Culture primaire des neurones isolés du cervelet de souris embryonnaire

Résumé

Mener des expériences in vitro pour refléter les conditions in vivo aussi adéquatement que possible n'est pas une tâche facile. L'utilisation des cultures cellulaires primaires est une étape importante vers la compréhension de la biologie cellulaire dans un organisme entier. Le protocole fourni décrit comment se développer avec succès et cultiver les neurones cérévelaires embryonnaires de souris.

Résumé

L'utilisation des cultures cellulaires primaires est devenue l'un des principaux outils d'étude du système nerveux in vitro. L'objectif ultime de l'utilisation de ce système modèle simplifié est de fournir un microenvironnement contrôlé et de maintenir le taux de survie élevé et les caractéristiques naturelles des cellules neuronales et non neuronales dissociées autant que possible dans des conditions in vitro. Dans cet article, nous démontrons une méthode d'isoler les neurones primaires du cervelet de souris en développement, les plaçant dans un environnement in vitro, établissant leur croissance, et de surveiller leur viabilité et différenciation pendant plusieurs semaines. Cette méthode s'applique aux neurones embryonnaires dissociés du cervelet entre les jours embryonnaires 12-18.

Introduction

Pendant plusieurs décennies, les lignées cellulaires ont été largement utilisées comme un outil à haut débit dans les études précliniques et la recherche biologique. La rentabilité, la croissance rapide et la réduction de l'utilisation des animaux vivants sont quelques avantages de l'utilisation de ces cellules. Cependant, les altérations génétiques et les changements phénotypiques s'accumulent après plusieurs passages in vitro¹. Une mauvaise identification des lignées cellulaires et la dissemblance génétique des cellules primaires peuvent conduire à des expériences irréproductibles et à de fausses conclusions^2,3,4,5. Par conséquent, en dépit de certaines similitudes avec les cellules différenciées telles que les neurones (par exemple, les neurotransmetteurs, les canaux ioniques, les récepteurs et d'autres protéines spécifiques aux neurones), les lignées cellulaires neuronales ne peuvent pas reproduire le phénotype complet des neurones. L'utilisation de neurones matures est une autre option; cependant, ces cellules sont des cellules postmitotic non-divisant qui sont difficiles à propager dans la culture. En outre, la rentrée dans le cycle cellulaire peut précipiter l'apoptose⁶.

La culture cellulaire tridimensionnelle (3D), les cultures de tranches organotypiques et les cultures organoïdes ont été développées pour fournir un environnement dans lequel les cellules peuvent s'arranger en une forme 3D qui imite le cadre in vivo. Ainsi, la communication de cellule à cellule, la migration, l'invasion des cellules tumorales dans les tissus environnants, et l'angiogenèse peuvent être étudiées⁷. Cependant, les coûts supplémentaires liés à l'utilisation de protéines de matrice cellulaire supplémentaire (ECM) ou d'hydrogels synthétiques comme literie, difficulté à l'imagerie et compatibilité avec les instruments de criblage à haut débit sont des inconvénients considérables de la culture des cellules 3D. Un inconvénient majeur de la culture de tranches de tissu organotypic est l'utilisation d'un grand nombre d'animaux et les effets néfastes de l'axotomie, qui conduit à l'inaccessibilité des cibles et des facteurs de croissance pour les axones, et par conséquent la mort neuronale⁸.

Par conséquent, une approche alternative, qui évite les problèmes avec les lignées cellulaires, la difficulté de cultiver des cellules matures, et la complexité des tissus, est la maturation in vitro des cellules primaires immatures. Les cellules primaires sont dérivées directement de tissus humains ou animaux et dissociées à l'aide de méthodes enzymatiques et/ou mécaniques⁹. Les principes principaux de l'isolement, de l'ensemencement, et de l'entretien dans le milieu de culture sont semblables indépendamment de la source de tissu. Cependant, les facteurs trophiques nécessaires pour favoriser la prolifération et la maturation sont très spécifiques aux cellules⁶.

