuronen isoliert von Embryonal Mouse Cerebellum

Zusammenfassung

Die Durchführung von In-vitro-Experimenten, um in vivo-Bedingungen so angemessen wie möglich zu reflektieren, ist keine leichte Aufgabe. Die Verwendung von primären Zellkulturen ist ein wichtiger Schritt zum Verständnis der Zellbiologie in einem ganzen Organismus. Das bereitgestellte Protokoll beschreibt, wie man erfolgreich wachsen und Kultur embryonale Maus Kleinhirn Neuronen.

Zusammenfassung

Die Verwendung von primären Zellkulturen ist zu einem der wichtigsten Instrumente geworden, um das Nervensystem in vitro zu untersuchen. Das ultimative Ziel dieses vereinfachten Modellsystems ist es, eine kontrollierte Mikroumgebung zu schaffen und die hohe Überlebensrate und die natürlichen Merkmale dissoziierter neuronaler und nicht neuronaler Zellen so weit wie möglich unter In-vitro-Bedingungen aufrechtzuerhalten. In diesem Artikel zeigen wir eine Methode, primär Neuronen vom sich entwickelnden Maus-Kleinhirn zu isolieren, sie in eine In-vitro-Umgebung zu stellen, ihr Wachstum zu etablieren und ihre Lebensfähigkeit und Differenzierung für mehrere Wochen zu überwachen. Diese Methode gilt für embryonale Neuronen, die zwischen den embryonalen Tagen 12–18 vom Kleinhirn getrennt sind.

Einleitung

Seit mehreren Jahrzehnten werden Zelllinien als Werkzeug mit hohem Durchsatz in präklinischen Studien und biologischer Forschung eingesetzt. Kostenwirksamkeit, schnelles Wachstum und Reduzierung des Einsatzes lebender Tiere sind einige Vorteile der Verwendung dieser Zellen. Jedoch, genetische Veränderungen und phänotypische Veränderungen akkumulieren nach mehreren Passagen in vitro¹. Die falsche Identifizierung von Zelllinien und genetische Unähnlichkeit enden von Primärzellen können zu nicht reproduzierbaren Experimenten und falschen Schlussfolgerungen^2,3,4,5führen. Daher können neuronale Zelllinien trotz einiger Ähnlichkeiten mit differenzierten Zellen wie Neuronen (z. B. Neurotransmitter, Ionenkanäle, Rezeptoren und andere neuronspezifische Proteine) nicht den vollständigen Phänotyp von Neuronen replizieren. Die Verwendung von reifen Neuronen ist eine weitere Option; Diese Zellen sind jedoch nicht dividierende postmitotische Zellen, die in der Kultur nur schwer zu verbreiten sind. Darüber hinaus kann der Wiedereintritt in den Zellzyklus apoptosis⁶ausbrechen.

Dreidimensionale (3D) Zellkultur, organotypische Scheibenkulturen und organoide Kulturen wurden entwickelt, um eine Umgebung zu schaffen, in der Zellen sich in eine 3D-Form anordnen können, die die in vivo-Einstellung imitiert. So können Zell-zu-Zell-Kommunikation, Migration, Invasion von Tumorzellen in umliegende Gewebe und Angiogenese untersucht werden⁷. Zusätzliche Kosten für die Verwendung von Extra-Zellmatrix-Proteinen (ECM) oder synthetischen Hydrogelen als Einstreu, Schwierigkeiten bei der Bildgebung und Kompatibilität mit Hochdurchsatz-Screening-Instrumenten sind jedoch erhebliche Nachteile der 3D-Zellkultivierung. Ein großer Nachteil der organotypischen Gewebescheibenkultur ist die Verwendung einer großen Anzahl von Tieren und die negativen Auswirkungen der Axotomie, die zu unzugänglichkeit von Zielen und Wachstumsfaktoren für Axone führt, und folglich neuronalen Tod⁸.