Connaître la « date de naissance » de chaque type de cellule cérétylée est une condition préalable à la conception d'une expérience de culture primaire. En général, les cellules Purkinje (PC) et les neurones des noyaux cérécoés (CN) naissent avant les cellules plus petites, y compris les interneurones (p. ex. panier, cellules stellates) et les cellules granules. Chez la souris, les PC émergent entre le jour embryonnaire (E)10-E13, tandis que les neurones du CN à environ E9-E12¹⁰.

D'autres neurones cérétoraux naissent beaucoup plus tard. Par exemple, chez la souris, la sous-population golgi d'interneurones est générée à partir de La ZV à l'e14-E18 et les interneurones restants (cellules de panier et cellules stellates) situés dans la couche moléculaire émergent de la division des cellules progénitrices dans la matière blanche entre les premiers postnatal (P)0-P7¹¹. Les cellules granules sont générées à partir de la zone germinale externe (EGZ), une zone germinale secondaire qui est dérivée de la lèvre rhombique rostrale et passe par la division terminale après la naissance. Mais avant que leurs précurseurs ne proviennent de la lèvre rhombique de l'E13-E16, les cellules ont déjà migré vers le rostale le long de la surface de la pia pour faire une mince couche de cellules sur la surface dorsale de l'anlage du cervelet. Les cellules macrogliales non neuronales telles que les astrocytes et les oligodendrocytes, qui proviennent du neuroepithelium ventriculaire, naissent respectivement à E13.5-P0 et P0-P7^{11,12,13,14 ,15}. Les microglies sont dérivées de cellules progénitrices myéloïdes primitives jaune-sac entre E8-E10 et après l'invasion dans le système nerveux central peut être détectée dans le cerveau de la souris par E9¹⁶.

La méthode présentée dans cet article est basée sur celle développée à l'origine par Furuya et coll. et Tabata et al.^17,18, qui a été optimisée pour la culture primaire des cellules de Purkinje dérivées du cervelèle de rat Wistar. Nous avons maintenant adapté cette méthode et soigneusement modifié pour étudier la croissance des neurones céréveleux souris¹⁹. Contrairement à notre nouveau protocole, le milieu de dissection à froid est le tampon de lavage principal utilisé pendant les étapes de dissection et de dissociation avant d'ajouter le milieu d'ensemencement dans le protocole¹⁷de Furuya. Ce tampon n'a pas la nutrition, les facteurs de croissance et les hormones (tous dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco : mélange nutritif F-12 [DMEM/F12]) qui sont nécessaires pour soutenir la croissance et la survie des cellules pendant les étapes susmentionnées. En outre, sur la base de notre vaste expérience avec les cultures cérévelaires primaires murines, nous avons utilisé 500 L de milieu de culture dans chaque puits (au lieu de 1 ml) et augmenté la concentration de tri-iodothyronine à 0,5 ng/mL, ce qui améliore la croissance des cellules neuronales, en en particulier ceux avec un phénotype de cellules de Purkinje, et favorise la croissance des branches dendritiques dans la culture. La méthode principale décrite dans cet article peut être largement appliquée à d'autres petits rongeurs (par exemple, les écureuils et les hamsters) pendant le développement embryonnaire et peut être employée pour étudier la neurogenèse et la différenciation de cervelateur dans les divers stades embryonnaires, qui diffèrent d'une espèce à l'autre.

Protocole

Toutes les procédures relatives aux animaux ont été exécutées conformément aux règlements institutionnels et au Guide de soins et d'utilisation des animaux expérimentaux du Conseil canadien pour les soins aux animaux et ont été approuvés par les autorités locales (« le Bannatyne Campus Animal Care Comité »). Tous les efforts ont été faits pour minimiser le nombre et la souffrance des animaux utilisés. La profondeur adéquate de l'anesthésie a été confirmée en observant qu'il n'y avait aucun changement dans le taux respiratoire lié à la manipulation et au pincement d'orteil ou au réflexe cornéen.

1. Préparation

REMARQUE : Planifier la mise à disposition de souris enceintes chronométrées, selon le plan de recherche, pour l'E12-E18 post-conception. Le choix du moment dépend des caractéristiques cellulaires souhaitées (voir ci-dessous). Préparer les bordereaux et les plaques de couverture au moins 2 jours avant l'expérience. Poly-L-ornithine est utilisé comme matériau de revêtement pour améliorer l'attachement cellulaire aux bordereaux de couverture.