Daher ist ein alternativer Ansatz, der die Probleme mit Zelllinien, die Schwierigkeit des Wachsens reifer Zellen und die Komplexität von Geweben vermeidet, die In-vitro-Reifung unreifer Primärzellen. Primärzellen werden direkt aus menschlichem oder tierischem Gewebe abgeleitet und mit enzymatischen und/oder mechanischen Methoden dissoziiert⁹. Die Hauptprinzipien der Isolierung, Aussaat und Wartung im Kulturmedium sind unabhängig von der Gewebequelle ähnlich. Die trophischen Faktoren, die zur Förderung der Proliferation und Reifung notwendig sind, sind jedoch hochzellspezifisch⁶.

Das Wissen um das Geburtsdatum jedes Kleinhirnzelltyps ist eine Voraussetzung für die Gestaltung eines primären Kulturexperiments. Im Allgemeinen werden Purkinje-Zellen (PCs) und die Neuronen der Kleinhirnkerne (CN) vor den kleineren Zellen geboren, einschließlich Interneuronen (z. B. Korb, stellate Zellen) und Granulatzellen. Bei Mäusen entstehen PCs zwischen dem embryonalen Tag (E)10–E13, während CN-Neuronen bei etwa E9–E12¹⁰liegen.

Andere Kleinhirn-Neuronen werden viel später geboren. Bei Mäusen wird z. B. die Golgi-Subpopulation von Interneuronen aus VZ bei (E14-E18) erzeugt, und die verbleibenden Interneuronen (Korbzellen und stellate Zellen), die sich in der molekularen Schicht befinden, entstehen aus der Teilung von Vorläuferzellen in der weißen Materie zwischen postnatal (P)0–P7¹¹. Granulatzellen werden aus der äußeren Keimzone (EGZ) erzeugt, einer sekundären Keimzone, die aus der rostralen Rhombenlippe abgeleitet wird und nach der Geburt durch terminale Teilung geht. Doch bevor ihre Vorläufer aus der rhomben Lippe von E13–E16 entstehen, sind die Zellen bereits rostral entlang der Pia-Oberfläche gewandert, um eine dünne Zellschicht auf der dorsalen Oberfläche der Kleinhirnanlage zu bilden. Nichtneuronale makrogliale Zellen wie Astrozyten und Oligodendrozyten, die aus dem ventrikulären Neuroepithel stammen, werden bei E13,5-P0 bzw. P0-P7 bzw.^{11,12,13,14 ,15}. Mikroglia werden von eigelb-sac primitiven myeloischen Vorläuferzellen zwischen E8–E10 abgeleitet und nach einer Invasion in das zentrale Nervensystem kann im Mausgehirn von E9¹⁶nachgewiesen werden.

Die in diesem Artikel vorgestellte Methode basiert auf der Methode, die ursprünglich von Furuya et al. und Tabata et al.^17,18entwickelt wurde und für die primäre Kultivierung von Purkinje-Zellen optimiert wurde, die von Wistar rat cerebella abgeleitet wurden. Wir haben diese Methode nun angepasst und sorgfältig modifiziert, um das Wachstum von Maus-Kleinhirnneuronen zu untersuchen¹⁹. Anders als in unserem neuen Protokoll ist das Kaltstungsmedium der Hauptwaschpuffer, der bei Sezier- und Dissoziationsschritten verwendet wird, bevor im Furuya-Protokoll¹⁷das Saatmedium hinzugefügt wird. Dieser Puffer fehlt die Ernährung, Wachstumsfaktoren, und Hormone (alle in Dulbecco modifiziert Eagle Medium: Nährstoffmischung F-12 [DMEM/F12]), die notwendig sind, um Zellwachstum und Überleben während der oben genannten Schritte zu unterstützen. Darüber hinaus haben wir auf der Grundlage unserer langjährigen Erfahrung mit murinen primären Kleinhirnkulturen in jedem Brunnen 500 l Kulturmedium (anstelle von 1 ml) verwendet und die Triiodothyroninkonzentration auf 0,5 ng/ml erhöht, was das Wachstum neuronaler Zellen in insbesondere solche mit einem Purkinje-Zell-Phänotyp, und fördert das Wachstum der dendritischen Zweige in der Kultur. Die in diesem Artikel vorgestellte Hauptmethode kann während der embryonalen Entwicklung weitgehend auf andere kleine Nagetiere (z. B. Eichhörnchen und Hamster) angewendet werden und kann zur Untersuchung der Kleinhirnneurogenese und -differenzierung in den verschiedenen embryonalen Stadien verwendet werden, die von Art zu Art unterschiedlich sind.

Protokoll

Alle tierischen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen Vorschriften und dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren vom Canadian Council for Animal Care durchgeführt und wurden von den lokalen Behörden genehmigt ("der Bannatyne Campus Animal Care) Ausschuss"). Alle Anstrengungen wurden unternommen, um die Anzahl und das Leiden der verwendeten Tiere zu minimieren. Angemessene Tiefe der Anästhesie wurde durch die Beobachtung bestätigt, dass es keine Änderung der Atemfrequenz im Zusammenhang mit Manipulation und Zehenkneifen oder Hornhautreflex.

1. Vorbereitung

HINWEIS: Planen Sie die Bereitstellung von zeitabhängigen trächtigen Mäusen auf der Grundlage des Forschungsplans für E12–E18 nach der Empfängnis. Die Wahl des Timings hängt von den gewünschten Zellmerkmalen ab (siehe unten). Bereiten Sie die Abdeckscheine und Platten mindestens 2 Tage vor dem Experiment vor. Poly-L-Ornithin wird als Beschichtungsmaterial verwendet, um die Zellbefestigung an den Abdeckscheinen zu verbessern.

1. Mantel Sie die Abdeckung rutscht 2 Tage vor der Zellisolierung.
   1. Legen Sie die runden Deckelschlupf in eine 24-Well-Platte, unter sterilen Bedingungen in einem Biosicherheitsschrank. Lassen Sie eine Lücke zwischen jedem Deckelschlupf, um eine Kontamination zu vermeiden.
   2. Fügen Sie in der Mitte jedes Bezugsschlupfes 90 l Poly-L-Ornithin (PLO, 500 g/ml) hinzu. Schließen Sie die Kappe und legen Sie die Platte vorsichtig in einem 37 °C/5% CO2-Inkubator für 2 Tage.
      HINWEIS: Ein größeres Volumen kann während der Inkubation die Deckelschlüpfe verschütten. Der Deckbeleg muss nach dem Platzieren eines Tropfens nicht vollständig mit PLO abgedeckt werden. Während der nächtlichen Inkubation verteilt plo gleichmäßig auf den Rand der Deckelschlipse.
2. Einen Tag vor der Zellisolierung das Kulturmedium I (DMEM/F-12 mit Putresin 100 M, Natriumselenit 30 nM, L-Glutamin 3,9 mM, Gentamicin 3,5 g/mL, Triiodothyronin (T3) 0,5 ng/ml und N3-Ergänzungen [Progesteron 4 Transferrin 20 mg/ml]) und Saatmedium (Kulturmedium I [ohne N3 und T3] mit 10% fetalem Rinderserum [FBS]) und in 4 °C lagern. Vorbereiten der Trypsin-Arbeitslösung (0,25%) DMEM/F12 und bei 4 °C aufbewahren.
   ANMERKUNG: Die mittleren Zusammensetzungen sind in Tabelle 1aufgeführt.
3. Am Tag der Zellisolierung Kulturmedium I und Saatmedium bei 37 °C in den Inkubator stellen.
   HINWEIS: Stellen Sie vor dem Starten der Kleinhirnisolierung sicher, dass alle Werkzeuge und Arbeitsflächen steril sind.
4. Waschdeckelrutscht.
   1. Nehmen Sie die 24 Well-Platte aus dem Inkubator.
   2. Waschen Sie die Deckelschlupfinins in der 24 Wellplatte 3x mit doppelt destilliertem Wasser (DDW) in einem Biosicherheitsschrank unter sterilen Bedingungen. Jedes Mal lassen Sie die Abdeckung rutscht in DDW für 5 min vor dem Start Aspiration einweichen.
   3. Lassen Sie die Deckelschlupf in einem Biosicherheitsschrank für mindestens 2 h vollständig trocknen.