1. Enrober les feuillets de couverture 2 jours avant l'isolement cellulaire.
   1. Placer les bordereaux ronds dans une plaque de 24 puits, dans des conditions stériles dans une armoire de biosécurité. Laissez un espace entre chaque feuillet de couverture pour éviter toute contamination.
   2. Ajouter 90 l de poly-L-ornithine (PLO, 500 g/mL) au centre de chaque feuillet de couverture. Fermer le bouchon et placer délicatement la plaque dans un incubateur de CO₂ de 37 oC/5 % pendant 2 jours.
      REMARQUE : Un plus grand volume peut se déverser des feuillets de couverture pendant l'incubation. Le bordereau de couverture n'a pas besoin d'être complètement recouvert d'OLP après avoir placé une goutte. Pendant l'incubation de nuit, l'OLP distribue également au bord des feuillets de couverture.
2. Un jour avant l'isolement cellulaire, préparez le milieu de culture I (DMEM/F-12 contenant de la putréscine 100 M, sélénite de sodium 30 nM, L-glutamine 3,9 mM, gentamicin 3,5 g/mL, tri-iodothyronine (T3) 0,5 ng/mL, et suppléments N3 [progestérone 4 M, insuline 20 g/mL, transfert de 20 mg/mL) et milieu d'ensemencement (milieu de culture I [sans N3 et T3] contenant 10 % de sérum bovin fœtal [FBS]) et les entreposez dans 4 oC. Préparer la solution de travail trypsine (0,25%) dans DMEM/F12 et le garder à 4 oC.
   REMARQUE : Les compositions moyennes sont fournies dans le tableau 1.
3. Le jour de l'isolement cellulaire, placez le milieu de culture I et le milieu d'ensemencement dans l'incubateur à 37 oC.
   REMARQUE : Avant de commencer l'isolement du cervelet, assurez-vous que tous les outils et surfaces de travail sont stériles.
4. Laver les bordereaux de couverture.
   1. Sortez la plaque de 24 puits de l'incubateur.
   2. Laver les couvercles dans la plaque de 24 puits 3x avec de l'eau distillée double (DDW) dans un coffret de biosécurité dans des conditions stériles. Chaque fois laisser les glissades de couverture tremper dans DDW pendant 5 min avant de commencer l'aspiration.
   3. Laisser sécher complètement les bordereaux de couvercle dans une armoire de biosécurité pendant au moins 2 h.

2. Collection Cerebellum

1. Préparer trois boîtes Petri en plastique stériles de 10 cm remplies de saline à phosphate (PBS) à froid 1x phosphate, 3 boîtes Petri remplies de solution de sel équilibrée de 1x Hank(HBSS) glacées et environ 5 boîtes Petri remplies de milieu de déssection glace (1x HBSS) contenant de la gentamicine 10 g/mL). Gardez-les sur la glace.
2. Anesthésiez la souris enceinte E18 CD1 avec 40% d'isoflurane. Effectuer une luxation cervicale sur la souris. Stériliser l'abdomen avec une solution d'éthanol à 70%.
3. Utilisez une paire de ciseaux pour faire une incision de la peau de la symphyse pubienne au processus xiphoïde. Puis maintenez la peau avec des forceps et ouvrez la cavité abdominale.
4. Accise les cornes utérines avec des forceps et lavez-les 3x dans le 1x PBS glacé sur la glace.
   REMARQUE : Les étapes suivantes doivent toutes être effectuées sur la glace afin de minimiser le taux métabolique et de prévenir les lésions tissulaires et cellulaires.

3. Disséquer le cervelet

1. Après la dernière étape de lavage, l'utilisation d'une paire de forceps fins sépare les embryons de l'utérus dans 1x HBSS et les transfèreau au milieu de dissection glace-froid. Dans le milieu de dissection, décapiter les embryons avec des ciseaux. Placer le tissu dans un milieu de dissection propre.
   REMARQUE : L'utilisation d'un stéréomicroscope pour la microdissection est facultative.
2. Tenez le crâne avec des forceps fins et coupez à travers le calvarium avec une paire de petits ciseaux de l'aspect latéral du crâne dans une ligne du magnum de foramen au meatus acoustique externe et à la bordure inférieure de la cavité orbitale.
   REMARQUE: Prendre cette étape expose la cavité crânienne au niveau de la base du crâne et il est plus facile d'enlever le cerveau.
3. À l'aide d'une paire de forceps fins, retirez la base du crâne et épluchez le crâne du cerveau.
4. Retirez soigneusement les méninges sur le cervelet, en commençant par la surface latérale du pédoncule et des pons cérérebellaires moyens.
5. Couper les deux pédoncules cérévelaires et séparer le cervelet du reste du cerveau (Figure 1).
6. Placez immédiatement le cérécola recueilli dans un tube conique stérile de 15 ml rempli de 14 ml de DMEM/F12 sur la glace.
7. Centrifuger le tube à 1 000 x g, 4 oC pour 1 min, 3x. Chaque fois, retirez délicatement le supernatant à l'effile tte et suspendez la pastille dans du DMEM/F12 frais et glacé.
   REMARQUE : Pour éviter de perdre les échantillons, utilisez l'aspiration de l'armoire le moins possible.

4. Dissociation de Cerebellum

1. Ajouter 2 ml de trypsine préchauffée (37 oC) à la pastille à partir de l'étape 3.7 et délicatement pipet pour un mélange adéquat.
2. Placer le tube dans un bain d'eau de 37 oC pendant 12 min.
3. Après l'incubation, apportez le tube dans une armoire de biosécurité et ajoutez 10 ml de DMEM/F12 pour inactiver la trypsine.
4. Centrifuger le mélange à 1 200 x g pendant 5 min. Jeter le supernatant et resuspendre la pastille dans le DMEM/F12 frais. Répéter 3x.
5. Préwet un tuyau de transfert en plastique stérile avec DMEM/F12.
6. Après le lavage et la centrifugation finale, ajouter 3,5 mL de solution de travail DNase (1 mL de solution de stock DNase I [0,05% DNase - 12 mM MgSO₄ - 1x HBSS] dans 500 'L de FBS inactivé par la chaleur et 2 mL de DMEM/F12) à la pastille dans le même tube.
7. Triturate le tissu avec un pipet au moins 30x jusqu'à ce que le mélange atteigne une couleur laiteuse homogène.

5. Collection de cellules

1. Ajouter 10 ml de DMEM/F12 glacé au mélange.
2. Centrifuger l'échantillon à 1 200 x g, 4 oC pendant 5 min.
3. Retirez soigneusement le supernatant sans déranger la pastille.
4. Retirer le milieu d'ensemencement de l'incubateur.
5. Ajouter 500 l de milieu d'ensemencement préchauffé au granule et mélanger très bien à l'aide d'une tuyauterie pour resuspendre les cellules.
6. Comptez les cellules à l'aide d'un hémocytomètre.
7. Diluer la suspension cellulaire avec le milieu d'ensemencement à une densité de 5 x 10⁵ cellules/mL.
8. Sous une armoire de biosécurité, ajouter 90 l de mélange dilué à chaque puits au centre de la feuille de couverture.
   REMARQUE : Ne chargez pas les particules qui n'ont pas été suspendues dans la DNase.
9. Placer la plaque dans l'incubateur à 37 oC pendant 3 à 4 h.
10. Après l'incubation, ajouter 500 l de milieu de culture préchauffé i à chaque puits et remettre la plaque dans l'incubateur (37 oC).

6. Traitement des cellules récupérées

1. Après 7 jours, remplacez l'ancien médium par une culture fraîche ii (moyen de culture I complété par cytosine arabinoside [Ara-C, 4 M] et 100 'g/mL albumin de sérum bovin [BSA]; voir tableau 1).
   REMARQUE : Cette étape est critique pour éviter la croissance des cellules non neuronales.
2. Surveillez le milieu de la culture une fois par jour. Si le pH change (indiqué par un changement marqué de couleur, généralement plus jaune), retirez la moitié (près de 250 l) de l'ancien milieu de tous les puits et ajoutez 300 L de milieu de culture préchauffée I à chacun d'eux pour éviter la perte d'éléments nutritifs.
   REMARQUE : Le rouge phénol dans le milieu de culture est un bon indicateur du pH du milieu et de l'activité des cellules. Essayez de minimiser le temps d'exposition des cellules à des conditions d'incubateur. Cela prévient tout stress qui pourrait affecter leur viabilité.