2. Cerebellum-Sammlung

1. Bereiten Sie drei 10 cm sterile Kunststoff Petrischalen mit eiskalten 1x Phosphat-gepufferten Kochsalzlösung (PBS), 3 Petrischalen gefüllt mit eiskalten 1x Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS) und ca. 5 Petrischalen mit eiskaltem Seziermedium (1x HBSS) zu. Mit Gentamicin 10 g/ml). Halten Sie sie auf Eis.
2. Anästhetisieren Sie die E18 CD1 trächtige Maus mit 40% Isofluran. Führen Sie zervikale Dislokation auf der Maus aus. Sterilisieren Sie den Bauch mit 70% Ethanollösung.
3. Verwenden Sie eine Schere, um einen Hautschnitt von der Schamsymphyse zum xiphoiden Prozess zu machen. Dann halten Sie die Haut mit Zange und öffnen Sie die Bauchhöhle.
4. Die Uterushörner mit Zangen befallen und 3x in der eiskalten 1x PBS auf Eis waschen.
   HINWEIS: Die folgenden Schritte sollten alle auf Eis durchgeführt werden, um die Stoffwechselrate zu minimieren und Gewebe- und Zellschäden zu verhindern.

3. Zerlegen des Kleinhirns

1. Nach dem letzten Waschschritt trennen sie die Embryonen mit einem Paar feiner Zangen in 1x HBSS von der Gebärmutter und übertragen sie in das eiskalte Dissektionsmedium. Enthaupten Sie die Embryonen im Sektionsmedium mit einer Schere. Legen Sie das Gewebe in ein sauberes Seziermedium.
   HINWEIS: Die Verwendung eines Stereomikroskops für die Mikrodissektion ist optional.
2. Halten Sie den Schädel mit feiner Zange und schneiden Sie das Calvarium mit einer kleinen Schere vom seitlichen Aspekt des Schädels in einer Linie vom Foramen magnum bis zum äußeren akustischen Fleisch usund der unteren Grenze der Orbitalhöhle durch.
   HINWEIS: Dieser Schritt setzt die Schädelhöhle auf der Ebene der Schädelbasis frei und macht es einfacher, das Gehirn zu entfernen.
3. Entfernen Sie mit einem Paar feiner Zangen die Schädelbasis und schälen Sie den Schädel vom Gehirn weg.
4. Entfernen Sie vorsichtig die Meningen auf dem Kleinhirn, beginnend von der seitlichen Oberfläche des mittleren Kleinhirn-Pedonkels und Pons.
5. Schneiden Sie beide Kleinhirn-Pedunkels und trennen Sie das Kleinhirn vom Rest des Gehirns (Abbildung 1).
6. Die gesammelte Kleinhirn sofort in ein steriles 15 ml kegelförmiges Rohr geben, gefüllt mit 14 ml DMEM/F12, auf Eis.
7. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 1.000 x g, 4 °C für 1 min, 3x. Entfernen Sie den Überstand jedes Mal vorsichtig mit einer Pipette und setzen Sie das Pellet in frischem, eiskaltem DMEM/F12 wieder auf.
   HINWEIS: Um den Verlust der Proben zu vermeiden, verwenden Sie die Schrankabsaugung so wenig wie möglich.