7. Collecte et fixation de cellules

REMARQUE : Selon la conception expérimentale, les cellules peuvent être collectées à n'importe quel jour, à n'importe quel moment.

1. Préparer une plaque de 24 puits séparée avec l'organisation numérique correspondante et ajouter 100 L de paraformaldéhyde (PFA) à chaque puits.
2. Pour récolter les cellules les jours désirés (selon le protocole expérimental), retirez délicatement les bordereaux de couverture des puits de la plaque de culture d'origine et placez-les dans les puits correspondants de la plaque remplie de PFA.
3. Ajouter pfA aux puits pour immerger complètement les bordereaux de couverture.
   REMARQUE : Pour éviter le détachement cellulaire de la feuille de couverture, n'ajoutez pas le PFA directement sur le bordereau de couverture.
4. Conserver la plaque PFA à 4 oC pendant 30 à 120 min.
5. Après l'incubation, remettre la plaque à température ambiante.
6. Laver délicatement les bordereaux de couverture 3x pendant 5 min avec 1x PBS.
7. Passez au processus d'immunostaining.
   REMARQUE : Dans cette étude, un microscope à fluorescence équipé d'une caméra a été utilisé pour capturer les images et assemblé en montages à l'aide d'une application logicielle d'édition d'images.

Résultats

Sur la base des différentes dates de naissance des sous-types neuronaux dans le cervelet, les cultures des embryons de souris E12-E18 ont donné différents types de cellules. Les grands neurones de projection, tels que les neurones du CN (E9-E12) et les PC (E10-E13), sont apparus tôt pendant le développement du cérétherle. Chez la souris, les cellules granule et Golgi ont surgi entre l'E13-E18 et ont subi des divisions terminales jusqu'à la semaine postnatale 4.

Remplacer le vieux milie...

Discussion

L'utilisation des cultures primaires est une méthode bien connue applicable à tous les types de neurones^17,18,19. Dans le protocole présenté, nous expliquons comment isoler les neurones cérévelaires et maintenir leur viabilité avec une survie optimale in vitro pendant un maximum de 3 semaines. La culture primaire des cellules cérévelaires, qui ont été isolées à E15-E18, confirme la collecte de trois classes de grand...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adobe Photoshop CS5 Version 12	Adobe Inc
Anti-Sodium Channel (SCN)PN4 (Nav1.6)	Sigma	S0438	3 μg/mL
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	A3608
CALB1	Swant Swiss Antibodies (Polyclonal)	CB38	1/5000 dilution
CALB1	Swant Swiss Antibodies (Monoclonal)	300	1/1000 dilution
Cytosine β-D-arabinofuranoside or Cytosine Arabinoside (Ara-C)	Millipore Sigma	C1768
DNase I from bovine pancreas	Roche	11284932001
Dressing Forceps	Delasco	DF-45
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM-F12)	Lonza	12-719F
Fisherbrand Cover Glasses: Circles	fisher scientific	12-545-81
Gentamicin	Gibco	15710-064
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14185-052
Insulin from bovine pancreas	Millipore sigma	I5500, I6634, I1882, and I4011
Large Scissor	Stoelting	52134-38
L-glutamine	Gibco	25030-081
Metallized Hemacytometer	Hausser Bright-Line	3100
Microdissection Forceps	Merlan	624734
Pattern 5 Tweezer	Dixon	291-9454
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher BioReagents	BP399-26
Poly-L-Ornithine	Millipore Sigma	P4638
Progesteron (P4)	Millipore sigma	P8783
PVALB	Swant Swiss Antibodies	235	1/1500 dilution
Samll Scissor	WPI Swiss Scissors, 9cm	504519
Sodium Selenite	Millipore Sigma	S9133
Transferrin	Millipore Sigma	T8158
Tri-iodothyronine (T3)	Millipore Sigma	T2877
Trypsin	Gibco	15090-046
Zeiss Fluorescence microscope	Zeiss	Z2 Imager