4. Cerebellum-Dissoziation

1. 2 ml vorgewärmtes (37 °C) Trypsin ab Schritt 3.7 in das Pellet geben und vorsichtig pipet für eine ausreichende Mischung.
2. Legen Sie das Rohr in ein 37 °C Wasserbad für 12 min.
3. Nach der Inkubation die Röhre in einen Biosicherheitsschrank bringen und 10 ml DMEM/F12 hinzufügen, um das Trypsin zu inaktivieren.
4. Zentrifugieren Sie die Mischung bei 1.200 x g für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in frischem DMEM/F12 wieder auf. Wiederholen Sie 3x.
5. Vorbefeuchten einer sterilen Kunststoff-Transferpipette mit DMEM/F12.
6. Nach dem Waschen und der abschließenden Zentrifugation 3,5 ml DNase-Arbeitslösung (1 ml DNase I-Lagerlösung [0,05% DNase + 12 mM MgSO₄ + 1x HBSS] in 500 l wärmeinaktiviertem FBS und 2 ml DMEM/F12) in das Pellet im selben Rohr geben.
7. Trituieren Sie das Gewebe mit einer Pipte mindestens 30x, bis die Mischung eine homogene milchige Farbe erreicht.

5. Zellsammlung

1. 10 ml eiskaltes DMEM/F12 in die Mischung geben.
2. Zentrifugieren Sie die Probe bei 1.200 x g, 4 °C für 5 min.
3. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig, ohne das Pellet zu stören.
4. Entfernen Sie das Saatmedium aus dem Inkubator.
5. Fügen Sie dem Pellet 500 l vorgewärmte Saatmedium hinzu und mischen Sie es sehr gut mit einer Pipette, um die Zellen wieder auszusetzen.
6. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
7. Verdünnen Sie die Zellsuspension mit dem Saatmedium auf eine Dichte von 5 x 10⁵ Zellen/ml.
8. Fügen Sie unter einem Biosicherheitsschrank 90 l des verdünnten Gemisches zu jedem Brunnen in der Mitte des Deckschlupfs hinzu.
   HINWEIS: Laden Sie nicht die Partikel, die nicht in der DNase hängen.
9. Legen Sie die Platte bei 37 °C bei 37 °C für 3 x 4 h.
10. Nach der Inkubation 500 l vorgewärmtes Kulturmedium I zu jedem Brunnen hinzufügen und die Platte wieder in den Inkubator (37 °C) legen.

6. Behandlung der zurückgewonnenen Zellen

1. Ersetzen Sie nach 7 Tagen das alte Medium durch das frische Kulturmedium II (Kulturmedium I ergänzt durch Cytosin-Arabinosid [Ara-C, 4 'M] und 100 'g/ml Rinderserumalbumin [BSA]; siehe Tabelle 1).
   HINWEIS: Dieser Schritt ist entscheidend, um das Wachstum von nichtneuronalen Zellen zu vermeiden.
2. Überwachen Sie das Kulturmedium einmal täglich. Wenn sich der pH-Wert ändert (angezeigt durch eine deutliche Farbänderung, in der Regel gelber), entfernen Sie die Hälfte (fast 250 L) des alten Mediums aus allen Brunnen und fügen Sie jedem von ihnen 300 l vorgewärmte Kulturmedium I hinzu, um Nährstoffverlust zu vermeiden.
   HINWEIS: Phenol rot im Kulturmedium ist ein guter Indikator für den pH-Wert des Mediums und die Aktivität der Zellen. Versuchen Sie, die Belichtungszeit der Zellen zu den Bedingungen des Inkubators zu minimieren. Dies verhindert jeglichen Stress, der ihre Lebensfähigkeit beeinträchtigen könnte.

7. Zellsammlung und Fixierung

HINWEIS: Je nach versuchsweisem Design können die Zellen zu jedem Tag und zu jedem Zeitpunkt gesammelt werden.

1. Bereiten Sie eine separate 24 Well-Platte mit der entsprechenden numerischen Organisation vor und fügen Sie jedem Brunnen 100 l mit 4% Paraformaldehyd (PFA) hinzu.
2. Um Zellen an den gewünschten Tagen (je nach Versuchsprotokoll) zu ernten, entfernen Sie vorsichtig die Abdeckschlupfer aus den Brunnen der ursprünglichen Kulturplatte und legen Sie sie in die entsprechenden Brunnen der PFA-gefüllten Platte.
3. Fügen Sie PFA zu den Brunnen hinzu, um die Deckschlips vollständig einzutauchen.
   HINWEIS: Um eine Zellablösung vom Abdeckschlupf zu vermeiden, fügen Sie den PFA nicht direkt auf den Abdeckungsbeleg ein.
4. Halten Sie die PFA-Platte bei 4 °C für 30 bis 120 min.
5. Stellen Sie die Platte nach der Inkubation auf Raumtemperatur wieder her.
6. Waschen Sie die Deckelschlüpfer 3x für 5 min mit 1x PBS.
7. Fahren Sie mit dem Immunstaining-Prozess fort.
   HINWEIS: In dieser Studie wurde ein Fluoreszenzmikroskop mit einer Kamera verwendet, um die Bilder zu erfassen und mit einer Bildbearbeitungssoftware-Anwendung zu Montagen zusammenzubauen.

Ergebnisse

Basierend auf den unterschiedlichen Geburtsdaten neuronaler Subtypen im Kleinhirn ergaben Kulturen aus E12-E18-Mausembryonen unterschiedliche Zelltypen. Große Projektionsneuronen, wie ZN-Neuronen (E9-E12) und PCs (E10-E13), entstanden früh während der Kleinhirnentwicklung. Bei Mäusen entstanden Granulat- und Golgi-Zellen zwischen E13–E18 und wurden bis zur postnatalen Woche 4 terminal gespalten.

Das Ersetzen des alten Mediums I durch frisches Kulturmedium II an Tagen in vitro (DIV) 7 wir...

Diskussion

Die Verwendung von Primärkulturen ist eine bekannte Methode, die für alle Arten von Neuronen^17,18,19anwendbar ist. Im vorgestellten Protokoll erklären wir, wie man Kleinhirnneuronen isoliert und ihre Lebensfähigkeit mit optimalem Überleben in vitro für maximal 3 Wochen aufrechterhält. Die Primärkultur von Kleinhirnzellen, die bei E15-E18 isoliert wurden, bestätigt die Sammlung von drei Klassen großer Neuronen: PCs, Gol...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adobe Photoshop CS5 Version 12	Adobe Inc
Anti-Sodium Channel (SCN)PN4 (Nav1.6)	Sigma	S0438	3 μg/mL
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	A3608
CALB1	Swant Swiss Antibodies (Polyclonal)	CB38	1/5000 dilution
CALB1	Swant Swiss Antibodies (Monoclonal)	300	1/1000 dilution
Cytosine β-D-arabinofuranoside or Cytosine Arabinoside (Ara-C)	Millipore Sigma	C1768
DNase I from bovine pancreas	Roche	11284932001
Dressing Forceps	Delasco	DF-45
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM-F12)	Lonza	12-719F
Fisherbrand Cover Glasses: Circles	fisher scientific	12-545-81
Gentamicin	Gibco	15710-064
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14185-052
Insulin from bovine pancreas	Millipore sigma	I5500, I6634, I1882, and I4011
Large Scissor	Stoelting	52134-38
L-glutamine	Gibco	25030-081
Metallized Hemacytometer	Hausser Bright-Line	3100
Microdissection Forceps	Merlan	624734
Pattern 5 Tweezer	Dixon	291-9454
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher BioReagents	BP399-26
Poly-L-Ornithine	Millipore Sigma	P4638
Progesteron (P4)	Millipore sigma	P8783
PVALB	Swant Swiss Antibodies	235	1/1500 dilution
Samll Scissor	WPI Swiss Scissors, 9cm	504519
Sodium Selenite	Millipore Sigma	S9133
Transferrin	Millipore Sigma	T8158
Tri-iodothyronine (T3)	Millipore Sigma	T2877
Trypsin	Gibco	15090-046
Zeiss Fluorescence microscope	Zeiss	Z2 Imager